Технология приготовления сухих питательных основ для производства биоспорина

В последние годы в РФ и ближнем зарубежье сложилась сложная экономическая ситуация, вызвавшая снижение жизненного уровня населения, и как следствие, ухудшение эпидемической обстановки. Наблюдается также нарастание неблагоприятных изменений в экологической сфере. Их следствием является увеличение числа инфекционных, аллергических и других заболеваний среди населения /35/.

В связи с вышесказанным профилактика и лечение инфекционных заболеваний и дисбактериозов в настоящее время и на ближайшую перспективу являются приоритетными задачами в медицинской и ветеринарной практике. Их решение возможно только при условии реализации комплекса соответствующих противоэпидемических, противоэпизотических, санитарно-гигиенических и других мероприятий, включая разработку, серийное производство и внедрение в практику новых высокоэффективных лечебно-профилактических препаратов, в том числе пробиотиков.

Одним из эффективных пробиотиков является биоспорин, выпускаемый Центром ВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ /106, 107/. За счет удачного сочетания в его составе свойств взаимодополняющих штаммов B. subtilis ВКПМ № 2335 (3) и B. licheniformis ВКПМ № 2336 (31) биоспорин обладает несомненными преимуществами перед другими пробиотиками, используемыми для профилактики и лечения ряда заболеваний человека и животных. Высокая антагонистическая активность по отношению к широкому кругу возбудителей острых кишечных инфекций (ОКИ), а также выраженность иммуномодули-рующего эффекта его действия позволяет с успехом применять биоспорин в качестве лечебно-профилактического средства в период роста заболеваний ОКИ в экологически, эпизоотологически и эпидемиологически неблагоприятных регионах.

Экспериментально доказано /1/, что стабильность культивирования споровых культур B. subtilis 3 и B. licheniformis 31 и свойств готового препарата в значительной степени зависят от стандартности питательных сред по биологическим и физико-химическим характеристикам. Возможность получения таких питательных сред определяется, прежде всего, стандартностью как используемого исходного сырья, так и технологией процесса их производства.

Одним из направлений решения данного вопроса является увеличение объема каждой серии выпускаемых жидких питательных основ с последующей их сушкой. Полученные таким образом ПО, кроме высокой стандартности, обладают продолжительным сроком годности и практически не меняют свои свойства в период гарантированного хранения.

Жидкие солянокислотные гидролизаты казеина и соевой муки, применяемые в настоящее время в технологии производства биоспорина в соответствии с регламентом производства /106, 107/, имеют существенные недостатки.

К основным из них относятся нестабильность исходных компонентов при длительном хранении и ограниченные сроки их использования, что является следствием неустойчивости органической системы, к которой относятся белковые гидролизаты и необходимость создания специальных условий хранения (температурный режим (4+2) °С, использование большого количества тары, наличие холодильных камер и расход консерванта).

Помимо вышеуказанных недостатков, отрицательными сторонами в технологии получения жидких гидролизатов казеина и соевой муки, используемых для приготовления нативных споровых культур, являются значительные трудности при фильтрации: плохая фильтруемость, большой расход фильтрующего материала и отсутствие стадии деионизации.

Данные обстоятельства требуют усовершенствования технологии получения гидролизатов казеина и соевой муки, последующее высушивание которых должно увеличить срок хранения ПО до 3−5 лет.

В настоящее время наиболее эффективным способом обезвоживания различных растворов, суспензий, эмульсий и паст является сушка распылением, получившая достаточно широкое применение в биотехнологии. Данный метод обезвоживания обладает рядом специфических особенностей и преимуществ перед другими существующими методами /12,45/.

За рубежом это направление давно уже оценено по достоинству. Работают крупные фирмы, производящие сухие среды разнообразного характера и применения. Однако перечень выпускаемых в нашей стране сухих сред невелик, что обусловлено отсутствием специального оборудования для сушки ПО и сред, а существующие технологии отличаются сложностью и многостадийно-стью.

