Разработка технологии получения и фармако-токсикологические исследования бета-каротина

Актуальность проблемы. Одной из задач, стоящих перед фармакологической наукой и практикой, является поиск средств, повышающих сопротивляемость организма человека и животных вредным воздействиям окружающей среды. На организм человека и животных действуют новые антропогенно-экологические факторы, которые приводят к ослаблению сопротивляемости организма, нарушению обмена веществ, возникновению различных заболеваний, в том числе онкологических. В связи с этим в мире растет спрос на натуральные природные средства профилактики и лечения заболеваний человека и животных.

Важной задачей науки является создание технологий производства и применения биологически активных веществ. Одним из таких веществ является природный бета-каротин. Дефицит бета-каротина в организме человека и животных до сего времени, в основном, восполняется за счет использования овощей, фруктов, зеленых частей растений, в которых он содержится.

Интерес к всестороннему изучению бета-каротина возник после того, как было обнаружено, что кроме провитаминной активности он участвует в ряде сложных биохимических процессов в организме (Bendich Д., 1988). Он обладает антиоксидантными, антиканцерогенными, антимутагенными и иммуностимулирующими свойствами (Плесцитый К.Д., 1978, 1981; Сергеев А. Г., 1986; Букин Ю. В., 1986, 1995; Peto R., et al., 1981, Krinski N.I., 1989, 1994, 1998; Mayer H., Bollag W., Hanni R. et al., 1978, Bendich A., Olson J.A., 1988, Zhang Z.W. et al., 2000). Поэтому препараты бета-каротина находят широкое применение в медицине, ветеринарии и животноводстве при профилактике и лечении болезней, связанных с нарушением обмена веществ (Сергеев А.Г., 1983, Зернов В. Г., 1979; Славянская Т. А., Сепиашвили Р. И., 1999; Букин Ю. В., 1992, Дорогокупля А. Г., Троицкой Е. Г., Адильгиреева JI.X. и др., 1979; Буюклинская О. В., 1992; Mathews-Roth М.М., 1982; Riegger С.В.,.

1990; Alexander M., Newmark H., Miller R.G., 1985; Duthie G.G., 1990; Singkh Vishwan, 1994; Hennekens Charles H., 1997, 1999).

В условиях растущей потребности в препаратах бета-каротина важным является вопрос изыскания его источников. Недостатком получения бета-каротина из растительного сырья является его дефицит, низкое содержание бета-каротина в нем, зависимость его накопления от природно-климатических условий, сложность регулирования этого процесса. Очевидными преимуществами обладает метод получения бета-каротина микробиологическим синтезом из культуры гриба Blakeslea trispora.

Исследования по получению бета-каротина из этой культуры были проведены Казаряном Р. В. (1978, 1990) и направлены на улучшение качества получаемого масляного экстракта и совершенствование метода извлечения бета-каротина из мицелиальной массы с целью получения кристаллического I бета-каротина. Настоящая работа выполнена в развитие этих исследований и посвящена разработке технологии производства фармакопейной субстанции бета-каротина из мицелиальной массы культуры Blakeslea trispora и использование ее при разработке лекарственного и ветеринарного препратов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является разработка технологии производства субстанции природного бета-каротина из мицелиальной массы культуры гриба Blakeslea trispora. Разработка на ее основе лекарственного и ветеринарного препаратов, исследование их фармако-токсикологических свойств и лечебно-профилактической эффективности в медицине, ветеринарии и животноводстве.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи: I.

— разработать способы, позволяющие получить каротинсодержащую мицелиальную массу с высоким содержанием бета-каротина;

— изучить состояние бета-каротина в клетке мицелиальной массы в процессе ферментации, изучить качество мицелиальной массы и выделенного из нее липидно-каротинового комплекса;

— изучить условия получения высококонцентрированных растворов бста-каротина в растительном масле, состав и распределение компонентов липидной системы при кристаллизации бета-каротина, и разработать способы очистки кристаллов и масляного экстракта;

— разработать технологию получения субстанции кристаллического бета-каротина и стандартизировать показатели качества;

— разработать технологию производства препарата каролин лекарственного и ветеринарного назначения и методы контроля их качественных показателей;

— дать характеристику основных фармако-токсикологических свойств препаратов;

— разработать основные показания к применению препарата каролин в медицине, ветеринарии и животноводстве.

Научная новизна работы. Получен новый штамм гриба Blakeslea tris-pora КР 76+ КР 86* и разработан состав питательной среды, в которой в качестве источников белков, жиров, углеводов, антиоксиданта и стимулятора ка-ротиногенеза используются отходы масложировой и крахмалопаточной промышленности, а также отходы, полученные при производстве кристалличеI с ко го бета-каротина.

Изучено состояние бета-каротина в клетке Blakeslea trispora в процессе ферментации и разработан способ извлечения из мицелиальной массы бета-каротипа, растворенного в клеточных липидах.

На основе результатов исследований состава линидов промышленных образцов мицелиальной массы и свойств кристаллического бета-каротина, разработан способ извлечения его противоточной многоступенчатой экстракций, в системе твердое тело-жидкость, растительным маслом. Определены основные параметры экстракции.

Изучен процесс кристаллизации бета-каротина из масляных экстрактов и состав образующихся осадков. На основе этих данных, разработаны способы очистки кристаллов бета-каротина и масляных экстрактов от сопутствующих веществ.

Стандартизированы показатели качества субстанции кристаллического бета-каротина, разработаны методы контроля.

Выявлено влияние размеров и формы кристаллов на скорость растворения бета-каротина в растительном масле. Изучена кинетика окисления бета-каротина в растительном масле, в растворе органического растворителя и в кристаллическом виде.

Дана характеристика физико-химических свойств препарата каролин лекарственного и ветеринарного качества и определены методы контроля.

В опытах, проведенных на животных, изучены изменения клинических, гематологических, биохимических, патоморфологических показателей, дана I оценка острой и субхронической токсичности, аллергенных и иммунотоксичных свойств, местно-раздражающего действия, объективно отражающих безвредность каролина.

Выявлена профилактическая и терапевтическая эффективность лекарственного препарата каролин, при заболеваниях, связанных с усилением свобод норад и калы 1ых реакций.

По результатам выполненной работы получено 3 авторских свидетельства и 14 патентов Российской Федерации.

Практическая значимость. На основе проведенных исследований, разработана технология промышленного производства субстанции кристаллического бета-каротина и рафинированных масляных экстрактов его, а также I технология получения каролина лекарственного и ветеринарного качества.

Как лечебно-профилактическое средство, каролин медицинского качества, рекомендуется применять, при состояниях, характеризующихся усилением свободнорадикальных реакций (воздействие малых доз радиации, рентгенологическое обследование, лучевая и химиотерапия, при опухолевых заболеваниях, лазерная терапия, контакт с ядохимикатами, иммунодефицитные состоянии). В качестве лечебного средства каролин применяют в комплексной терапии, связанной с нарушением регенерации эпителия (язвенной болезни желудка, и 12-перстной кишки, эрозивного гастрита, дуоденита, гепатита, холецистита, неспецифического язвенного колита, дисбактериоза, при острых респираторных заболеваниях). При хронических бронхолегочных и гинекологических заболеваниях, заболеваниях кожи (раны, ожоги, отмороI жения, трофические язвы, кератозы, псориаз, экзема и другие дерматозы). (Инструкция по применению препарата каролин, регистрационный номер 95/292/6, утвержденная Фармакологическим государственным комитетом Минздрава РФ).

