Патогенность дейтеромицетов: На примере возбудителя септориоза пшеницы — гриба Septoria nodorum (Berk.) Berk

Актуальность проблемы. Дейтеромицеты (Deuteromycetes) или несовершенные грибы чрезвычайно широко распространены в природе. Многие из них паразитируют на высших растениях. К возбудителям болезней сельскохозяйственных культур, оказывающим наиболее существенный вред производству, относятся грибы pp. Botrytis Mich., Verticillium Nees, Rin-chosporium, Trichothecium Lk, Piricularia Sacc., Cercosporella Sacc., Cladospo-rhim Link, Alternaria Nees, Helminthosporium Lk: Fr., Drechslera Ito, Bipolar is, Curvularia Boed, Fusarium Lk: Fr. (порядок гифомицеты), p. Colletotrichum Sacc. (порядок меланкониальные) и pp. Phoma sp., Phomopsis Sacc., Ascochyta Lid. и Septoria Fr. (порядок сферопсидальные).

Возбудители септориозных пятнистостей пшеницы — грибы p. Septoria в настоящее время насчитывают свыше 10 видов. Среди них наиболее часто на посевах встречаются S. tritici Rob. et Desm. и S. nodorum Berk. Первый из них поражает, в основном, листья, а второй — колос, хотя практически S. nodorum Berk, способен поражать все надземные органы. Оба вида часто можно обнаружить на одних и тех же полях и даже растениях (Соколов и др., 1998).

В 1987 г. на европейской территории бывшего СССР 50 — 80% случаев возникновения массовых пятнистостей на пшенице было вызвано поражением её септориозом (Супрун, 1990). Сильное развитие септориоза на посевах пшеницы отмечено на Алтае и в Северном Казахстане (Васецкая, Столяров, 1988), в Сибири (Лебедева, 1964; Кашуба, 1989), на Северном Кавказе (Фис-сюра и др., 1996; Чуприна и др., 1997) и в Украине (Дубиневич, 1971; Гонта-ренко и др., 1998). Особенно широкое распространение септориоз получил с середины 80-х и начала 90-х годов (Новожилов, 1996), став доминирующим заболеванием на посевах озимой и яровой пшеницы (Павлюшин и др., 2005). Показано, что в благоприятные для развития болезни годы септориоз вызывает снижение урожая зерна на 10 — 20, а в некоторых случаях до 30 — 50%(Дымина, 1997; Гонтаренко и др., 1998).

Приведенные данные говорят о том, что септориоз относится к числу широко распространенных и опасных по экономическим последствиям болезней зерновых культур. Основными методами борьбы с данным заболеванием являются создание и внедрение в производство устойчивых сортов пшеницы и синтез новых эффективных и экологически безопасных химических средств защиты посевов. Решение данных вопросов сдерживается рядом причин, одной из которых является слабая изученность природы пато-генности возбудителей этого заболевания. Из литературы известно, что детерминантами патогенности ряда бактерий и грибов могут служить ферменты (Тарр, 1975; Езепчук, 1977), токсины (Тарр, 1975; Йодер, 1984; Асада, 1985; Дурбин, 1985), гормоны (Тарр, 1975; Пегг, 1984; Косуге, Комаи, 1985) и другие биологически активные соединения. Сведения подобного плапа в отношении грибов p. Septoria ограничены, поэтому проведение исследований, направленных на изучение пектолитических и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов как возможных биохимических факторов патогенности S. nodorum Berk, является актуальным и имеет большое научное общебиологическое и прикладное значение.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы было изучение физиолого-биохимической природы патогенности S. nodorum Berk. как теоретической основы направленного поиска новых средств химической защиты растений и создания устойчивых к септориозу сортов пшеницы.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

• изучить динамику роста и споруляции S. nodorum Berk, в чистой культуре, выявить зависимость их от состава питательной среды (источники азота и углерода, ростовые факторы и т. д.) и проанализировать взаимосвязь между физиологической специализацией S. nodorum Berk, и его пато-генностью;

• выяснить способность S. nodorum Berk, к мутационной изменчивости, создать для экспериментальных целей коллекцию морфологических и контрастных по патогенности мутантных штаммов гриба и изучить физиологические особенности некоторых из них;

• проследить за динамикой активности пектолитических и целлюлоли-тических ферментов, синтеза индолилуксусной кислоты (ИУК) и фитоток-синов в процессе роста S. nodorum Berk, в чистой культуре-провести анализ взаимосвязи между патогенностью гриба и способностью его к продуцированию ферментов, фитотоксинов и ИУК;

• изучить полиморфизм белков и изозимный спектр некоторых гидро-лаз и оксидоредуктаз у природных изолятов, а также у слабои высокопатогенных мутантов гриба S. nodorum Berk.;

• выявить особенности динамики активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и пероксидазы, а также содержания ИУК в системе «растение — хозяин — патоген» в процессе развития болезни;

• изучить действие экзогенных ферментных препаратов, фитотоксинов и фитогормонов на характер взаимоотношений патогена и растенияхозяина;

• разработать схему взаимодействия на уровне пекто-и целлюлоли-тических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов (ИУК) между возбудителем септориоза — грибом S. nodorum Berk, и растениями пшеницы.

Научная новизна. Впервые проведены комплексные исследования пектолитических и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов как возможных факторов патогенности возбудителя септориоза пшеницы — гриба S. nodorum Berk. Эксперименты выполнены с использованием не только природных изолятов, но и конрастных по патогенности мутантов S. nodorum Berk., впервые полученных на основе изолята 85−254.

Впервые с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления удалось количественно оценить способность S. nodorum Berk, к синтезу фитотоксинов и ИУК при выращивании его в чистой культуре. .

Установлено, что культура гриба S. nodorum Berk, обладает активным комплексом пектолитических и целлюлолитических ферментов, продуцирует ряд фитотоксичных метаболитов и фитогормоны, в частности ИУК. Максимальная активность полигалактуроназы, комплекса целлюлаз и ксиланазы приходится на 5−7 сутки роста гриба, то есть на экспоненциальную фазу, характеризующуюся наиболее высокой удельной скоростью роста патогена и переходом его к продуцированию спор. Прекращение роста и достижение максимума споруляции сопровождается снижением активности ферментов и увеличением количества ИУК с 1,5 до 6,7 нг/г сырой массы. При прорастании пикноспор резко повышается активность ферментов, возрастает содержание фитотоксинов и ИУК, одновременно усиливается секреция их в окружающую инкубационную среду.

Впервые показано, что наиболее патогенные природные изоляты и мутанты S. nodorum Berk, обладают и более высокой активностью гидролитических ферментов, особенно полигалактуроназы и [3-глюкозидазы, а также повышенной способностью к продуцированию фитотоксинов. Между па-тогенностью мутантов S. nodorum Berk, и способностью их к синтезу ИУК обнаружена обратная корреляционная зависимость.

Впервые представлены данные сравнительного анализа активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и пероксидазы у слабои высокопатогенных мутантов S. nodorum Berk., доказывающие преимущество последних по числу изоферментов эстеразы, [3-глюкозидазы, кислой фосфа-тазы и пероксидазы.

Впервые с использованием восприимчивого и относительно устойчивого к септориозу сортов пшеницы исследованы особенности динамики активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и пероксидазы, а также содержания ИУК в процессе развития болезни у растений, инфицированных слабои высокопатогенным мутантами S. nodorum Berk. Показано, что и в данном случае различия между слабои высокопатогенным мутантами и преимущество последнего сохраняются, особенно в опытах с восприимчивым к септориозу сортом пшеницы.

В экспериментах с изучением действия экзогенных гидролаз, фито-токсинов и фитогормонов на растеиия впервые доказано, что экстракты ферментов из мицелия S. nodorum Berk, вызывают на листьях повреждения, характерные для септориоза. Фитотоксины, напротив, не способны вызывать подобные внешние симптомы, однако при добавлении в споровую суспензию повышают степень поражения инокулированных растений пшеницы, а при поступлении через корни влияют на транспирацию и водный обмен. Предобработка растений пшеницы фитогормонами с последующим инфицированием их S. nodorum Berk, в значительной степени снижает развитие септориоза.

На основе полученных результатов и данных литературы предложена схема взаимодействия возбудителя септориоза — гриба S. nodorum Berk. и растений пшеницы.

Практическая значимость работы. В результате проведенных экспериментов:

• создана коллекция мутантов гриба S. nodorum. Berk, (свыше 30 штаммов), различающихся по морфолого-культуральным признакам и па-тогенности;

• выделены фитотоксины гриба S. nodorum Berk., которые могут быть использованы в работах по селекции пшеницы на устойчивость к септориозу с помощью культуры клеток и тканей;

• разработаны схема препаративного выделения токсинов из культуры гриба S. nodorum Berk., «Методика определения фитотоксинов гриба S. nodorum Berk, с помощью тонкослойной хроматографии» и «Методика количественного определения фитотоксинов гриба S. nodorum Berk, с помощью жидкостной хроматографии высокого давления» ;

• составлены «Рекомендации по направленному синтезу фунгицидов, предназначенных для борьбы с септориозом» .