Таким образом, актуальность работы обусловлена необходимостью получения гидролизатов с длительным сроком хранения необходимых для производства ПС со стабильными ростовыми характеристиками.

Целью научных исследований является разработка технологии получения и экспериментальное обоснование применения сухих питательных основ, используемых для приготовления ПС в производстве биоспорина.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие основные задачи:

1. Разработать технологию приготовления сухих гидролизатов казеина, соевой муки и мяса.

2. Провести комплексную оценку по физико-химическим и биологическим показателям сухих ПО.

3. Оценить воспроизводимость технологии получения сухих питательных основ, определить сроки их хранения.

4. Оценить возможность использования сухих питательных основ в производстве биоспорина.

5. Обосновать экономическую целесообразность внедрения разработанной технологии.

6. Разработать и утвердить нормативно-техническую документацию на производство и контроль питательных основ.

Научная новизна работы состоит в том, что:

— впервые в отечественной практике разработана технология получения сухого солянокислотного гидролизата соевой муки;

— сухие гидролизаты казеина, соевой муки и мяса крупного рогатого скота используются для производства биоспорина.

— затраты на производство и хранение сухих гидролизатов в 2,7 раза ниже по сравнению с жидкими гидролизатами.

Научная новизна подтверждена решением Государственного патентного ведомства о выдаче патента на &bdquo-Питательная среда для глубинного выращивания спор B. anthracis вакцинного штамма СТИ-1, B. licheniformis 31, B. subtilis 3 и способ приготовления 3%-го солянокислотного гидролизата соевой муки" /72/.

На защиту выносятся следующие основные научные положения и результаты:

— использование метода распылительного высушивания в кипящем слое гранул инертного материала обеспечивает получение сухих питательных основ с необходимой дисперсностью и влажностью, что позволяет исключить стадию измельчения конечного продукта и гарантированно хранить данные сухие препараты в течение 3 лет;

— B. subtilis 3 и B. licheniformis 31, входящие в состав готовой лекарственной формы препарата биоспорин обладают высокой антагонистической активностью по отношению к возбудителям острых кишечных инфекций.

— применение сухих питательных основ в технологии производства биоспорина позволяет получать готовые формы данного препарата с показателями качества, удовлетворяющими требования ФС.

Полученные результаты реализованы в следующих документах:

Инструкция по приготовлению и контролю качества ферментативного гидролизата говяжьего мяса сухого (Арх. ЦВТП БЗ. — Инв. № Д-608, 2001).

Инструкция по приготовлению и контролю качества солянокислотного гидролизата казеина сухого (Арх. ЦВТП БЗ. — Инв. № Д-609,2001).

Инструкция по приготовлению и контролю качества солянокислотного гидролизата соевой муки сухого (Арх. ЦВТП БЗ. — Инв. № Д-607, 2001).

Временные технические условия «Ферментативный гидролизат говяжьего мяса сухой» (Арх. ЦВТП БЗ. — Инв. № Д-602, 2001).

Временные технические условия «Солянокислотный гидролизат казеина сухой» (Арх. ЦВТП БЗ. — Инв. № Д-603,2001).

Временные технические условия «Кислотный гидролизат соевой муки сухой» (Арх. ЦВТП БЗ. — Инв. № Д-604,2001).

Экспериментально-производственный регламент «Сухая питательная основа из ферментативного гидролизата говяжьего мяса «(Арх. ЦВТП БЗ. — Инв. № Д-539, 2001).

Экспериментально-производственный регламент «Сухая питательная основа из солянокислотного гидролизата казеина» (Арх. ЦВТП БЗ. — Инв. № Д-541,2001).

Экспериментально-производственный регламент «Сухая питательная основа из кислотного гидролизата соевой муки» (Арх. ЦВТП БЗ. — Инв. № Д-536, 2001).

Изменения и дополнения к проекту экспериментально-производственного регламента «Биоспорин сухой» (Арх. ЦВТП БЗ. — Инв. № Д-542, 2001).