В качестве лечебно-профилактического средства, каролин ветеринарного качества рекомендуется применять для нормализации обмена веществ, при профилактике задержания последа, послеродовых эндометритов и нарушений воспроизводительной функции у коров и свиноматок, повышения молочности свиноматок и сохранности поросят, повышения выводимости и сохранности цыплят, улучшения качества яиц. (Наставление по применению препарата каролин в ветеринарии, регистрационный номер ПВР-2−4.0/541, I утвержденное Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации).

Результаты исследований могут быть использованы, при составлении руководств и справочников по фармакологии, терапии и профилактике заболеваний человека и животных.

Внедрение результатов исследований. Результаты исследований нашли отражение в документах, утвержденных (согласованных) Департаментом Государственного контроля качества, эффективности и безопасности лекарственных средств и медицинской техники и Фармакопейным государственным комитетом: Бета-каротин — Фармакопейная статья ФС 42−3687−99 от 03.02.2000; Каролин — Фармакопейная статья 42−3868−99 от 03.02.2000 г.- Инструкция по применению препарата 'каролин, регистрационный номер

95/292/6 от 12.09.1995 г.- промышленный регламент на производство субстанции бета-каротинапромышленный регламент на производство препарата каролин, рекомендованные к утверждению технологической комиссией НПО «Витамины» (г. Москва).

Результаты исследований нашли отражение в документах, утвержденных (согласованных) Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации: Каролин — Технические условия ТУ 9 141 003−41 341 380−01- Наставление по применению препарата каролин в ветеринарии, регистрационный номер ПВР-2−4.0/541.

Препарат каролин медицинского качества выпускается ЗАО «Роскар-фарм» по лицензии Минздрава РФ с 1996 года и реализуется через аптечную I сеть.

Препарат каролин ветеринарного качества выпускается ЗАО «Роскар-фарм» с 1997 года и реализуется в ряде регионов РФ.

Апробация работы. Основные научные результаты работы были доложены на Всесоюзной конференции «Фосфолипиды растительных и микроб-пых липидов — современный уровень технологии и исследований», г. Краснодар, 1979 г.- па конференции «Использование биомассы микроорганизмов для пищевых целей», г. Пущино, 1984 г.- на международной научно-технической конференции «Улучшение качества и расширение ассортимента при маслодобьгвании и маслопереработке», г. Пловдив, НРБ, 1985 г.- на международной научно-технической конференции «Новые тенденции в развитии мало-жировой промышленности», НРБ,'1987 г.- на Всесоюзном совещании «Реализация научно-технической программы «Витаминизация пищи», г. Углич, 1990 г.- на У1 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», г. Москва, 1999 г.- на научно-практической конференции посвященной 55-летию ГУ Краснодарской НИВС, г. Краснодар, 2001 г.- на 5 Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», г. Санкт-Петербург 2001 г.- па междупародной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях», г. Воронеж, 2002 г.- на Всероссийской научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии, г. Казань, 2002 г.

На защиту выносятся следующие положения: I.

— исследования по разработке технологии получения фармакопейной субстанции кристаллического бета-каротина из мицелиальной массы гриба Blakeslea trispora;

— физико-химические характеристики и контроль субстанции бета-каротина;

— исследование физико-химических свойств субстанции бета-каротина и разработка на ее основе технологии производства препарата каролин лекарственного и ветеринарного назначения;

— физико-химические свойства и контроль препарата каролин медицинского и ветеринарного качества;

— исследования острой и субхронической токсичности каролина, аллерI генных и иммунотоксичных свойств;

— исследования по применению препарата каролин в качестве лечебно-профилактического средства в медицине, ветеринарии и животноводстве;

— результаты внедрения препарата каролин в промышленное, фармацевтическое и сельскохозяйственное производство.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 научных работ в том числе: 1 монография, 14 патентов и 3 авторских свидетельства. I.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бета-каротип и каротиноиды: распространение в природе и физико-химические свойства.

Бета-каротип — биологически активное вещество природного происхождения, относящееся к каротиноидам, представляющим собой многочисленную группу желто-оранжевых пигментов, синтезируемых высшими растениями, водорослями, грибами и бактериями.

У высших растений и водорослей бета-каротин локализован в хромопластах. У грибов каротиноиды встречаются только у некоторых видов, например, Blakeslea trispora синтезирует бета-каротин в мицелии. У бактерий I каротиноиды локализованы в клеточных мембранах.

Человек и животные не способны синтезировать каротиноиды и получают их с растительной пищей, в которых на долю бета-каротина приходится до 30% (Карнаухов В.Н., 1988).

С начала XIX века каротиноиды привлекают внимание ученых. В 1831 г. Вакенродер сообщил о выделении из моркови ярко-красного пигмента, названного им каротином, а позднее в 1837 г. Берцелиус из осенних листьев извлек желтые пигменты, получивших название «ксантофиллы» (кислородные производные каротина).

В настоящее время идентифицировано около 600 каротипоидов. Среди них лишь около 10% обладают активностью витамина A (Olson J.А., 1994). I.

Предшественниками витамина, А могут быть каротиноиды, имеющие в молекуле хотя бы одно бета-иононовое кольцо. Большинство распространенных каротипоидов лишены бета-иононового кольца: ликопин, лютеин, кантаксан-тин, неоксантин и др., и не способны превращаться в витамин A (Johnson E.J., Qin J., Krinsky N.I.,. Russell R. M, 1993; Parker R.S., 1997; Desobry S.A., Netto F.M., Labuza T.P., 1998). Каротиноиды, способные к превращению в организме в витамин А, называются провитаминами — предшественниками витамина А. Среди производных каротиноидов, встречающихся в природе, провитаминными свойствами обладают каротин, криптоксантин, мутатохром, мик-соксантин, афонии и др. (Душейко Л.Л., 1989; Palan P.R., Mikhail M.S., Goldberg G. Let al., 1996; Margalith P.Z., 1999; Huang C., Tang Y.L., Chen C.Y. et al., 2000).

Еще в 1930;1931 г. г. Kapep обнаружил симметричность молекулы бета-каротина и показал, что она состоит из двух молекул витамина А, поэтому среди других каротиноидов бета-каротин обладает наибольшей биологической активностью (Olson J.А., 1989; Eugster С.Н., 1992). Эта «провитаминная концепция», благодаря своему фундаментальному научному и высокому прикладному значению, оказала существенное влияние на направление изучения функций каротиноидов (Isler О., 1971). И только в начале 80-х годов, благодаря многочисленным исследованиям биохимии каротиноидов, расширяющим понимание роли и важности их для организма животных и человека, было показано, что бета-каротин является не только предшественником витамина А, но и самостоятельным активным участником биохимических проI цессов, протекающих в организме живых существ (Bendich А., 1988).