Основные положения, выносимые на защиту:

• наиболее патогенные природные изоляты и мутанты гриба S. nodorum Berk, обладают и более высокой активностью пектолитических и целлюлолитических ферментов, особенно полигалактуроназы (г=0,67) и (3-глюкозидазы (г=0,70);

• высокопатогенные мутанты, как и высокопатогенные природные изоляты гриба S. nodorum Berk., превалируют по количеству продуцируемых септорина и меллеина (охрацина), суммарному количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксичных метаболитов и по количеству секре-тируемых фитотоксинов над слабопатогенными штаммами;

• между патогенностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его к синтезу и секреции фитогормона ИУК во внешнюю среду существует обратная корреляционная. зависимость;

• схема взаимодействия возбудителя септориоза — гриба S. nodorum Berk, и растений пшеницы, предложенная на основе полученных результатов и данных литературы.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались на научно-теоретических конференциях НИСХИ МСХ СССР (пгт Гвардейский, 1981,1983,1988), VIII научной конференции по споровым растениям Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1989), научно-теоретической конференции Среднеазиатского НИИ фитопатологии МСХ СССР (Ташкент, 1989), I и II Всесоюзном совещаниях по физиолого — биохимическим основам иммунитета с.-х. растений к грибным болезням (Уфа, 1988, 1990), заседаниях научно-технического совета при ВНИИ фитопатологии МСХ СССР.

Голицыно, 1980; 1991), бюро Отделения защиты растений Россельхозакаде-мии (Москва, Санкт-Петербург, Голицыно, 1992;2002), IX Всесоюзном совещании по иммунитету растений к болезням и вредителям (Минск, 1991), III (Санкт-Петербург, 1993) и IV (Москва, 1999) съездах Всероссийского общества физиологов растений, научно-методическом совещании по селекции яровой пшеницы, посвященном 110-летию А. П. Шехурдина (Саратов, 1996), V и VI международных конференциях «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1999, 2001), международной научно-практической конференции «Биологизация защиты растений: состояние и перспективы» (Краснодар, 2000), I съезде микологов (Москва, 2002), I Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (Санкт-Петербург, 2002).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 50 работ.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, восьми глав, включающих обзор литературы, заключения, выводов, списка литературы и 36 стр. приложения. Работа изложена на 360 страницах, иллюстрирована 45 таблицами и 78 рисунками. Библиография.

выводы.

1. Среди дейтеромицетов, паразитирующих на растениях, возбудители септориоза — грибы p. Septoria занимают одно из ведущих мест. На культур ных и дикорастущих злаках число видов и форм Septoria достигает 17. Они поражают пшеницу, рожь, ячмень, овес и другие культуры. Из видов 4 Septoria, обнаруженных на пшенице, наиболее часто встречаются S. nodorum • Berk, и S. tritici Rob. et Desm. Септориоз распространен повсеместно, однако особенно сильное развитие его на озимой и яровой пшенице наблюдается в Северо-Западном, Центральном, Центрально-Черноземном регионах, в Си бири, на Северном Кавказе, в странах Балтии и в Украине. Высокая патогенность грибов p. Septoria в сочетании с высокой вредоносностью и отсутствие устойчивых сортов приводят в благоприятные для развития болезни годы к снижению урожая зерна на 10−20 и даже — 30−50%.

2. Впервые проведены комплексные исследования природы патоген- • ности одного из: основных возбудителей септориоза — гриба S. nodorum. Berk. Изучение динамики роста и споруляции S. nodorum Berk, на КДА показало, что в первые 10 суток с момента инокуляции гриб растет с максимальной скоростью. С 10 по 16 сутки удельная скорость роста снижается до нуля, а затем принимает отрицательные значения. Переход гриба к генеративной фазе своего развития и резкое усиление спорулирующей способности патогена происходит на 5−7, а достижение максимума — на 10 сутки. Гриб растет, спорулирует и сохраняет патогенность при выращивании его не только на природных, но и на синтетических питательных средах.. Потребность в каких-либо дополнительных факторах роста патоген не ис-. пытывает.

3. Природные хорошо спорулирующие изоляты S. nodorum Berk., как правило, обладают высокой патогенностью, характеризуются слабо выраженной физиологической специализацией и, напротив, ярко выраженной мутационной изменчивостью. В процессе исследования спонтанной и индуцированной изменчивости S. nodorum Berk, выделено свыше 30 морфологических мутантов. Показано, что пикноспоры мутантов обладают повышенной энергией прорастания при температуре 6−30°С, юни более приспособлены к изменению рН среды и устойчивы к высокому осмотическому давлению. Эти и другие физиологические особенности способствуют проявлению у мутантов S. nodorum Berk, более высокой патогенности и являются основой для лучшей адаптации патогена к условиям внешней среды.

4. Установлено, что культура гриба S. nodorum Berk, обладает активным комплексом пектолитических и целлюлолитических ферментов. Максимум их активности приходится на экспоненциальную фазу (5−7 сутки), характери зующуюся наиболее высокой удельной скоростью роста патогена и перехо дом его к продуцированию спор. Прекращение роста и достижение максиму ма споруляции сопровождаются снижением активности ферментов. При про растании спор гриба активность ферментов, напротив, резко повышается. Од новременно усиливается секреция их в окружающую среду.

5. Между патогенностью S. nodorum Berk, и активностью пектолитиче ских и целлюлолитических ферментов выявлена определенная корреляция. Показано, что наиболее патогенные изоляты и мутанты гриба обладают и бо лее высокой активностью ферментов, особенно, полигалактуроназы (г=0.67) и Р-глюкозидазы (г=0.70). Экстракты ферментов из мицелия S. nodorum Berk, нанесении их на листовую поверхность способны вызывать повреж дения, характерные для септориоза. Обработка растений раствором СаСЬ не только подавляет действие ферментных препаратов, но и в значительной мере снижает степень развития септориоза на изолированных листьях растений пшеницы, инфицированных S. nodorum Berk.

6. Наибольшее количество изоферментов эстеразы (18), Р-глюкозидазы (12), кислой фосфатазы (3) и пероксидазы (4) обнаружено также у высокопа тогенных мутантов S. nodorum Berk. Показано, что процесс прорастания спор S. nodorum Berk, сопровождается изменениями как в белковом спектре, так и в составе изоферментов. В частности, число изоферментов эстеразы в спорах уменьшается с 14−15 (покоящиеся) до 13−14 (прорастающие), а у пероксидазы, напротив, — увеличивается с 3 до 4.

7. Гриб S. nodorum Berk, способен продуцировать целый ряд фитоток-сичных метаболитов. Выделенные из мицелия и1 среды культивирования фитотоксины (ФТ) в значительной степени различаются между собой по физи ко-химическим свойствам. Анализ полученных Данных позволяет отнести ФТ-5 с голубой флуоресценцией к меллеину (охрацину), ФТ-3 — к одному из его производных, а ФТ-1 и ФТ-2 — к септорину. Кроме того, в составе физио логически активных метаболитов гриба обнаружены микофеноловая кислота и неидентифицированное серое вещество с Rf 0,34 (сер. 0,34).

8. Высокопатогенные мутанты, как и высокопатогенные природные изоляты гриба S. nodorum Berk, превалируют по количеству продуцируемых ФТ-2 и ФТ-5, суммарному количеству всех обнаруженных в мицелии фито-токсичных метаболитов и по количеству секретируемых в инкубационную среду фитотоксинов (ФТ-2 и ФТ-5, сер. 0,34 и микофеноловая кислота) над слабопатогенными штаммами. Исследование динамики содержания фитоток синов в спорах в процессе их прорастания подтвердило выявленную законо мерность.

9. Фитотоксины S. nodorum Berk, не способны при нанесении на изо лированные листья или интактные растения вызывать симптомы поражения, характерные для септориоза. Однако при добавлении их, особенно ФТ-1, ФТ-2 и ФТ-5, в споровую суспензию степень поражения инокулированных расте ний пшеницы повышается на 31,2−42,3%.

10. При выращивании S. nodorum Berk, в чистой культуре уже через 3-е суток в мицелии обнаруживается 1,5 нг ИУК в расчете на грамм сырой мае сы. На 7-е сутки количество ИУК возрастает в 2,2 раза, а на 10-е, то есть к моменту максимума спорогенеза, — в 4,5 раза и достигает величины 6,7 нг/г сырой массы. Одновременно с синтезом ИУК идет активная секреция гормона в окружающую инкубационную среду. Проведенные на контрастных по патогенности мутантах исследования показали, что между патогенностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его к синтезу и секреции ИУК во внешнюю среду существует обратная корреляционная зависимость.