Автор лично участвовал в планировании и проведении экспериментов по оптимизации режимов обезвоживания питательных основ, изучению физико-химических свойств гидролизатов, разработке нормативной документации на приготовление и контроль сухих питательных основ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.3 Результаты исследований.

2.3.1 Разработка технологии получения сухих гидролизатов казеина, соевой муки и мяса методом распылительной сушки.

С целью разработки технологии получения сухих гидролизатов методом распылительного высушивания представлялось целесообразным изучить технологические свойства материалов как объектов сушки, выбрать способ и обосновать режимы их обезвоживания, при условии получения в конечной стадии качественных питательных сред, не уступающих по физико-химическим и биологическим показателям аналогичным средам на основе жидких гидролизатов.

2.3.1.1 Экспериментальное обоснование способа подготовки гидролизатов к сушке.

В соответствии с требованиями регламента на производство биоспорина ПС, используемые в его производстве, за исключением агаровых, должны быть прозрачными и не содержать нерастворимого осадка. В свою очередь прозрачность ПС находится в непосредственной зависимости от свойств ПО, идущих на их приготовление. В этой связи считалось целесообразным провести исследования по выбору и обоснованию способов осветления жидких гидролизатов, а следовательно, и подготовке их к сушке.

Качество белковых гидролизатов в значительной степени обусловливается выбранным способом проведения гидролиза и степенью последующей очистки получаемого гидролизата /58/.

В зависимости от вида использованных субстратов, ферментов, способа гидролиза и необходимой степени конверсии белка требуется более простая или более сложная очистка продуктов /55/.

Кислотный гидролиз относится к химическому способу переработки белкового сырья /32/. Проводят его, как правило, при нагреве до (120−130 °С) и избыточном давлении (0,2−0,3 МПа) 121. Чаще всего для проведения гидролиза данным способом используют серную или соляную кислоты различных концентраций /32/, в некоторых случаях применяют ортофосфорную, уксусную или смеси кислот. При этом продолжительность процесса варьирует от 1 до 6 часов /2/.

В случае кислотного гидролиза белковые гидролизаты наряду со свободными аминокислотами и пептидами содержат соли минеральных и органических кислот, амины, окрашенные смолообразные примеси (меланоидные компоненты) и другие остатки клеточных биополимеров и продуктов их деградации /57/.

Сопряженные ненасыщенные системы, сорбируясь на клеточной стенке микроорганизмов, вызывают окислительные процессы, приводящие к сокращению сроков хранения биомассы, особенно в высушенном состоянии.

Как правило, режим кислотного гидролиза выбирается с учетом необходимой степени расщепления белкового сырья и получаемых в его результате продуктов, во многих случаях специфичных для питания отдельных микроорганизмов. Соответственно полного гидролиза субстрата не происходит, а балластные белки, присутствующие в реакционной смеси, в отдельных случаях затрудняющие последующие процессы культивирования микроорганизмов и очистки вакцинных препаратов, подлежат удалению.

При кислотном гидролизе может происходить частичное или полное разрушение триптофана, а также других аминокислот: метионина, цистина, гистидина, лизина. Кроме того, происходит образование значительного количества аммиака и карбонильных соединений /59/.

Известно, что невозможность использования кислотных гидролизатов для выращивания какой-либо культуры микроорганизмов бывает обусловлена, в основном, наличием в них токсических примесей. Так, хроматографическим и электрофоретическим методами установлен химический состав некоторых побочных продуктов кислотного расщепления белков (метилглиоксаль, окси-метилфурфурол, формальдегид и др.), обуславливающих их токсичность для ряда микроорганизмов /10/. Более того, экспериментально доказано, что кислые гидролизаты с рН<4,0 трудно поддаются высушиванию, т.к. вызывают за-липание слоя гранул инертного материала. В этой связи, необходим выбор способа очистки ПО, получаемых гидролизом кислотой. Очистка кислотных гидролизатов белка обычно начинается с подбора условий их нейтрализации подходящим щелочным реагентом /58/.