По химической структуре каротиноиды относятся к ненасыщенным соединениям терпенового ряда, преимущественно с 40 углеродными атомами в молекуле, построенными по единому структурному принципу. По концам полиеновой цепи, состоящей из 4 изопреноидных остатков, расположены циклогексановые кольца или соответствующие им алифатические остатки.

Каротин является углеводородом (С40Н50). Его молекулярная масса составляет 536,88 дальтон. Он существует в виде 3 структурных изомеров: а, р, у-каротина. Наиболее распространенный из них Р-каротин относится к классу тетратерпенов, углеродный скелет которого построен из четырех С5- изопре-новых фрагментов. С двух сторон молекула ограничена шестичленными кольцами, называемыми Р-иононами. По системе IURAC Р-каротин обозначается как Р, Р-каротин. У акаротина одно из бета-иононовых колец видоизменено, у у-каротина — раскрыто (Бриттон Г., 1986 г.).

Хромофор, ответственный за поглощение каротином видимого света, представляет собой систему сопряженных двойных связей. Система 11 сопряженных двойных связей делает каротин чрезвычайно подверженным окислительному обесцвечиванию под действием кислорода воздуха.

Считается, что бета-каротин, как ненасыщенный углеводород самоокисляется воздухом и легко разрушается под действием ряда факторов: кислорода, света, температуры, субстрата, в котором он растворен, рН среды, наличие ионов металлов и радиационного облучения. Однако, такое утверждение не очень определенное. В зависимости от условий хранения и целей примеI нения бета-каротина или препаратов на его основе, устойчивость носит различный характер.

Фундаментальные исследования по изучению свойств каротиноидов и влиянию на них различных факторов проводились в 50-е годы под руководством Б. Г. Савинова (Савинов Б.Г., 1948). В процессе исследований было установлено, что основным фактором, влияющим на окислительный распад бета-каротина, является кислород воздуха. Остальные факторы являются вторичными. В отсуствие же кислорода наблюдается изомеризация бета-каротина: влияние температуры выше 50 °C приводит к образованию цис-изомеров (Михайловина А.А., 1952, Иосикато Иото, 1987). Действие света средней и коротковолновой части спектра также способствует образованию I изомеров. В работе (Chen Т.М., Chen S.T., 1994) приведена кинетическая модель для исследования термоизомеризации и катализируемой фотоизомеризации полностью транс-бета-каротина.

Провитаминная активность структурных и отдельных пространственных изомеров каротина различна. Наиболее выраженной активностью обладает транс-транс-форма любого изомера. Среди структурных изомеров наибольшей активностью, обладает бета-каротин, активность его принимают за 100%. Соответственно, альфа-каротин — 53% и гамма-каротин — 52%. Меньше выражена активность у цис-изомеров: моно-цис-изомер бета-каротина.

38%- моно-цис изомер альфа-каротина 13% и моно-цис-изомер гамма-каротина 19% (Березовский В.А., 1973). Объясняется это тем, что молекула каротина в результате транс-цис-изомеризации теряет свою первоначальную I структуру, что затрудняет действие ферментной системы, участвующей в превращении в витамин A (Hagiwara Т., Yasuno Т., Funayama К., 1998; АЬа-husain M.A., Wnght J., Dickcrson J.W., 1998; Godoy H.T., Rodriguez-Amaya Delia В., 1998). В отличие от бета-каротина цис-формы ликопина хорошо абсорбируются (Dcsobru S.A., Netto F.M., Labuza Т.Р., 1998).

Сравнение цис-бета-каротина и транс-бета-каротина проведено на добровольцах при назначении препарата из водоросли Dunaliella bardawil, состоящего из равных количеств циси полного транс-изомера бета-каротина. Через две недели после ежедневного приема препарата концентрация трансбета-каротина в плазме возрастала в 4 раза, через месяц в моноядерных клетках — в 2−3 раза. В то же время цис-бета-каротин в клетках крови не был обI наружен, а в плазме повышение его составило 10% от уровня транс-изомера (Tamai Н., Murata Т., Morinobu Т., 1994). Для объяснения этого выдвигаются различные гипотезы (Stahl W., Schwartz W., Sies H., 1993). Низкая биологическая активность цис-изомеров бета-каротина обнаружена и в экспериментах на крысах (Weiser Н., Biesalski Н.К., 1994). Считают, что изомеризация транс-формы бета-каротина в цис-, которая может происходить при технологических операциях, снижает биодоступность и биологическую активность бета-каротина (Erdman J.W., Bierer T.L., Gugger Е.Т., 1994). Однако существует и другое мнение. В работах (Ben — Amotz et al., 1989), показано, что 9 cisизомер бета-каротина, абсорбируется из желудочно-кишечного тракта в 10 раз быстрее, чем форма «all-trans».

Ряд работ (Савинов Б.Г., Михайло’вина А.А., 1953; Савинов Б. Г., Сви-щук А.А., 1950; Шнайдман JI.O., Дульчина Б. М., Павлова A.M., 1954; Буй Зуй Хьонд, Танчев С., Манчев Е., 1981) посвящен влиянию металлов на процесс окисления бета-каротина. Установлено, что наиболее сильным катализатором процесса окисления являются ионы меди. Важным фактором, влияющим на сохранность бета-каротина, является среда, в которой он растворен. В ряде работ (Михайловина А.А., Савинов Б. Г., 1949, 1950; Алексеев А. Б., Гагарина А. Б., Вакулова JI.A., 1972), изучалось влияние различных растворителей на сохранность бета-каротина в зависимости от концентрации его в растворах. В результате установлено, что более стабильными являются растворы в петро-лейном эфире. В хлорорганических растворителях, растворимость в которых бета-каротина наибольшая, наблюдается его интенсивное разрушение. Эти I же выводы подтверждаются и в более поздних работах (Dauidek J., Janicek G., 1964; Szokolay A., Wildbrclt G., Benncze K., 1972).

Исследование процесса окисления бета-каротина в растворителе и твердых пленках в присутствии инициаторов и различных ингибиторов радикальных процессов (Алексеев Э.В., Финкельштейн Б. И., Вакулова JI.A., 1971; Гагарина А. Б., Касаикина О. Т., Эмануэль И. М., 1973, 1970; Алексеев Э. В., Гагарина А. Б, Вакулова JI.A., 1972; Финкельштейн Е. И., Алексеев Э. В., Козлов Э. И., 1973,1974; Кудрицкая С. Е., 1990) выявили кинетические закономерности, характерные для радикальных цепных процессов.

Кинетика и механизм окисления кристаллического бета-каротина в органическом растворителе, представлены в работе (El-Tinau A.N., Chichester I.