11. Исследования влияния экзогенных фитогормонов на культуру гриба S. nodorum Berk, и характер взаимодействия его с растениями пшеницы пока зали, что гиббереллин (100 мкг/мл) подавляет прорастание пикноспор гриба, ингибирует рост гиф в длину (10−100 мкг/мл), влияет на формирование пик нид и их продуктивность. ИУК, кинетин (10−2*5 мкг/мл) и АБК (50−100 мкг/мл) также подавляют рост гиф. Предобработка растений пшеницы фито-гормонами с последующим инфицированием их S. nodorum Berk, снижает развитие септориоза в зависимости от типа фитогормона, его концентрации и сорта пшеницы на 12,2−65,1%. Фитогормоны изменяют тип реакции на пато ген в сторону уменьшения, влияют на размеры некротических пятен на ли стьях и вызывают тенденцию к снижению числа пикнид в расчете на единицу площади.

12. Существенные различия между слабои высокопатогенными мутан тами обнаружены и при исследовании системы «растение-хозяин-патоген». Показано, что инфицирование растений восприимчивого к септориозу сорта пшеницы Саратовская 29 высокопатогенным мутантом в отличие от слабопа тогенного практически не вызывает на начальном этапе патогенеза каких-либо изменений в содержании ИУК, индуцирует снижение в листьях актив ности пектои целлюлолитических ферментов и, напротив, повышение ак тивности кислой фосфатазы и, особенно, пероксидазы. С развитием болезни количество ИУК в листьях возрастает. Повышается активность полигалактуроназы, Сх-целлюлазы и Р-глюкозидазы (7 сутки), а затем и С i-целлюлазы. Значительное усиление активности пероксидазы, -которое наблюдалось уже через 3-е суток, сохраняется на всем протяжении опыта. Отмечены изменения и в изоферментных спектрах как гидролаз, так и' оксидоредуктаз. Однако и в данном случае влияние высокопатогенного мутанта было более значительным, особенно в отношении Р-глюкозидазы и эстеразы.

13. Инфицирование S. nodorum Berk, относительно устойчивого к септориозу сорта Castan только к концу опыта повышало уровень ИУК в листьях на 20,0−33,3%. Достоверных различий в действии слабои высокопатогенного мутантов на синтез ИУК, динамику активности пектои целлюлолитических ферментов, а также изоферментный спектр Р-глюкозидазы, кислой фосфатазы и эстеразы не обнаружено. Более значительное усиление активности пероксидазы под влиянием высокопатогенного мутанта1 было отмечено и на данном сорте. Кроме того, мутант уже на 3-й сутки после инокуляции вызывал появ ление в спектре пероксидазы дополнительного Ю'-го изофермента с Rf 0,120,15.

14. Полученные экспериментальные данные дают основание считать, что исследованные нами «пектои целлюлолитеческие ферменты, фитотоксины и фитогормоны (ИУК) действительно являются факторами патогенности гриба S. nodorum Berk, выполняющими в процессе инфицирования как инва-зивные (ферменты), так и регуляторные (ИУК, фитотоксины) функции.

15. Выявленные в результате изучения физиолого-биохимической при роды патогенности S. nodorum Berk, закономерности и предложенная схема взаимодействия патогена и растения-хозяина могут служить теоретической основой для разработки стратегии защиты посевов пшеницы от септориоза, включающей в себя целенаправленный синтез новых высокоэффективных химических соединений, способных блокировать факторы патогенности гриба, и создание устойчивых сортов. Одним из наиболее вероятных путей решения задачи по выведению невосприимчивых или толерантных к септориозу сортов пшеницы является использование в качестве селектирующего фактора фитотоксинов, продуцируемых S. nodorum Berk., в сочетании с методами биотехнологии и клеточной селекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

t.

Патогенность или способность вызывать инфекционную болезнь у растений — одно из основных свойств фитопатогенных организмов. В широком смысле слова она представляет собой комплекс признаков, отличающих паразитов от непаразитов (Дьяков и др., 2001). С учетом данного положения постараемся проанализировать и обобщить результаты экспериментов по изучению природы патогенности одного из представителей дейтеромицетов, возбудителя септориоза пшеницы — гриба S. nodorum Berk.

В результате проведенных исследований установлено, что рост фи-топатогенного гриба S. nodorum Berk, при культивировании его на агаризо-ванной картофельно-декстрозной питательной среде (КДА) при температуре 20 °C и 16-час. фотопериоде в первые 10 суток после инокуляции идёт с максимальной скоростью. С 10 по 16 сутки удельная скорость роста снижается до нуля, а затем принимает отрицательные значения. Полученные показатели удельной скорости роста (2,0−2,2%'н" 1) характеризуют данный гриб как медленнорастущий. Переход гриба к генеративной фазе своего развития и резкое усиление спорулирующей способности патогена происходит на 5 и 7-е, а достижение максимума — на 10-е сутки.

Гриб растёт, спорулирует и сохраняет патогенность при выращивании его не только на природной, но и на синтетических (полусинтетических) средах. Показано, что наиболее эффективным источником азота для роста и споруляции гриба S. nodorum Berk, в этом случае является глицин. Глюкоза в качестве источника углерода в 1,5 раза эффективнее галактозы. Потребность в каких-либо дополнительных факторах роста патоген не испытывает.

Полевыми и тепличными экспериментами установлено, что все природные хорошо спорулирующие изоляты S. nodorum Berk, различающиеся по происхождению и морфолого-культуральным признакам, обладают потенциально высокой патогенностью и вирулентностью, проявление которых как на наборе сортов, так и на каждом из них в отдельности определяется прежде всего метеоусловиями, наблюдающимися в период инокуляции растений, а затем уже сортом пшеницы.

В биологии фитопатогенных грибов, в том числе и S. nodorum Berk, особый интерес вызывает наличие или отсутствие у них так называемой физиологической специализации, связанной с существованием у патогена опре- ' деленных рас, способных поражать одни и не поражать другие сорта из осо- • бого тест-набора сортов или набора сортов-дифференциаторов. Для возбудителей септориоза пшеницы официально признанного набора сортов-дифференциаторов пока не существует, хотя исследователи разных стран и пытаются, изучая взаимодействие «изолят х сорт», подобрать такие сорта из числа устойчивых или слабовосприимчивых к септориозу (Rufty et al., 1981; Saadaoui, 1987; Meien-Vogeler et al., 1992; Валуевич и др., 1992; Zamorski, Nowicki, 1997; Kema, Van Silfhoum, 1997).

Однако далеко не всегда удается провести дифференциацию по пато- • генности и выявить среди изолятов S. nodorum Berk и S. tritici менее пато- • генные и более патогенные штаммы, используя один или даже несколько сортов пшеницы, как и обнаружить четкие различия в реакции сортов пшеницы на возбудитель септориоза (Le Roux, 1984; Haugen et al., 1985). Слабое специфическое взаимодействие в системе «изолят х сорт» было отмечено и в работе по изучению изолятов S. nodorum Berk, выделенных из различных хозяев, после пассажа через пшеницу (Krupinsky, 1994).

Ученые Западной Андалузии (Испания), обобщая сведения, полученные за 6 лет наблюдений по биологии и эпидемиологии двух наиболее • важных в экономическом отношении возбудителей болезней пшеницы — S.. tritici и S. nodorum, пришли к выводу, что физиологическая, межвидовая и внутривидовая специализация у изученных фитопатогенов вообще отсутствует (Marin, Aguirre, 1986). А устойчивость, обнаруживаемая у некоторых сортообразцов к S. nodorum и S. tritici, по мнению авторов, является неспецифической. По нашим данным, гриб S. nodorum Berk, действительно обладает слабо выраженной физиологической специализацией, что затрудняет дифференциацию его по расовому составу. В связи с этим можно предположить, что популяция S. nodorum Berk. может быть дифференцирована на расы только при условии создания и привлечения в эксперимент иммунных или высокоустойчивых к септориозу сортов пшеницы.

Одной из причин слабо выраженной физиологической специализации гриба S. nodorum Berk, по-видимому, является достаточно высокая степень изменчивости патогена, характерная для дейтеромицетов (Griffiths, Ао, 1980). Нами в процессе исследования спонтанной и индуцированной изменчивости S. nodorum Berk, установлено, что под влиянием УФ-облучения споровой суспензии гриба S. nodorum Berk происходит интенсивное образование морфологических мутантов, многие из которых отличаются от природных исходных изолятов по морфолого-культуральным и физиологическим признакам, в том числе и более высокой патогенностью.