Кроме нейтрализации, для очистки белковых гидролизатов от ионов кислотных остатков применяют высокоселективные анионообменные смолы (ИА-1Ф, ЭДЭ-ЮПТи др.).

Помимо прочего, для осветления гидролизатов и адсорбции окрашенных примесей широко применялись и применяются в настоящее время активированные угли различных марок /16/, которые добавляются до или после подще-лачивания растворов. Смесь выпавших нерастворимых солей отфильтровывают вместе с активированным углем или другим сорбентом, предназначенным для осветления раствора. Одновременно с деминерализацией и осветлением раствора происходит отделение избытка дикарбоновых кислот и тирозина, образовавшихся в процессе гидролиза.

В случае проведения солянокислотного гидролиза оставшуюся соляную кислоту удаляют нейтрализацией NaOH, КОН или Иа2СОз /94/, а также при помощи ионообменных мембран или анионитов различных марок /102, 111/.

В противоположность химическому гидролизу ферментативный гидролиз белков, как известно, протекает в мягких условиях в нейтральной, слабокислой или слабощелочной среде при температуре 35−50 °С в течение 8−120 ч и приводит к получению смеси аминокислот и пептидов /8, 58/. Обычно для гидролиза в препаративных целях применяют неочищенные ферментативные препараты из поджелудочной железы или слизистой тонкого кишечника различных сельскохозяйственных животных, а также ферменты растительного происхождения.

При ферментативном гидролизе не происходит разрушение триптофана и наблюдается самая низкая степень рацемизации аминокислот 191. Ферментативные гидролизаты белков содержат в своем составе значительно меньшее количество солей и в отдельных случаях не требуют специальных процедур очистки/58,26,114/.

Некоторые гидролизаты, особенно из растительных белков, часто содержат высокомолекулярные примеси, которые необходимо удалять, для чего применяют, например, ультрафильтрацию растворов гидролизатов через полупроницаемые мембраны с различным размером пор, обеспечивающую не только фракционирование, но и очистку, в частности осветление растворов /113, 117/. В случае необходимости можно ограничиться обычной фильтрацией гидролизатов через активированные угли различных марок, бентониты, неорганические соединения кальция /13, 114/, а также через фильтровальное полотно или картон.

Учитывая, что фильтрованный ФГМ имеет рН (7,5+0,3) ед. рН, который отвечает требованиям к жидким полуфабрикатам по рН, подаваемым на установку сушки УСП-2, представлялось целесообразным его высушивать без применения какой-либо дополнительной подготовки. Высушенный ФГМ имел вид мелкодисперсного гомогенного порошка с влажностью не более 5%. Данный эксперимент подтвердил предположение о том, что данная ПО перед обезвоживанием не требует дополнительной подготовки, так как экспериментальные образцы сухого ФГМ соответствовали предъявляемым требованиям НД.

Гидролиз КГК и КГСМ осуществляли с использованием 6 и 3%-го растворов соляной кислоты соответственно требованиям НД. Первоначально провели эксперименты по высушиванию полученных гидролизатов на установке УСП-2 без предварительной подготовки. Однако высушить их не удалось, так как происходило слипание слоя гранул инертного материала, что в свою очередь привело к невозможности дальнейшего проведения процесса сушки. Повидимому это вызвано тем, что значения рН данных гидролизатов значительно меньше 5,0 ед.рН. Исходя из этого, был поставлен ряд экспериментов с целью определения оптимального диапазона водородного показателя в предлагаемых.

3 1 к высушиванию КГК и КГСМ. Для этого готовили образцы по 20 дм ПО, в которых устанавливали 40%-м раствором NaOH рН, равное 6,0- 7,0- 8,0- 9,0 ед. рН, с последующей фильтрацией через полотно бельтинг и высушиванием. Все пробы были высушены. Полученные материалы представляли собой рассыпчатый, мелкодисперсный, гомогенный порошок от светлодо темно-коричневого цвета.