С., 1970). Проведенный авторами анализ известных результатов показал, что на место начала реакции окисления в молекуле бета-каротина влияет не только плотность электронов, но и размеры и реакционная способность окисляющего агента. Кислород в перекисных радикалах или оксидах металлов, обладает высокой реакционной способностью, в этом случае, различия в реакционной способности отдельных частей молекулы бета-каротина не имеют существенного значения. Окисление бета-каротина молекулярным кислородом, благодаря небольшому размеру молекулы кислорода и меньшей реакционной способности ее в сравнении с перекисным радикалом, сохраняет конкурирующую реакционную способность между различными атомами кислорода в молекуле бета-каротина, поэтому окисление молекулярным кислородом, отражает присущую молекуле бета-каротина реакционную способность. Предложен механизм окисления бета-каротина в растворителе. Показано, что процесс окисления его в толуоле не является автокаталитическим процессом, как это наблюдается при самоокислении жиров. Изучено влияние температуры на скорость окисления и определена энергия активации окисления бета-каротина, которая оказалась ниже, чем у свободной линолевой кислоты и ее эфира. Низкая энергия активации для окисления бета-каротина указывает на предпочтительность этой реакции перед реакцией самоокисления линолевой кислоты.

В работе (Takakashi Л., Shibasaki-Kitakawa N., Yonemoto Т., 1999) проведено изучение процесса автоокисления бета-каротина в н-декапе при различной температуре и концентрации растворенного кислорода. Предложена I новая кинетическая модель этого процесса на основе автокатализировапной цепной реакции свободных радикалов. Проведена оценка 4-х неизвестных констант протекающих реакций. Модель может быть использована для прогнозирования автоокисления бета-каротина в растворителях при низкой температуре.

Кинетика окислительного расщепления полностью транс-бета-каротина и других каротиноидов приведена в работе (Henry L.K., Catignani G.L., Schwartz S.L., 1998).

Установлено, что продуктами реакции окисления бета-каротина является бета-каротин 5,6-моноэпоксид и его изомер и бета-каротин 5,8-моноэпоксид и его изомер, которые были идентифицированы с помощью ТСХ и видимых спектров поглощения (Kennedy К.А., Liberbei D.S., 1991;Mordi Raphael С., Malton Sohn С., 1991; Zurcher Marcel, Niggli Urs A. et al., 1997). Каротиноиды такого типа содержатся в плодах и ягодах (Кудриц-кая С.Е., 1990). Преобладающее образование эпоксидов, является свидетельством того, что окисление бета-каротина начинается с наименее устойчивой двойной связи ядра и постепенно распространяется по пространственно затрудненным непредельным связям. Центральная двойная связь бета-каротина, свободная от всех помех, благодаря двухстороннему взаимодействию полиеновой сопряженной цепи, по своему характеру приближается к одинарной связи и наиболее устойчива к окислению.

В связи с практической значимостью растворов бета-каротина в масле, изучение процесса окисления и стабилизации его в таких сложных системах представляет особый интерес. Решению этого вопроса посвящены многочисленные исследования (Suzuki Toshihisa, Usuki Riichiro, Kaneda Takashi., 1989; Jung M.Y., Min D.B., 1991; Карагодина Э. В., Лупинович В. Л., Левачев M.M., 1993; Демидов И. Н., Зябченкова Л. К., Фомин О. И., 1995; Гагарина А. Б., Ев-теева Н.М., Смурова Л. А., Бобнева С. М., 1992, 1996; Денисюк Е. Н., Воробьева В. М., 1997). Ранние работы авторов, изучавших поведение бета-каротина в маслах и жирах, были направлены на решение вопроса: является ли бета-каротин положительным или отрицательным фактором процесса окисления жиров или близких к ним веществ (Herrisset А., 1948, Hirsch R., 1956). Решение этого вопроса осложняется многокомпонентностью системы, наличием в ней компонентов, влияющих на процесс окисления бета-каротина: степень I неиасыщенности жиров и масел, наличие перекисных соединений и их изомерный состав. Известны работы, в которых исследовали влияние различных факторов: перекисных соединений, кислорода, токоферолов, степени ненасыщенности субстрата, на процесс окисления бета-каротина, температуры (Carnevalc J., Cole Е., Crank G., 1979; Lonzin M., Jakobsberg В., 1964; Terao J., Jamanzchi R., Murakami H., 1980; Шершнева E.B., Рудакова О. Б., 1996, 1997; Болотов B.M., Рудаков О. Б., Шершнева Е. В., 1997, 1998; Perez Galvez A., Gar-rido Fernandez J., 1997; Денисюк E.H., Воробьева Б. М., Бекетова H.A., Спири-чев В.Б. и др., 1998).

В работах (Min D.B., Lee Е.С., 1988, 1990) было изучено непосредственное влияние степени ненасыщенности жира на потери бета-каротина в растворе. Опыты проводились под воздействием белого флуоресцентного свечения, т. е. исключалось вовлечение свободного кислорода в процесс. Установлено, что в катализированном флуоресцентным светом самоокислении, потери бета-каротина падают в следующем порядке: лаурат >оле-ат>линолеат. Самокаталитический характер кривых с отмеченными периодами индукции и возрастанием индукционных периодов дали возможность предположить, что процесс протекает свободнорадикальный. При этом необходимо учитывать, что реакцию с кислородом ускоряет поглощение света в видимой области, в отличие от ультрафиолетового источника. В том случае, когда окисление протекает как свободнорадикальный процесс, заметное влияние ненасыщенности жирно-кислотных эфиров проявляется в том, что они играют роль субстратов, прерывающих цепной механизм, причем аптиI окислительные свойства возрастают при увеличении ненасыщенности.

В работе (Lonzin М., Jakobsberg В., 1964) изучалось одновременно окисление токоферолов и бета-каротина в эфирах насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. В результате исследований было установлено, что при добавлении к метиловым эфирам одного бета-каротина, его разрушение в процессе окисления происходит достаточно быстро и ненасыщенный субстрат не оказывает существенного влияния. При добавлении одного токоферола его разрушение происходит быстрее в ненасыщенных метиловых эфирах, чем в насыщенных. Авторы объясняют это тем, что двойные связи ненасыщенных метиловых эфиров окисляются легче, чем токоферол. При этом образуются перекиси, которые восстанавливаются токоферолом. При одновременном окислении токоферола и каротина в метилстеарате, происходит значительное торможение процесса разрушения бета-каротина, но ускоренное разрушение токоферола, вследствие того, что сначала каротин временно связывает кислород воздуха, а затем восстанавливается в присутствии токоферолов. Токоферолы разрушаются быстрее в ненасыщенных метиловых эфирах, как в присутствии каротина, так и в его отсутствие (Тсгао J., Ja-manuchi R., 1980).

В работе (Pesek С.А., Warthesen J.J., 1990) показано, что бета-каротин может участвовать в фотохимических процессах. Изучено влияние хлорофилла, бета-каротина, токоферолов на окисление масел. Показано, что бета-каротин в этих процессах является эффективным антиоксидантом, захватыI вает синглетные атомы кислорода и замедляет окисление масла на свету. В смеси с токоферолами проявляется синергический эффект, который резко снижает степень окисления масла.

Таким образом, бета-каротин может действовать как мощный ингибитор фотоокислительного процесса в растительных маслах. Токоферолы же, особенно 5-токоферол, должны находиться в комплексе с бета-каротином, чтобы предотвратить его распад.