Показано, что пикноспоры мутантов обладают повышенной энергией прорастания при температуре 6−30° С, они более приспособлены к изменению рН среды, устойчивы к высокому осмотическому давлению. Эти и другие физиологические особенности, по-видимому, способствуют проявлению у мутантов S. nodorum Berk, более высокой патогенности и являются основой для лучшей адаптации гриба к условиям внешней среды.

Для изучения физиолого-биохимической природы патогенности из полученных свыше 30 мутантов были отобраны шесть, три из которых характеризуются слабой (4,5−9,8%) и три — высокой (63,0−82,0%) патогенностью.

Исследованиям природы патогенности возбудителя септориоза предшествовало изучение его. биохимических особенностей и, в частности, способности патогена к синтезу пектои целлюлолитических ферментов, токсинов и фитогормонов как наиболее возможных факторов патогенности. К началу исследований было известно лишь, что S. tritici, но не S. nodorum Berk., в условиях in vitro продуцирует ферменты (пектин-метилэстераза, целлюлаза, р-глюкозидаза), разрушающие клетки пшеницы (Onogur, 1977, 1978). В результате наших экспериментов было установлено, что и культура S. nodorum Berk, обладает активным комплексом пектолитических и целлюлолитиче-ских ферментов. Максимальная активность полигалактуроназы, комплекса целлюлаз и ксиланазы приходится на 5−7 сутки роста гриба, то есть на экспоненциальную фазу, характеризующуюся наиболее высокой удельной скоростью роста патогена и переходом его к генеративной фазе своего развития (продуцирование спор). Падение темпа роста и достижение максимума споруляции (10-е сутки)'сопровождаются снижением активности ферментов.

С помощью инструментальных биохимических методов анализа исследована гетерогенность белков и ферментов гриба S. nodorum Berk. Установлено, что количество белковых зон в эдектрофоретическом спектре природных изолятов гриба S. nodorum Berk, варьирует от 22 до 47. Полосы имеют Rf в пределах от 0,01 до 0,97. Коэффициент сходства между изоля-тами колеблется в пределах 34,0 — 78,6%.

Белковый препарат, выделенный из мицелия природных изолятов гриба S. nodorum Berk., содержит от 11 до 21 изоферментов эстеразы, от 2 до 5 изоферментов пероксидазы и от 3 до 8 изоферментов р-глюкозидазы.

Экспериментально доказано, что S. nodorum Berk, способен продуцировать ряд фитотоксичных метаболитов. Выделенные из мицелиальной массы и среды культивирования различных изолятов S. nodorum Berk. фитотоксины (ФТ) в значительной степени различаются между собой по окраске в видимом свете и флуоресценции в ультрафиолете,-величине Rf для трех систем растворителей, изменению окраски при обработке хроматограмм проявляющими реагентами и УФ-спектрам поглощения. Анализ полученных данных позволяет отнести ФТ-5 с голубой флуоресценцией к меллеину (Devys et al., 1974), а ФТ-3 — к одному из его производных. Среди выделенных веществ два (ФТ-1 и ФТ-2), имеют лимонно-желтую окраску в видимом свете, абсорбируют в УФ-свете и дают жёлто-коричневое окрашивание с хлорным железом, то есть ведут себя как септорин (Bousquet et al., 1980).

Наиболее сильное ингибирующее действие на рост корней и колеоп-тилей пшеницы оказывают ФТ-5 и ФТ-4. Действие метаболита ФТ-3 было выражено слабее и практически не изменялось с увеличением концентрации. Из двух веществ с лимонной окраской четкие фитотоксичные свойства проявлялись только у метаболита ФТ-2.

Все обнаруженные и выделенные из гриба-б", nodorum Berk, фитоток-сины (за исключением ФТ-1) проявляют ингибирующий эффект как на восприимчивых, так и на относительно устойчивых к септориозу сортах пшеницы. При нанесении ихна изолированные' листья или интактные растения они не способны вызывать внешние симптомы поражения, характерные для септориоза. Это говорит об отсутствии специфичности у фитотоксинов S. nodorum Berk, в отношении растения-хозяина.

Проведенные с применением биотеста исследования показали, что фитопатогенный гриб S. nodorum Berk, способен продуцировать и фито-гормоны, в частности индолил-уксусную кислоту, являющуюся одним из важнейших природных регуляторов роста растений. Полученные данные были подтверждены с помощью современного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Установлено, что при культивировании гриба S. nodorum Berk, уже через 3 суток в мицелии обнаруживается 1,5 нг ИУК в расчете на грамм сырой массы. На 7-е сутки количество ИУК в культуре возрастало в 2,2 раза, а на 10-е, т. е. к моменту максимума спорогенеза, — в 4,5 раза и достигало величины 6,7 нг/г г сырой массы. Одновременно с синтезом ИУК, как показали исследования, идёт активная секреция гормона в окружающую среду. Максимальное содержание ИУК в культуре грибов р.

Septoria, судя по литературным данным (Vasjuk, Andrianova, 1994), составляет 933 нг/г сырой массы. Оно определяется видом гриба, природой изолята и, естественно, условиями культивирования патогена. (Васюк и др., 1996 а).

Из приведенных данных следует, что возбудители септориоза пшеницы: S. nodorum Berk. и S. tritici способны к продуцированию всех предполагаемых биохимических факторов патогенности, а именно: комплекса пектои целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов, в частности, ИУК.

Дальнейшие исследования показали, что высокая патогенность природных изолятов и мутантов гриба S. nodorum Berk, как правило, сопровождается и более высокой активностью ферментов. Корреляционный анализ, проведенный на основе полученных данных, подтвердил существование между патогенностью гриба S. nodorum Berk и активностью пектолитических и целлюлитических ферментов прямой зависимости. Особенно тесная связь обнаружена между патогенностью и активностью полигалактуроназы (г=0,67), С[ - целлюлазы (г=0,66) и р — глюкозидазы (г=0,70). В значительно меньшей степени патогенность зависела от Сх — целлюлазы (г=0,34) и ксиланазы (г=0,47). О значительной роли данных ферментов в проявлении патогенности и вирулентности у грибов говорят и результаты, полученные в ряде работ с другими объектами. Так, активность целлюлазы у. высокопатогенных штаммов возбудителя антракноза тыквенных Colletotrichum lagenarium (Touze, 1972; Rabenantoandro, Auiol, 1975),' Pyrieularia oryzae (Sudo et al., 1973 a, 6), Pseudocercosporella herpotrichoides и Rhizoctonia cerealis (Afchari-Azad, Wolf, 1992) выше, чем у слабопатогенных. Предполагается, что критерий Р-глюкозидазной активности может быть использован для характеристики вирулентности штаммов Alternaria solani (Аврова, 1993). Имеется достаточно большое количество работ, в которых доказывается существование вполне определенной связи между патогенностью грибов и их способностью к продуцированию не только целлюлолитических, но и пектолдитических ферментов, в частности, полигалакттуроназы Colletotrichum lagenarium (Lule et al., 1977), полиметилгалактуроназы и пектинметилэстеразы Alternariaporri (Wasfy et al., 1977), а также полигалактуронат-трансэлиминазы возбудителя Fusarium spp. (Bulnheim, 1978). Проверка коллекции из 198 штаммов Fusarium spp. in vitro позволила установить, что патогенный штамм гриба чаще обладает высокой активностью ксиланазы: г=0,57−0,72 (Клечковская, 1999). У сумчатого некротрофного гриба Sclerotinia sclerotiorum существенную роль в патогенной стратегии играют эндополигалактуроназы PG-2 и PG-4 (Fava-ron et al., 1993). В качестве подтверждения значительной роли полигалактуроназы в процессе проникновения гриба в ткани хозяина могут служить и данные, полученные в опытах с Cochliobolus sativus (Clay et al., 1997).

Проведенные на 5-суточной культуре S. nodorum Berk, исследования показали, что в целом высокопатогенные мутанты, помимо пектои целлюлолитических ферментов, характеризуются повышенной активностью пероксидазы и менее высокой активностью кислой фосфатазы.

В ходе исследований у мутантов S. nodorum Berk. выявлено от 9 до 18 изоферментов эстеразы, от 5 до 12 изоферментов р-глюкозидазы, 2−3 — кислой фосфатазы и от 1 до 4 изоферментов пероксидазы. Наибольшее количество изоферментов эстеразы (18), Р-глюкозидазы (12), кислой фосфатазы (3) и пероксидазы (4) обнаружено у высокопатогенных мутантов. В составе изоферментов мутантных форм S. nodorum Berk, выявлены характерные только для них изоферменты эстеразы и кислой фосфатазы. Кроме того, у всех высокопатогенных мутантов отмечена повышенная активность изоферментов р-глюкозидазы. О существовании связи между патогенностью и полиморфизмом (гетерогеностью) белков и ферментов говорят и данные, полученные при исследовании рас 1 и 2 Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae, различающихся по патогенности (Madhosingh, 1980). Электрофоретическое сравнение изозимов показало, что эти две расы различаются и по набору изози-мов эстеразы, карбоангидразы и кислой фосфатазы. Подобные данные были получены и нами при исследовании мутантов F. graminearum и F. sporotri-chiella (Кобыльский, Кобыльская, Дорохова, 1991). Наибольшее число изоферментов эстеразы (17) в спектре также было отмечено у высокопатогенного мутанта 760/6 F. sporotrichiella.