Ввиду того, что в последующем ПО использовали для приготовления ПС, аналогичным способом провели еще ряд экспериментов для более точного определения верхних и нижних пределов водородного показателя высушиваемых гидролизатов в диапазоне 6,0−8,0 ед. рН, с шагом 0,5. Результаты полученных экспериментов показали, что рН приготовленных ПС после их стерилизации значительно снижается. Так, при использовании ПО с рН в интервале 6,07,0 ед. рН стерильные ПС имеют водородный показатель, равный 5,5−6,5, что не соответствует значениям, указанным в требованиях НД. Исходя из этого, наиболее оптимальная концентрация рН обезвоживаемых ПО составила для КГК 7,0−7,5, для КГСМ 7,5−8,0 ед.рН. Сушка КГК и КГСМ, подготовленных вышеуказанным способом, не вызывает затруднений, дает возможность получения качественного сухого препарата.

Таким образом, в результате проведенных исследований, были выбраны и обоснованы способы подготовки жидких полуфабрикатов к сушке. Физико-химические показатели ПС, полученных с использованием сухих гидролизатов, подготовленных вышеизложенными способами, соответствуют нормам, изложенным в НД, и не содержат нерастворимого осадка.

2.3.1.2 Отработка режимов обезвоживания питательных основ на распылительной установке.

Из теории известно, что сушка — это сложный технологический тепло-массообменный процесс, который во многих производствах должен обеспечить не только сохранение ряда нативных свойств материала, но и улучшение этих свойств. Поэтому решение актуальных задач в области сушки должно базироваться на научных основах технологии сушки: от изучения технологических свойств материала (продукта) как объекта сушки — к выбору методов и обоснованию режимов процесса и только на этой основе — к созданию рациональных конструкций сушильных установок или выбору выпускаемых промышленностью сушилок /12/.

Под технологическими свойствами материалов понимаются самые различные свойства: биологические, физико-химические, структурно-механические, теплофизические, электрофизические и др. Для каждого конкретного продукта те или иные свойства играют решающую роль, определяющую его качественные показатели в самом широком смысле этого слова. Важно, чтобы в процессе сушки были сохранены и улучшены именно эти основные свойства, в то время как другие свойства неизбежно изменяются /46,99/.

Таким образом, специфические свойства отдельных материалов обуславливают различные требования к процессу сушки, а следовательно, и к режиму его проведения, и, соответственно, к оборудованию. Поэтому при организации процесса сушки необходимо учесть свойства продуктов как объектов сушки. Знание этих свойств и закономерностей изменения их при сушке в зависимости от параметров процесса дает возможность выбрать наиболее рациональный способ сушки и обосновать наилучший режим проведения процесса.

Оптимальный режим сушки должен обеспечить получение продукта стандартного качества при высоких технико-экономических показателях. При обосновании и выборе режима сушки и, следовательно, сушильного оборудования необходимо исходить из технологических свойств материала, которые изменяются в процессе сушки, т. е. нужно выбрать такие режимные параметры (температуру, влажность, скорость воздуха и др.), воздействие которых на те или иные характеристики материала обеспечило бы его наилучшие технологические свойства.

Выбор режима сушки обычно начинается с изучения термоустойчивости продукта, связанной с процессами денатурации белков и карамелизацией углеводов, обусловленных нагреванием материала в процессе сушки.

Сушка в распылительных аппаратах белковых ПО, обладающих широкой полидисперсностью, неизбежно сопровождается неравномерным нагревом отдельных частиц продукта. В результате этого температура частиц мелких фракций может превысить предел их термической стойкости. В связи с этим представляло определенный интерес экспериментальное изучение кинетики и температурных интервалов термического разложения высушиваемых ПО.

Для решения этой задачи был использован метод дифференциальной термогравиметрии, получивший за последнее время большое развитие. Исследования проводились на дериватографе фирмы «Shimadzu», позволяющем одновременно фиксировать изменение температуры образца, его массы и энергии инактивации.

Проведенные исследования позволили выявить кинетику теплового разложения образцов. Показатели термогравиметрического анализа ПО по трем параллельным опытам представлены в таблице 2.