В связи с тем, что бета-каротин в значительных количествах содержится в пальмовом масле (до 0,2%), большое количество работ посвящено изучению его поведения в таких маслах (Hinnekeus U., Gooris A., Carlier М.,.

1976; Mudambi S., 1977; Rajagopal M., Mudambi S., 1978; Onuang J., Danu U., i.

Chang S., 1980). В работе (Mearo M.L., Weir G.D., 1976) дается анализ различных факторов, влияющих на устойчивость пальмового масла к окислению, определен порядок реакции, энергия активации, идентифицированы некоторые продукты окисления. В результате авторы делают вывод о том, что бета-каротин в пальмовом масле является катализатором процесса окисления.

Не смотря на значительное количество публикаций, посвященных проблемам окисления и стабилизации бета-каротина, кинетика и механизм окислительного распада этого соединения изучена недостаточно. Сведения об устойчивости бета-каротина и его роли в процессе окисления масел носит противоречивый характере. Анализ известных литературных источников не дает возможности однозначно ответить на вбпрос: является ли бета-каротин положительным или отрицательным фактором в процессе окисления в маслах. В настоящее время однозначно установлено, что в фотохимических процессах бета-каротин действует, как очень эффективный антиоксидант. Во всех других случаях, решая вопрос о механизме окисления бета-каротина, необходимо конкретно рассматривать среду, в которой он растворен, состояние его в этой среде, а также факторы, влияющие на процесс окисления, как самого масла, так и бета-каротина в нем.

Кристаллический транс-бета-каротин относится к трудно растворимым веществам. Данные по растворимости бета-каротина в органических растворителях немногочисленны и разноречивы. Различие данных объясняется неодинаковой степенью чистоты исследуемых кристаллов, наличием в их соI ставе кроме Р еще, а и у изомеров. Исследовали степень растворимости бета-каротина в бинарных смесях кетонов. При этом было установлено, что во всех изученных смесях растворителей зависимости растворимости от состава проходят через максимум (Treszczanowicz F. et al., 2001). Растворимость его в растительных маслах не превышает 0,1% (Bauerfcind J.C., Smith E.G., Bunnell R.H., 1958; Caunsen I.N., Kcnstubb C.I., 1983). Низкая растворимость бета-каротина в растительных маслах, с одной стороны, и необходимость получения концентрированных растворов для производства лекарственных и ветеринарных препаратов, с другой стороны, приводит к необходимости поиска путей и способов повышения растворимости бета-каротина в жировых продуктах.

Растворимость бета-каротина в растительных маслах была исследована А. А. Михайловиной и Б. И. Савиновым. В результате было установлено, что на растворимость бета-каротина природа масла не оказывает влияния. Диапазон растворимости кристаллического бета-каротина в различных растворителях представлен в таблице 1.

Таблица 1.

Характеристика растворимости кристаллического транс-бетакаротина.

Растворимость, 24 °C Весовые %.

Растительные масла 0,05−0,1.

Апельсиновое масло холодного 0,5−1,0 прессования.

Этанол следы.

Пропиленгликоль нерастворим.

Глицерол нерастворим.

Вода нерастворим.

Хлороформ 3,0−5,0.

5. ВЫВОДЫ I.

1. Для производства мицелиальной массы, содержащей до 4,5% бета-каротина, получена новая высокоэффективная пара штаммов КР 74+ и КР 86″ культуры гриба Blakeslea trispora, способная утилизировать питательную среду, состоящую из отходов масложировой, крахмалопаточной промышленности и производства бета-каротина.

2. Установлено, что бета-каротин накапливается в клетке гриба в процессе ферментации в виде кристаллов (85−87%) и в растворе клеточных липидов (13−15%). Для извлечения бета-каротина, растворенного в клеточных липидах, разработан способ прессования мицелиальной массы при температуре 40 °C и давлении 20 Мпа. Для извлечения кристаллического бета-каротина разработаны способ и аппарат для экстракции его растительным маслом, противотоком, в три ступени, при температуре 100 °C, времени экстракции на одной ступени — 35 минут, соотношении растительное масло: мицелиальная масса — (в зависимости от исходной активности) от 1,5:1 до 2,4:1.

3. Установлено, что кристаллизация бета-каротина идет паралле-лельно с процессом осаждения на его поверхности сопутствующих веществ и нейтрального жира. На основе этих данных разработан способ и устройство для очистки кристаллов бета-каротина путем омыления жировых компонентов 1−1,5% II раствором щелочи при температуре кипения смеси.

Для улучшения качества масляных экстрактов бета-каротина, остающихся после отделения кристаллов, разработан способ очистки их от сопутствующих веществ противоточной двухступенчатой экстракцией этанолом в соотношении масляный экстракт бета-каротина: этанол 1:2 и температуре процесса на первой ступени — 20−25 °С, на второй — 45−50 °С.

4. Разработана технология производства и стандартизировано качество новой отечественной субстанции для производства лекарственных средств: бета-каротин. Содержание действующего вещества в ней составляет не менее 96%. Контроль качественных характеристик препарата осуществляется в соответствии с разработанным методами и определяется описанием, растворимостью, подлинностью, родственными примесями, поглощающими примесями, температурой плавления, потерей в массе при высушивании, сульфатной золой, тяжелыми металлами, микробиологической чистотой.

5. Каролин медицинского и ветеринарного качества являются новыми отечественными препаратами природного происхождения. Содержание бета-каротина в них составляет 0,1% и 0,18% соответственно. Контроль качественных показателей осуществляется в соответствии с разработанными методами и определяется по описанию, подлинности, плотности, показателю преломления, кислотному числу, перекисному числу, микробиологической чистоте.

6. Проведенное исследование общетоксических свойств каролина при однократном и длительном, в течение одного-трех месяцев применении в дозах, превышающих терапевтические в 6 и 30 раз, не вызвало достоверных изменений исследуемых показателей опытных животных в сравнении с контрольными. Изучение аллергенных и иммунотоксичных свойств каролина различными методами показало, что препарат, при многократном местном и парентеральном введении, не оказывает аллергизи-рующего действия и не проявляет иммунотоксических свойств. Каролин не оказывает вредного местного действия, не изменяет вкусовых и других качеств мяса.

7. Фармакодинамика каролина характеризуется активизацией основных видов обмена веществ, в том числе белкового — за счет повышения уровня общего белка на 7,2−33,1% и его фракций, витаминного — за счет повышения уровней витаминов А, Е и В2и каротина. Он повышает общую неспецифическую резистентность организма животных за счет повышения бактерицидной и лизоцимной активности, увеличения у-глобулиновой фракции сыворотки крови.

8. Фармакокинетика каролина характеризуется увеличением содержания витамина, А (на 14,2−88%) и каротина (2−3,3 раза) в сыворотке крови, в печени — витамина, А (на 10,4−63%) и каротина на (19,5−41%).