Дейтеромицеты являются активными продуцентами токсичных метаболитов, поэтому интерес исследователей к токсинам, продуцируемым данными грибами, в том числе и S. nodorum Berk., как возможным факторам их патогенности вполне естественен. Нашими исследованиями показано, что высокопатогенные природные изоляты 176 Е, 538 Б и 85−254 гриба S. • nodorum Berk, отличаются повышенной способностью к продуцированию и секреции фитотоксинов. Изоляты 25 ДЖ и 143 Г, обладающие слабой патогенностью, уступают им и по способности к синтезу фитотоксинов.

Высокопатогенные мутанты по количеству продуцируемых ФТ-2 и ФТ-5, суммарному количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксинов и по количеству секретируемых в инкубационную среду фитотоксинов (ФТ-2, ФТ-5, сер. 0,34 и микофеноловая кислота) также превалируют (за некоторыми исключениями) над слабопатогенными мутантами. Из приведенных данных следует, что между патогенностью S. nodorum Berk, и способностью. его к синтезу фитотоксинов, хотя и неспецифических, существует вполне определенная положительная связь. По литературным данным, наличие чёткой корреляции между образованием токсина цератоульмина и патогеностью обнаружено при изучении 47 изолятов Ceratocystis ulmi — анаморфа: Graphium ulmi Schwarz (Takai et al., 1983). Предполагается, что патогенность Cochliobolus victoriae — телеоморфа гриба Helminthdsporium victoriae — возбудителя заболевания овса обусловлена токсином викторином (Wolpert et al., 1995).

При анализе фитогормонов как возможных факторов патогенности основное внимание нами было обращено прежде всего на индолилуксусную кислоту (ИУК). Проведенные на контрастных по патогенности мутантах исследования показали, что между патогенностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его к синтезу и секреции ИУК во внешнюю среду существует обратная корреляционная зависимость. Подобные данные были получены и в работе с изолятами гриба p. Fusarium, выделенными из семян кукурузы (Manka, 1980). Наиболее интересные данные, подтверждающие существование определенной связи между ИУК и вирулентностью, получены, как это отмечалось в обзоре (глава I), на бактериях (Liu et al., 1982; Kosuge et al., 1985; Косуге, Комаи, 1985).

Инфицирование растений, как известно, начинается с процесса прорастания спор на листьях. Поэтому нас, естественно, интересовало: различаются ли по активности ферментов и содержанию фитотоксинов и фитогормонов (ИУК) покоящиеся споры, выделенные из культуры природных изолятов и мутантов S. nodorum Berk., и что происходит с указанными факторами патогенности на первых этапах их прорастания.

В результате проведенных экспериментов установлено, что покоящиеся споры высокопатогенного природного изолята 176 Е обладают примерно в два раза более высокой активностью Сх — целлюлазы и ксиланазы, чем споры слабопатогенного изолята 25 ДЖ при одинаковой удельной активности полигалактуроназы, Ci — целлюлазы и Р — глюкозидазы. В процессе прорастания спор у изолята 176 Е повышается активность всех изученных пектои целлюлолитических ферментов, особенно полигалактуроназы и Ср целлюлазы, а у изолята 25 ДЖ — только полигалактуроназы и Сх — целлюлазы. При этом активность полигалактуроназы, С| — целлюлазы и ксиланазы у прорастающих спор высокопатогенного изолята 176 Е становится значительно выше, чем у слабопатогенного — 25 ДЖ.

Прорастание пикноспор сопровождается усиленной секрецией белка и ферментов в среду инкубации. Удельная активность пектолитических и целлюлолитических ферментов при этом возрастает в среде в несколько раз как у изолята 176 Е, так и у изолята 25 ДЖ. Однако и в этом случае при практически равной активности внеклеточных Ci — целлюлазы и (3 — глюко-зидазы более патогенный изолят 176 Е превосходит менее патогенный изолят 25 ДЖ по активности полигалактуроназы и ксиланазы.

Близкие результаты при изучении динамики активности пектои цел- ' люлолитических ферментов в процессе прорастания спор были получены • и у контрастных по патогенности мутантов. Показано, что покоящиеся поры высокопатогенных мутантов в отличие от слабопатогенных характеризуются повышенной активностью полигалактуроназы и (3 — глюкозидазы при практически равной активности Сх и Ci — целлюлазы. Преимущество высокопатогенных мутантов было продемонстрировано и при сравнении активности пектои целлюлолитических ферментов у прорастающих в течение 20 ч спор. Выяснилось, что споры высокопатогенных мутантов и в данном случае отличаются более высокой активностью полигалактурона- ' зы, (3 — глюкозидазы (тенденция) и, кроме того, Сх — целлюлазы на фоне ¦ пониженной активности Ci — целлюлазы и ксиланазы.

Показано также, что наиболее значительно в спорах высокопатогенных мутантов на первых этапах их прорастания увеличивается активность (3 — глюкозидазы. Практически не изменяется активность Сх — целлюлазы и уменьшается — у полигалактуроназы и Ci — целлюлазы. Тенденция к снижению активности обнаруживается и у ксиланазы. Как оказалось, именно эти три фермента, особенно ксиланаза, наиболее интенсивно секретируются из прорастающих спор в инкубационную среду. Тогда как у (3 — глюкозидазы наблюдается пониженная секреция.

Из представленных данных следует, что прорастание спор гриба S. nodorum Berk, сопровождается активным продуцированием пектолитических и целлюлолитических ферментов и усиленной секрецией их в окружающую среду. Причем у высокопатогенных мутантов (штаммов) активность полигалактуроназы, (3 — глюкозидазы и Сх — целлюлазы, как правило, выше активности данных ферментов, выделенных из спор или культураль-ной среды слабопатогенных мутантов. Подтверждение участия пектолитиче-ских и целлюлолитических ферментов в самых ранних этапах инфекционного процесса, их связи с патогенностью возбудителей болезни можно найти и в работах с другими патогенами (Sudo et al., 1973; Davet, 1976; Verhoeff, 1978; Koller et al., 1982; Wattad et al., 1997; Dumas et al., 1998).

Помимо пектолитических и целлюлолитических ферментов споры S. nodorum Berk., как выяснилось в дальнейших исследованиях, обладают достаточно высокой активностью ряда других гидролаз. Так, установлено, что удельная активность эстеразы у покоящихся спор природных изолятов гриба S. nodorum Berk, колеблется от 0,7 до 3,87 мкМ/мг белка, кислой фосфатазы — от 0,19 до 0,85, Р — глюкозидазы — от 0,08 до 1,35 мкМ/мг белка, РНК-азы — от 2,30 до 4,56 усл. ед./ мг белка.' Показано, что пикноспоры изолята 25 Д обладают минимальной активностью практически всех изученных ферментов. Для изолята 147 Е, напротив, характерна высокая активность ' гидролаз, особенно кислой фосфатазы, Р — глюкозидазы и РНК-азы. Установ- • лено, что в процессе прорастания пикноспор изолята 25 Д активность РНКазы возрастает в 1,2 раза. Активность кислой фосфатазы у слабопатогенного мутанта при этом усиливается в 2,0 раза, а у высокопатогенных мутантов — в 2,5 — 13,5 раз. В экстрактах непроросших и проросших конидий Erysi-phe graminis f. sp. hordei также обнаружена активность ряда гидролитических ферментов: эстеразы, липазы, фосфатазы, протеазы, Р — 1,3 — глюканазы, хитиназы и амилазы (Fric, Wolf, 1994).

Процесс прорастания спор, кроме того, сопровождается изменениями в белковом спектре и в составе изоферментов. Представляют интерес, в ча- ¦ стности, данные, полученные при изучении активности внутриклеточных РНК-аз в покоящихся и прорастающих спорах Aspergillus clavatus (Иванова, Полякова, 1982). Авторами обнаружена гетерогенность РНК-аз в спорах, характерная и для внеклеточных рибонуклеаз. В изоферментном спектре РНКаз найден стадиоспецифичный фермент, обнаруженный в покоящихся конидиях и исчезающий при прорастании. Прорастание спор гриба S. nodorum Berk., по нашим данным, также тесно связано с изменениями в изофермент-ных спектрах. В частности, в эстеразном спектре спорового материала мутантов обнаружено 12−15 (покоящиеся споры) и 10−16 зон активности (прорастающие споры). Следует отметить, что наименьшее число изоферментов в спектре (12- у покоящихся спор- 10 — у прорастающих) обнаружено у слабопатогенного мутанта, тогда как у высокопатогенных мутантов число изоферментов эстеразы колебалось от 14 до 15 у покоящихся и от 13 до 14 у прорастающих спор.