9. Каролин оказался эффективным в лечении заболеваний, связанных с усилением свободнорадикальных реакций:

— при лечении эндометриоза применение препарата обеспечило нормализацию общего холестерина, холестерина ЛПНП и МДА, уменьшило содержание холестерина ЛПОНП на, 17%, триацилглицеринов на 15%, белково-липидного индекса ЛПВП на 22%. Препарат на 63,6% повысил АОА сыворотки крови, в сравнении с контролем после лечения;

— при лечении больных прогрессирующей стенокардией, применение каролина в сочетании с ВЛОК ГНЛ, привело к уменьшению содержания МДА в плазме крови на 19,5%, повышению АОА на 25,7%, уменьшению накопления МДА в эритроцитах на 26,9% и повышению перекисной устойчивости эритроцитов на 17,8%.

— применение каролина при лечении больных инфильтративной формой туберкулеза ослабляет побочное гепатотоксическое действие противотуберкулезных препаратов, оказывает выраженное гепатопротекторное действие. I.

10. Ветеринарный каролин эффективно предотвращает развитие гиповитаминоза, А у поросят, телят, кур-несушек и цыплят. У животных и птиц повышается содержание каротина и витамина, А в сыворотке крови.

Каролин показан при послеродовых осложнениях у крупного рогатого скота и свиней:

— иод влиянием препарата, введенного внутримышечно 2−3 раза до и после отела с интервалом 7−10 дней, уменьшается заболеваемость коров задержанием последа (па 10−14,5%), послеродовым эндометритом (1022,4%), гипофункцией яичников (на 8,8 — 10,1%).

— препарат предупреждает заболевание свиноматок синдромом мет-рит-мастит-агалактия. Поросята, рождецные этими матками, растут интенсивнее, чем в контрольной группе (на 2,17−5%), их сохранность выше на 1,29−2,04%.

Каролин способствует лучшему росту, развитию животных и птиц, повышению их сохранности и продуктивности:

— внутреннее применение каролина благотворно влияет на сохранность поросят-отъемышей (выше на 7,5%), прирост живой массы возрастает на 2,05−5,7%;

— каролин в составе комбикормов активизирует прирост живой массы на 3−59%-5,6% и повышает сохранность цыплят на 2,01−3,69%.

Применение каролина способствует улучшению качества мясной и яичной продукции кур-несушек: масса яйца увеличивается на 1,3% за счет белка и желтка, содержание бета-каротина на (12,6−13,4%), витамина, А (на 8,5%) в желтке. Повысилась выводимость (на 2,47%) и сохранность (на 1,7%) суточных цыплят.

11. Материалы по фармако-токсикологической оценке и лечебно-профилактической эффективности каролина медицинского и ветеринарного качества были рассмотрены и рекомендованы Департаментом Государственного контроля качества, эффективности и безопасности лекарственных средств Минздрава РФ и Советом по ветеринарным препаратам Департамента ветеринарии РФ к применению в медицинской и ветеринарной практике.

На все препараты разработана и утверждена в установленном порядI ке нормативно-техническая документация. Их производство налажено в I производственных условиях ЗАО «Роскарфарм» (г. Краснодар), что позволило внедрить их в медицинскую и ветеринарную практику ряда регионов РФ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Для практического применения каролина в качестве лечебно-профилактического средства в медицине рекомендуется назначать каролин — при состояниях, характеризующихся усилением свободных реакций (воздействие малых доз радиации, рентгенологическое обследование, лучевая и химиотерапия при опухолевых заболеваниях, лазерная терапия, контакт с ядохимикатами, иммунодефицитные состояния).

В качестве лечебного средства препарат применяют в комплексной терапии заболеваний, связанных с нарушением регенерации эпителия (язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки, эрозивного гастрита, дуоденита, гепатита, холецистита, песпецифического язвенного колита, дис-бактериоза), острых респираторных заболеваний, хронических бронхоле-гочных заболеваний, гинекологических заболеваний, поражений и заболеваний кожи (раны, ожоги, отморожения трофические язвы, кератозы, псо-риазы и другие дерматозы). 1.

Результаты исследований нашли отражения в документах, утвержденных Департаментом Государственного контроля качества, эффективности и безопасности лекарственных средств и медицинской техники: ФС 42−3867−99 «Бета-каротин», ФС 42−3868−99 «Каролин" — Фармакологическим государственным комитетом: Инструкция по применению каролина, регистрационный номер 95/292/6.

Для практического применения каролина в ветеринарии в качестве лечебно-профилактического средства, рекомендуется назначать каролин для нормализации обмена веществ, профилактики задержаний последа, послеродовых эндометритов и нарушений воспроизводительной функции у коров, повышения молочности свиноматок и сохранности поросят, улучшения качества яиц и сохранности цыплят. I.

Результаты исследований нашли отражение в документах, утвержденных Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации: каролин — Технические условия № 9141−341 341 380−01- Наставление по применению препарата каролин в ветеринарии, регистрационный номер: ПВР-2−4.0/541. от 3.10.2000 г.

4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Активным продуцентом бета-каротина является низший гриб Blakeslea trispora. Одним из основных факторов, влияющих на процесс ка-ротинообразования, является состав питательной среды и качество используемых штаммов. Проведенные в этом направлении исследования позволили получить новую, высокоэффективную пару штаммов КР 74+ и КР 86-гриба Blakeslea trispora. Разработан состав питательной среды, в которой в качестве источников белков, жиров и углеводов, а также стимулятора ка-ротиногенеза и антиоксиданта используются отходы масложировой и крахмалопаточной промышленности: подсолнечный шрот — 12%, меласса и зеленая патока 1−2%, баковые отстой 4,2−5,0%, отходы дезодорации растительных масел -0,05−0,15%), отходы и вторичные продукты производства кристаллического бета-каротина — 0,03−0,05%. Это позволило получить в промышленных ферментерах мицелиальную массу с содержанием бета-каротипа до 4,5%, при остаточной влажности не более 7%.

В работах (Феофилова Е.П., 1983; Казарян Р. В., 1978) говорится о том, что бета-каротин в клетке гриба может находиться в кристаллическом виде, при концентрации бета-каротина в клеточных липидах выше 3,5 г/л.

Для разработки эффективной технологии извлечения бета-каротина из мицелиальной массы, нами была изучена динамика накопления его и количественное соотношение растворенного в клеточных липидах и локаI лизованного в кристаллах, в различных фазах роста культуры Blakeslea trispora в промышленных ферментерах. Установлено, что доля кристаллического бета-каротина составляет 85−87%, растворенного в клеточных липидах 13−15% от количества, содержащегося в мицелиальной массе.

Анализ полученных результатов, позволил разработать способ предварительного извлечения, растворенного в клеточных липидах бета-каротина, из мицелиальной массы. Извлечение растворенного бетакаротина осуществляется прессованием мицелиальной массы при температуре 40 °C и давлении 20 Мпа. Пересыщенный некристаллизующийся раствор отделяется и используется как самостоятельный продукт, а жмых подвергается в дальнейшем экстракции, с целью получения кристаллического бета-каротина. ,.

Для извлечения из мицелиальной массы кристаллического бета-каротина в качестве экстранета выбрали растительное масло. Экстракции подвергали измельченную и неизмельченную мицелиальную массу и определили эффективные коэффициенты диффузии. В результате установили, что величины полученных коэффициентов диффузии измельченной и неизмельченной мицелиальной массы отличаются незначительно и стадию измельчения исключили.

Получение бета-каротина в кристаллическом виде предопределяет организацию процесса экстракции в направлении получения пересыщенных растворов. Проведенные эксперименты позволили установить оптимальные режимы: экстракция должна быть противоточной трехступенчаI той, температура процесса — 100 °C, время экстракции 35 минут, соотношение мицелиальная масса: растительное масло изменяется в зависимости от исходной концентрации от 1,5 до 2,4 частей растительного масла на одну часть мицелиальной массы.

Анализ липидного комплекса культуры Blakeslea trispora, полученного как экстракцией растительным маслом, так и растворителем, показал наличие большого количества сопутствующих веществ: свободных жирных кислот, фосфолипидов, монои диглицеридов. Жирные кислоты на 50% представлены насыщенными кислотами, которые при 20 °C имеют мазеобразную консистенцию и увеличивают вязкость системы. Изучив зависимость вязкости масляного экстракта от температуры, установили, что I резкое падение вязкости системы происходит при температуре от 20 до 25 °C. Кристаллизацию бета-каротина из раствора вели при температуре.

25 °C. В результате исследований было установлено, что одновременно с образованием кристаллов идет осаждение сопутствующих веществ. Разделение такого осадка представляет проблему из-за вязкой консистенции и большого объема осадка.

Для очистки кристаллов бета-каротина разработали способ, который основан на омылении жировых компонентов, адсорбированных на поверхности кристаллов. Суспензию кристаллов обрабатывают 1−1,5 Н спиртовым или водным раствором щелочи. Это позволяет получать кристаллы бета-каротина с температурой 182−184 °С. Для удаления продуктов окисления самого каротина с поверхности кристаллов, их дополнительно обрабатывают спиртовым раствором щелочи концентрацией 5−10 г/л.

Масляные экстракты бета-каротина, с целыо очистки от сопутствующих веществ, подвергаются рафинации. Предварительно были изучены коэффициенты распределения бета-каротина, свободных жирных кислот и фосфолипидов от температуры в этаноле при разном соотношении компонентов. Установлено, что коэффициенты распределения бета-каротина на порядок отличаются от коэффициентов распределения свободных жирных кислот и фосфолипидов. Это говорит о возможности применения способа экстракции в системе «жидкость-жидкость» для отделения полярных компонентов от бета-каротина, растворенного в триацилг-лицеролах. Разработан способ рафинации масляного экстракта, который I представляет собой двухступенчатую противоточную экстракцию в системе жидкость-жидкость этанолом в соотношении масляный экстракт бета-каротина: этанол 1:2 при температуре 20−25°С на первой ступени и 40−45°С на второй ступени. Это дает возможность снизить кислотное число на 60%, содержание фосфолипидов на 85%, при этом потери бета-каротина составили 0,25%.

В результате проведенных исследований разработана технология получения кристаллического бета-каротина, которая включает в себя еледующие операции: прессование мицелиальной массы, экстракцию бета-каротина из мицелиальной массы растительным маслом, отделение твердой фазы, рафинацию масляного экстракта бета-каротина, кристаллизацию, отделение кристаллов, очистку, промывку и сушки кристаллов, удаление остатков растворителя из масляного экстракта бета-каротина, регенерацию растворителя.

Бета-каротина относится к термолабильным веществам. Поэтому важной задачей является правильная организация производства: сведение к минимуму количества операций при извлечении бета-каротина, минимальный контакт с атмосферой. Для решения этой задачи нами был разработан экстракционный аппарат, в котором совмещаются два процесса: собственно экстракции и разделения фаз (фильтрации).

Разработано устройство для получения кристаллического бета-каротина из суспензии, в котором также осуществляются в одном аппарате три функции: отделение кристаллов от жидкой фазы фильтрацией, очистI ка кристаллов путем омыления, промывка.

В результате проведенных исследований впервые разработана фармакопейная субстанция бета-каротина для производства лекарственных и ветеринарных препаратов.

С целью разработки лекарственного и ветеринарного препаратов на основе фармакопейной субстанции исследовались физико-химические характеристики бета-каротина. Бета-каротин растворяется в жирах и маслах, так как является жирорастворимым. Однако он является трудно растворимым веществом. В связи с этим изучили кинетические закономерности перехода каротина из кристаллического в истинно растворенное состояние в растительном масле. Использовали кристаллы, полученные на стадии массовой кристаллизации и на стадии перекристаллизации, изучали влияние температуры, размеров и формы кристаллов на скорость растворения их в растительных маслах. Установили, что процесс растворения кристаллического бета-каротинй в масле — гетерогенный процесс первого порядка. Кристаллы, образующиеся на стадии массовой кристаллизации, имеют более высокую скорость растворения, в сравнении с перекристаллизованными кристаллами. Температуру растворения, в зависимости от необходимой концентрации раствора, выбирают от 40 до 80 °C.

Для решения вопроса стабилизации бета-каротина изучили кинетику окисления его в подсолнечном масле, в кристаллическом виде и в растворе хлорбензола. Установлено, что скорость окисления бета-каротина в растительных маслах в 25 раз ниже скорости окисления бета-каротина в хлорбензоле.

Определено, что устойчивость к окислению бета-каротина выше в кукурузном масле. Это объясняется тем, что кукурузное масло содержит 5-токоферол, который является наиболее эффективным антиоксидантом и в кукурузном масле его содержится до 37% от общей суммы токоферолов, в то время как в подсолнечном масле — 7,8%.

В результате проведенных исследований впервые разработан лекарственный препарат на основе бета-каротина — каролин. Он представляет собой раствор субстанции кристаллического бета-каротина в дезодорированном растительном масле. Массовая доля бета-каротина составляет 0,1%. Лабораторные, клинические и фармако-токсикологические исследования показали, что каролин является эффективным лечебно-профилактическим средством.

Оценка общетоксических свойств каролина проводилась на крысах и белых мышах, поросятах, телятах и цыплятах. Максимально введенная доза препарата при изучении острой токсичности никаких изменений в состоянии животных не вызвала. При изучении субхронической токсичности, введенные дозы препарата превышали терапевтические в 6 и 30 раз. Проведенные исследования показали, что препарат каролин хорошо переносится животными. Гибели животных не отмечалось ни в одной из групп.

Визуальное наблюдение в течение всего эксперимента не выявило каких-либо изменений в поведении опытных животных. Внешне опытные животные выглядели лучше, чем контрольные, у них была гладкая блестящая шерсть.

Анализ динамики массы тела крыс показал положительный прирост ее как в опытных, так и в контрольной группах.

Биохимические исследования не выявили достоверных различий изучаемых показателей в опытных группах в сравнении с таковыми у животных контрольной группы. Однако отмечается наличие тенденции к снижению глюкозы и мочевины в крови крыс, получавших каролин в дозе 15 мл/кг массы тела.