Эстеразные спектры покоящихся и прорастающих спор каждого мутанта сходны и отличаются друг от друга лишь 1−5 индивидуальными зонами. Однако обращает на себя внимание то, что у высокопатогенных мутантов индивидуальных линий в эстразном спектре и покоящихся, и прорастающих спор всё-таки больше.

Изозимный спектр пероксидазы у мутантов значительно беднее эсте-разного и содержит от 2 до 4 изоферментов. Максимальное число изоферментов пероксидазы у покоящихся (3) и прорастающих (4) спор обнаружена также у высокопатогенных мутантов.

Изменения в составе изоферментов в процессе прорастания спор S. nodorum Berk., по-видимому, свидетельствуют не только об усилении или ослаблении активности соответствующих ферментов, но и о избирательной секреции некоторых изоферментов из прорастающих спор в инкубационную среду.

Исследования динамики содержания фитотоксинов в спорах контрастных по патогенности мутантов S. nodorum Berk, в процессе их прорастания дали возможность установить следующее, на наш взгляд, основные закономерности. Во-первых высокопатогенные мутанты (штаммы, изоляты) гриба S. nodorum Berk., как правило, превалируют над слабопатогенными не только по числу, но и по количеству фитотоксинов, находящихся в исходном споровом материале. Во-вторых, они отличаются относительно более высокой скоростью как синтеза фитотоксинов, так и секреции их из прорастающих спор в окружающую инкубационную среду. Последнее может иметь особенно большое значение на самых ранних этапах развития взаимоотношений между патогеном и растением-хозяином.

Помимо фитотоксинов большой интерес представляло проследить за динамикой содержания ИУК в процессе прорастания спор. В результате проведенных экспериментов установлено, что свежевыделенные из пикнид гриба S. nodorum Berk, споры природного изолята содержат 16,6 нг ИУК на грамм сырой массы. Среди слабопатогенных, и среди высокопатогенных ¦ мутантов встречаются формы как с повышенным, так и с пониженным содержанием ИУК. В среднем особых различий в количестве ИУК в покоящихся спорах мутантов, различающихся по патогенности, не обнаружено.

Через 20 часов прорастания спор ИУК присутствовала уже не только в прорастающих спорах, но и в инкубационной среде, в которой они находились это время. По суммарной ИУК (споры+среда) слабои высокопатогенные мутанты также практически не отличаются между собой. Однако обращает на себя внимание то, что в эти первые часы инкубации споры вы- ' сокопатогенных мутантов в среднем превосходят по содержанию ИУК споры • слабопатогенных мутантов, хотя при этом значительно уступают им по секреции ИУК во внешнюю среду. Это говорит о том, что обратная корреляционная зависимость между патогенностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его как к синтезу, так и секреции ИУК, обнаруженная у 3-, 7- и 10- суточной культуры патогена, у прорастающих спор прослеживается только лишь в отношении секреции ИУК из спор в культуральную среду.

Интересно, что и у биотрофных грибов, в частности в уредоспорах стеблевой ржавчины, обнаружены значительные количества ИУК (Умнов, • Артёменко, Чкаников, 1978). При прорастании спор запасённый в них ауксин. выделяется в культуральную среду, (Умнов, Артёменко, Чкаников, 1984). Этот процесс продолжается на протяжении всего периода развития уредоспор вплоть до образования инфекционных структур гриба. Установлено, что в уредоспорах, проросших спорах и среде, на которой прорастали споры, количество ИУК колеблется от 40 до 100 нг/г сырого веса (Wiese, Grambow, 1986). Сравнительное изучение динамики содержания ИУК в уредоспорах возбудителей двух видов ржавчины показало, что уредоспоры бурой ржавчины отличаются от уредоспор стеблевой ржавчины более низким содержанием ИУК, в том числе свободной, и при прорастании не выделяют ауксин в культуральную жидкость (Чкаников, Артеменко, Гринченко, 1990).

Существенные различия между слабои высокопатогенными мутантами S. nodorum Berk, были выявлены и при исследовании системы «растение-хозяин-патоген». Показано, что инфицирование растений восприимчивого к септориозу сорта пшеницы Саратовская 29 слабопатогенным мутантом уже на третьи сутки приводит к повышению содержания ИУК в листьях на 81,8% и снижению активности полигалактуроназы и кислой фосфатазы на 70,2 и 15,7% соответственно. Активность других изученных ферментов при этом остается без изменений. Использование высокопатогенного мутанта практически не вызывает на данном этапе каких-либо изменений в содержании ИУК, индуцирует снижение в листьях активности пектолитических и целлюлолитических ферментов, за исключением Q — целлюлазы, повышение активности кислой фосфатазы (на 17,8%) и, особенно, пероксидазы (в 2,4 ¦ раза).

На 7-е и 10-е сутки после инокуляции количество ИУК в листьях пшеницы под влиянием S. nodorum Berk, возрастает в 1,5−2,5 и 1,6−3,2 раза соответственно. Активность полигалактуроназы, Сх — целлюлазы, р — глюкозидазы становится выше, чем в контроле, на 7-е, а Ci — целлюлазы и ксиланазы — на 10-е сутки (слабопатогенный мутант). Активность кислой фосфатазы на 7-е сутки оставалась значительно ниже, чем в контроле, однако, на 10е сутки она полностью восстанавливалась, а у пероксидазы возрастала на 13,3 (7-е) и 49,4% (10-е сутки). При использовании высокопатогенного мутанта на фоне спада активности ферментов у здоровых растений в листьях инфицированных растений сначала возрастает активность полигалактуроназы, Сх — целлюлазы и Р — глюкозидазы (7-е сутки), а затем и Ci — целлюлазы, (10-е сутки). Значительное усиление активности пероксидазы, которое наблюдалось уже на 3-й сутки, сохраняется на всём протяжении опыта.

Инфицирование S. nodorum Berk, растений пшеницы относительно устойчивого к септориозу сорта Castan не вызывает в течение 7 суток отклонений в содержании ИУК в листьях по отношению к контролю и только к концу опыта повышает её уровень на 20,0 -33,3%. Достоверных различий в действии слабои высокопатогенного мутантов S. nodorum Berk, на синтез ИУК не обнаружено. Что касается ферментов, то в целом инфицированные слабопатогенным мутантом растения пшеницы на ранних этапах патогенеза отличаются низкой активностью полигалактуроназы, кислой фосфатазы и, напротив, значительно более высокой активностью Сх — целлюлазы. По активности остальных пектои целлюлолитических ферментов пораженные растения данного сорта на протяжении всего опыта были равны или несколько уступали здоровым. Близкие результаты были получены и при использо1 вании высокопатогенного мутанта.

Активность пероксидазы под влиянием слабопатогенного мутанта на сорте Castan повышается только через 7 суток после инокуляции, хотя первые признаки усиления активности фермента можно было обнаружить уже через 3-е суток, а под влиянием высокопатогенного мутанта — на всем протяжении опыта, причем уже через 3-е суток активность фермента возрастает в 2,3 раза.

Инфицирование растений пшеницы Саратовская 29 мутантами гриба S. nodorum Berk, приводит к значительным изменениям и в изоферментных спектрах как гидролаз, так и оксидоредуктаз. Однако влияние высокопатогенного мутанта является более эффективным, особенно в отношении изоферментов Р — глюкозидазы и эстеразы.

Исследования, проведенные на относительно устойчивом к септорио-зу сорте Castan не выявили существенных различий в действии слабои высокопатогенного мутантов S. nodorum Berk. на изоферментный спектр Р — глюкозидазы, кислой фосфатазы и эстеразы. В то же время показано, что высокопатогенный мутант в отличие от слабопатогенного уже на 3-й сутки после инокуляции вызывает появление в спектре пероксидазы дополнительного 10-го изофермента с Rf 0,12 — 0,15. Кроме того, под влиянием мутанта повышается активность некоторых из изоферментов пероксидазы.

Полученные в процессе физиолого-биохимических исследований системы «растение-хозяин-патоген» результаты подтверждаются литературными данными. Так, показано, что инфицирование листьев пшеницы возбудителем стеблевой ржавчины (совместимая комбинация) приводит к резкому увеличению количества ИУК в период споруляции патогена (Чканинов, Ар-тёменко, Гринченко, 1990). При заражении растений пшеницы бурой ржавчиной эти показатели изменялись незначительно, что хорошо согласуется с относительно слабым накоплением ауксина уредоспорами возбудителя. Особый интерес в связи с этим заслуживают данные, полученные при изучении роли гормонального баланса в растениях пшеницы, инфицированных септориозом. Обнаружено, что заражение растений пшеницы спорами S. nodorum Berk, приводит к накоплению ИУК (Хайрулин и др., 1993). Особенно существенное увеличение уровня ИУК в ходе развития болезни наблюдалось в проростках восприимчивого сорта Саратовская 29. На 6-е сутки после инокуляции содержание ИУК в инфицированных проростках было в 1,5 раза, а на 9-е — более чем в 2,5 раза выше по сравнению с контролем. У растений относительно устойчивого к септориозу сорта Диамант таких изменений в содержании ИУК не наблюдалось. В. А. Васюк (1995) в своей работе также отмечает высокую активность веществ гормональной природы в процессе патогенеза.

Активность пектолитических и целлюлолитических ферментов у больных растений, согласно литературным данным (Mehta et al., 1974; Ra-benantoandro, Auriol, 1975; Rabenantoandro et al., 1976; Wasfy et al., 1977; Anderson, Powelson, 1979;Kaur, Desphande, 1980; Sathiyanathan, Vidhyaseka-ran, 1980), как правило, выше, чем у здоровых, хотя динамика изменения активности ферментов, вызванная патогеном, во многом определяется природой как самого патогена, так и растения-хозяина. Необходимо, однако заметить, что усиление под влиянием инфекции активности может затрагивать не весь комплекс пектои целлюлолитических ферментов, а какой-либо один фермент или даже изофермент. Так, гниль растительных тканей, вызванная грибом Botrytis cinerea, всегда сопровождается выраженной активностью полигалактуроназы PG — 4, особенно в начале гниения по краю поврежденной ткани (Van der Cryssen et al., 1994).

Одним из критериев участия ферментов, фитотоксинов и фитогормо-нов, продуцируемых патогенами, в механизме инфицирования растений является способность их при экзогенном применении вызывать у растений повреждения, характерные для самого возбудителя болезни. Так, обработка стеблей и листьев растений томатов частично очищенными пектинлиазой и полигалактуроназой Verticillium albo-atrum приводит к проявлению симптомов заболевания, включая образование гелей в сосудах (Cooper, Wood, 1980). По нашим данным, ферментные препараты, выделенные из мицелия гриба S. nodorum Berk., при нанесении их на листовую поверхность вызывают повреждения, характерные для септориоза. Обработка растений раствором СаС12, способного ингибировать активность эндои экзополигалактуроназы грибов Verticillium albo-atrum и Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Cooper, Rankin, 1978; Buescher, Hobson, 1982), не только подавляет действие ферментных препаратов, но и в значительной мере снижает степень развития септориоза на изолированных листьях растений пшеницы, инфицированных S. nodorum Berk.

Все выделенные из культуры гриба S. nodorum Berk, фитотоксины, при нанесении на изолированные листья или интактные растения пшеницы не способны вызывать внешние симптомы поражения, характерные для септориоза. Вместе с тем установлено, что при добавлении в споровую суспензию S. nodorum Berk, они, особенно ФТ-1, ФТ-2 и ФТ-5,повышают степень поражения инфицированных растений пшеницы септориозом.

Согласно литературным данным (Kleiner, 1.983), ИУК, НУК, индол-3-масляная кислота, 2,4-Д и кинетин угнетают или замедляют прорастание спор Pyricularia oryzae и формирование апрессориев при прямом контакте гриба с веществом. Высокие концентрации ИУК подавляют развитие гриба Puccinia graminis f. sp. tritici (Grambov, Tucks, 1979), а пассирование гриба Fusarium culmorum на средах, содержащих этиленпродуцент этрел, приводит к ингибированию мицелиального роста, споруляции и прорастания спор (Michniewicz, Rozej, 1991; Michniewicz, 1992). Наши исследования влияния экзогенных фитогормонов на культуру гриба S. nodorum Berk, показали, что гиббереллин (100 мкг/мл) подавляет прорастание. пикноспор гриба, ингиби-рует рост гиф в длину (10−100 мкг/мл), влияет на формирование пикнид и их продуктивность. ИУК и кинетин в концентрации 10−25 мкг/мл и также подавляют рост гиф. Дальнейшее увеличение концентрации этих гормонов, как и в варианте с ГК, не приводило к усилению эффекта. В случае с АБК слабый ингибирующий эффект проявляется только при концентрации 50 мкг/мл. С увеличением концентрации АБК до 75 и 100 мкг/мл наблюдается значительное подавление роста гиф гриба S. nodorum Berk.

Анализ литературных данных показывает, что экзогенные фитогор-моны могут оказывать значительное воздействие на поражаемость растений различными болезнями. Причем данный эффект не обязательно связан с непосредственным влиянием фитогормонов на патоген. Так, в работе Н.Г.

Митрофанова и В. М. Чекурова (1983) показано, что обработка раствором гиббереллина и ауксина в концентрации 30 мг/л растений мягкой пшеницы в фазу проростков и кущения повышает поражаемость листьев бурой ржавчиной. По данным И. М. Левина (1984), развитие бурой ржавчины на растениях восприимчивых сортов пшеницы стимулируется оптимальными концентрациями гиббереллинов, ИУК, кинетина и угнетается АБК, этрелом, высокой концентрацией ИУК.

В результате проведенных нами исследований установлено, что предобработка растений пшеницы сортов Крестьянка, Кутулукская (восприимчивые) и Castan (относительно устойчивый к септориозу) фитогормонами с последующим инфицированием их S. nodorum Berk, снижает развитие септориоза в зависимости от типа фитогормона его концентрации и сорта пшеницы на 12,2 — 65,1%. Наибольший эффект наблюдается при обработке растений кинетином, за ним следуют ИУК, ГК и, наконец, АБК. Фитогормоны изменяют тип реакции сортов на патоген в сторону уменьшения, влияют на размеры некротических пятен на листьях и, вызывают тенденцию к снижению числа пикнид в расчете на единицу площади.

Таким образом, в результате’проведенных исследований с использованием в качестве объекта фитопатогенного гриба S. nodorum Berk, были получены новые экспериментальные данные, характеризующие некоторые биологические и биохимические особенности дейтеромицетов, которые могут непосредственно или опосредованно влиять на проявление ими патогенных свойств.

Установлено, что S. nodorum Berk, прекрасно растет как на природных, так и на синтетических (полусинтетических) питательных средах, не испытывает потребности в каких-либо специфических факторах роста, обладает слабо выраженной (широкой) физиологической специализацией и, напротив, ярко выраженной мутационной изменчивостью. Все это способствует лучшей адаптации гриба к условиям внешней среды и проявлению им высокой патогенности. ,.

Из приведенных данных следует, что возбудитель септориоза пшеницы — S. nodorum Berk, способен к продуцированию-всех предполагаемых биохимических факторов патогенности, а именно: комплекса пектои целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов, в частности, ИУК.

Показано, что наиболее патогенные природные изоляты и мутанты гриба S. nodorum Berk, обладают и более высокой активностью пектолитических и целлюлолитических ферментов, особенно полигалактуроназы (г=0,67) и Р-глюкозидазы (г=0,70). Они превалируют над слабопатогенными штаммами по количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксичных метаболитов, а также по количеству секретируемых в инкубационную среду фитотоксинов (ФТ-2, ФТ-5, сер. 0,34 и микофеноловаякислота). Между патоген-ностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его к синтезу и секреции ИУК во внешнюю среду обнаружена обратная корреляционная зависимость.

Исследованиями установлено, что процесс прорастания спор гриба S. nodorum Berk., с которого, как известно, начинается инфицирование растений, сопровождается усиленным продуцированием пектолитических и целлюлолитических ферментов, ксиланазы и других гидролаз, изменениями в составе изоферментов, а также активным синтезом фитотоксинов и фитогормонов, в частности, ИУК. Одновременно в значительной степени активизируется и процесс секреции ферментов, фитотоксинов и ИУК из прорастающих спор в инкубационную среду. Высокопатогенные мутанты S. nodorum Berk, по активности пектолитических и целлюлолитических ферментов, особенно полигалактуроназы, Р — глюкозидазы и Сх — целлюлазы, количеству и общему содержанию фитотоксинов и ИУК в прорастающих спорах, как правило, превосходят слабопатогенные мутанты. Подобная закономерность выявлена и в отношении интенсивности секреции ферментов и фитотоксинов из прорастающих спор в инкубационную среду. В то же время по темпам секреции ИУК во внешнюю среду споры высокопатогенных мутантов, уступают спорам слабопатогенных мутантов.

При исследовании системы «растение-хозяин-патоген» обнаружено, что инфицирование растений восприимчивого к септориозу сорта пшеницы Саратовская 29 высокопатогенным мутантом в отличие от слабопатогенного практически не вызывает на начальном этапе патогенеза каких-либо изменений в содержании ИУК, индуцирует снижение в листьях активности пек-тои целлюлолитических ферментов и, напротив, повышение активности кислой фосфатазы и, особенно, пероксидазы. С развитием болезни количество ИУК в листьях возрастает. Повышается активность полигалактуроназы, Сх — целлюлазы и (3 — глюкозидазы (7-е сутки), а затем и Ci — целлюлазы. Значительное усиление активности пероксидазы, которое наблюдалось уже через 3-е суток, сохраняется на всём протяжении опыта. Отмечено более значительное влияние мутанта и на изоферментныеспектры особенно в отношении Р — глюкозидазы и эстеразы.

У относительно устойчивого к септориозу сорта Castan инфицирование только к концу опыта повышает содержание ИУК в листьях на 20,0 -33,3%. Достоверных различий в действии слабои высокопатогенного мутантов на синтез ИУК не обнаружено. Не выявлено особых различий и в воздействии мутантов на динамику активности пектои целлюлолитических ферментов. Более значительное усиление активности пероксидазы под влиянием высокопатогенного мутанта, которое сопровождалось появлением в спектре дополнительного 10-го изофермента с Rf 0,12 — 0,15, было отмечено и на данном сорте.

Таким образом, полученные нами экспериментальные данные говорят о том, что ферменты (прежде всего пектои целлюлолитические), фитотоксины и ИУК, продуцируемые S. nodorum Berk., принимают непосредственное участие не только на начальных этапах инфицирования растений пшеницы, но и на протяжении всего процесса патогенеза септориоза вплоть до начала споруляции гриба и проявления на листьях видимых симптомов поражения. Все это дает основание к заключению, что исследованные нами пектои цел-люлолитические ферменты, фитотоксины и фитогормоны действительно являются факторами патогенности гриба S. nodorum Berk., хотя и выполняющими, по всей видимости, различные функции, -s.

Можно предположить, что ферменты, естественно, выполняют, прежде всего, инвазивные функции, а ИУК и фитотоксины — регуляторные. Действительно, ферменты, как известно, непосредственно участвуют в разрушении кутикулы (кутиназа, неспецифические эстеразы), а также в деполимеризации и гидролизе полисахаридов клеточных стенок (полигалактуроназа, р-глюко-зидаза, С и Сх-целлюлазы, ксиланаза).

ИУК является основным элементом в системе гормональной регуляции у растений. В соответствии с механизмом действия ауксина на рост растяжением ИУК проникает в клетку, взаимодействует с рецептором, индуцирует работу АТФазной Н^-помпы, что сопровождается увеличением мембранного потенциала (Полевой, 1986). По последним данным (Шишова, 1999), рецепторный комплекс ауксина в плазмалемме растительных клеток состоит из трансмембранного домена, представленного Са2+ -каналом, и ре-цепторного домена-ауксинсвязывающего белка 1. Снижение концентрации и повышение концентрации ионов Hf приводит к активации работы Н4″ -АТФазы — одного из ключевых ферментов в механизме действия ауксина.

Фитотоксины, по литературным данным, блокируют способность устьиц адекватно реагировать на изменение внешцих условий (Bousquet et al., 1976), оказывают разобщающее действие на окислительное фосфолирова-ние, сходное с действием 2,4-динитрофенола, что приводит к нарушению или прекращению биосинтеза АТФ (Bousquet et al., 1980), влияют на электрическое сопротивление плазматических мембран (Лялин и др., 1980).

Реализация участия ферментов, фитотоксинов и фитогормонов в патогенезе септориоза происходит в несколько этапов, а именно: проникновение (внедрение) гриба в растение, подавление защитных механизмов, изменение метаболизма растения-хозяина с целью создания более благоприятных для патогена условий и распространение паразита по растению.

В связи с этим, обобщая собственные экспериментальные и литературные данные, можно предложить следующую гипотетическую схему взаимодействия гриба S. nodorum Berk, и растения-хозяина на самых ранних этапах патогенеза (рис.). Споры гриба S. nodorum Berk, оседают на поверхность листьев растений, закрепляются с помощью' комплекса веществ, в том числе гликопротеинов, входящих в состав слизи, и при соответствующих условиях влажности (80−100%) и температуры начинают прорастать (1-е сутки после инокуляции).

Этот процесс сопровождается активным синтезом и секрецией из спор в инфекционную каплю гидролитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов, в частности, ИУК. Находящиеся в составе ферментов кутиназа и неспецефические эстеразы прежде всего разрушают кутикулу. Затем ИУК локально проникает через эпидермис растения-хозяина и включает мембранный механизм действия ауксина на растительные клетки (Полевой, 1986; Шишова, 1999). В результате работы данного механизма активируется Саканал и работа Н4^ -АТФазы, что в конечном счете, приводит к закислению за счет ионов ET клеточных стенок, вытеснению из них Са2+ и активации ферментов растения-хозяина. Последнее приводит к разрыхлению и размягчению клеточных стенок, что делает их более уязвимыми со стороны пекто-и целлюлолитических ферментов гриба. Наблюдающееся затем локальное разрушение клеточных стенок обеспечивает проникновение ростковых трубок S. nodorum Berk, внутрь клетки. Одновременно через образовавшиеся от-верствия в клетку попадают и фитотоксины, которые, как известно, самостоятельно не могут проникать в ткани растений.

Рис. Схема взаимодействия S. nodorum Berk, с растениями пшеницы на ранних этапах патогенеза.

Представленная схема разработана для случая активного проникновения патогена через клеточные стенки обычных эпидермальных клеток в ткал ни растений с помощью пектои целлюлолитических ферментов. Она особенно, по-видимому, применима для так называемых пузыревидных клеток (клеток растяжения), которые характерны для эпидермиса злаков и других однодольных (Эсау, 1969).

По описанной схеме, на наш взгляд, может происходить заражение и. перезаражение клеток растения-хозяина патогеном и в случае первичного его проникновения не через клеточные стенки эпидермиса, а через устьица.

Из приведенной схемы видно, что на этапе проникновения фитотоксины не выполняют активных функций. Основная их роль, если учесть свойства, описанные выше, сводится к подавлению защитных механизмов растения-хозяина, то есть обеспечению второго этапа патогенеза (1−3 сутки).

В дальнейшем (7-е и 10-е сутки) лидирующие позиции снова занимают фитогормоны и ферменты. К этому моменту в листьях растения-хозяина. (восприимчивый сорт) значительно возрастает содержание ИУК и повышает-. ся активность пектои целлюлолитических ферментов, а возможно, и других гидролаз. Если учесть, что грибы p. Septoria способны к продуцированию и цитокининов (Васюк и др., 1996 б), то тем самым создаются все необходимые предпосылки к изменению метаболизма растения-хозяина и обеспечению оптимальных для роста и развития патоген^ условий.

Распространение патогена по тканям растения-хозяина обеспечивается, на наш взгляд, тем же ферментативно-гормональным механизмом, который используется при первичном внедрении гриба. С той лишь разницей,. что при перемещении гиф межклетно (без захода в клетку) вполне достаточно, по-видимому, одного ферментативного аппарата.

Представленная схема или модель взаимодействия возбудителя септориоза — гриба S. nodorum Berk, и растений пшеницы на уровне пектои целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов (ИУК), разработанная на основе результатов собственных исследований и данных литературы, может служить теоретической основой направленного поиска новых средств химической защиты посевов пшеницы от септориоза.

С учетом изложенного в составленных нами «Рекомендациях.» (приложение 3) с целью создания новых фунгицидов предлагается вести синтез и скрининг соединений, способных: а) ингибировать активность пектолитических и целлюлолитических ферментов гриба S. nodorum Berk.- б) препятствовать действию фитотоксинов, детоксицировать или подавлять их синтезв) выступать в роли антиауксина.

Кроме того, данная модель, особенно с учетом реакции сорта Castan на патоген, может быть использована и для создания устойчивых к септориозу сортов пшеницы. Одним из наиболее вероятных путей решения этой задачи является, на наш взгляд, использование фитотоксинов, продуцируемых S. nodorum Berk., в биотехнологии и клеточной селекции в качестве селектирующего фактора. С целью проверки данного предположения препараты фитотоксинов были переданы нами в Институт молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина и получены предварительные положительные результаты, позволяющие судить о действии фитотоксинов на клеточные культуры различных сортов пшеницы (приложение 4). Подобные данные были получены и другими авторами (Гирко и др., 1993; Keller et al., 1994).