Исследования двигательной активности групп крыс, получавших препарат в дозе 3 мл/кг, выявило статистически достоверное снижение горизонтальной активности в сравнении с животными контрольной группой. Показатели двигательной активности групп крыс, получавших препарат в дозе 15 мл/кг, не отличались от животных контрольной группы.

Патоморфологические исследования состояния слизистой кишечника, проведенные через 1 месяц после окончания введения каролина, не показали каких-либо различий у животных в опытных и контрольной группах.

Введение

крысам каролина в дозах 3 и 15 мл/кг не вызвало каких-либо существенных изменений в структуре внутренних органов животных.

Проведенные исследования общетоксических свойств каролина при однократном и повторном, в течение месяца введении в дозах, превышаюI щих терапевтические в 6 и 30 раз, показало хорошую переносимость препарата экспериментальными животными. Ни одна из изучаемых доз (3 и 15 мл/кг) не вызвала достоверных изменений опытных животных в сравнении с контрольными группами.

Изучение аллергенных и иммунотоксичных свойств препарата проводили на морских свинках и белых беспородных крысах. Различные способы введения препарата практически не вызвали сенсибилизации организма экспериментальных животных. Многократное подкожное и внутримышечное введение препарата не приводило к развитию анафилактической реакции в ответ на введение разрешающей дозы препарата. Не было зарегистрировано реакции со смертельным исходом. Слабые аллергические реакции, отмеченные у части экспериментальных животных, свидетельствуют о низкой сенсибилизирующей активности препарата.

Дополнительные подтверждения отсутствия аллергенной активности у бета-каротина были получены в результате исследования способности препарата, индуцировать гиперчувствительность замедленного типа. Показано, что повторное введение препарата практически не сопровождалось местной воспалительной реакцией, регистрируемой через 8 и 24 часа после введения разрешающей дозы препарата.

Исследование аллергенной активности препарата было проведено и в реакции непрямой деструкции тучных клеток (РДТК). Статистически значимые различия между опытом и контролем не были обнаружены ни на один из выбранных сроков наблюдения. Показатели деструкции тучных I клеток практически не отличались при исследовании сывороток крови от животных, не получавших препарат и животных после курса лечения.

Таким образом, каролин при местном и многократном парентеральном введении не вызывает у экспериментальных животных состояния повышенной чувствительности немедленного или замедленного типа.

Для оценки иммунотоксических свойств препарата было исследовано митостатическое и лимфотоксическое действие в отношении эндогенных стволовых кроветворных клеток в реакции трансплантант против хозяина. Полученные результаты показали, что препарат не оказывает мито-статического действия. Лимфотоксическое действие препарата также не выявило у экспериментальных животных состояния повышенной чувствиI тельности немедленного или замедленного типа.

Фагоцитарная активность в опытной и контрольной группах практически не отличалась (соответственно 100 и 96,2±2,1%). Функциональная активность макрофагов в обеих группах также не отличались (Фагоцитарный индекс 5,1 ±0,7 и 4,9±0,4 соответственно).

В результате проведенных комплексных исследований показано, что препарат при многократном местном и парентеральном введении не оказывает аллергизирующего действия на организм лабораторных животных. Препарат не оказывает влияния на Ти Влимфоциты и не снижает фагоцитарную активность макрофагов, не оказывает митостатического и лим-фотоксического действия.

Разработка показаний к применению и лечебно-профилактическая I эффективность каролина определялись при ряде заболеваний: эндометрио-зе, стенокардии и инфильтративной форме туберкулеза легких.

Результаты проведенных исследований показали, что у больных эн-дометриозом развивается гиперхолестеринемия за счет повышения холестерина ЛПНП и ЛПОНП и гипертриацилглицеринемия, что свидетельствует о хронической мобилизации липидных резервов организма. При этом содержание холестерина ЛПВП достоверно снижено. В результате чего у больных женщин повышен индекс атерогенности, а также повышено в 3 раза содержание малонового диальдегида — конечного продукта перекис-ного окисления липидов, на фоне частичного истощения антиокислительной активности сыворотки крови. Применение препарата каролин в течение 14 дней по 30−45 мл в день обеспечило нормализацию содержания общего холестерина, холестерина ЛПНП и малонового диальдегида. Препарат на 63,3% повысил антиокислительную активность сыворотки крови, уменьшилось содержание холестерина ЛПОНП на 17%, триацилглицери-нов на 15%, белково-липидного индекса ЛПВП на 22%, что говорит о положительных сдвигах в область значений характерных для здоровых женщип. Препарат пе оказал влияния на содержание холестерина ЛПВП и резко уменьшил количество липидов в ЛПНП.

Для повышения терапевтического эффекта применяли дополнительно лазеротерапию, что в сочетании с каролином повысило антиокислительную активность сыворотки крови. I.

Отмечен эффект пролонгированного действия каролина с регистрацией нормализующего действия через два месяца. Препарат не оказывал побочного действия.

Получен положительный лечебно-профилактический эффект применения каролина в кардиологии.

В последние годы поды получен положительный опыт в применении у больных ишемической болезнью сердца низко интенсивного излучения гелий неонового лазера в красной области спектра. Однако, при этом рядом исследователей отмечается активация перекисного окисления липидов, способная усилить перекиспую модификацию апо-В-ЛП и оказать проатерогенный эффект (Рабкин М.С., Егоров К. Н., Осейчук С. С., 1994). I.

Применение препарата каролин в течение 14 дней достоверно повысило антиокислительную активность плазмы крови. Этот эффект сохранился и спустя 30 суток лечения. Кроме того, применение каролина привело к увеличению количества липидов в составе ЛПНП, что можно рассматривать как активацию обратного транспорта холестерина. При этом период достижения стабилизации заболевания был короче (на 4 суток), на 13,2% увеличилось число больных с тенденцией нормализации показателей ЭКГ, улучшилась функция сердца (проба КИН) на 30%. Положительная динамика заболевания связана с улучшением показателей, играющих центральную роль в патогенезе заболевания (нормализация показателей ПОЛ, повышение аптиокислительпой активности и уровня холестерина ЛПВП).

При лечении больных туберкулезом широко применяются различные химиотерапевтические препараты, оказывающие гепатотоксическое дейстI.

266 вне. Вместе с тем отмечается, что происходят нарушения в липопротеино-вом спектре крови: снижение уровня холестерина ЛПВП, повышение уровня холестерина ЛПНП и индекса атерогенности, интенсифицируются процессы перекисного окисления липидов. Лечение с применением препарата каролин привело к нормализации состава ЛПВП (их состав не отличался от состава здоровых людей), оказывало ярко выраженное гепатопро-текторное действие (уменьшилась активность аминотрансфераз, щелочной фосфатазы, гамма-глютаминилтрансферазы, но при этом не изменились основные показатели метаболизма: содержание глюкозы, билирубина, креатина, мочевины, калия и белковых фракций крови. I.

Препарат рекомендован Минздравом РФ для применения в медицинской практике.

Разработан новый отечественный ветеринарный препарата бета-каротинакаролин. Он представляет собой стерильный 0,18% раствор бета-каротина в дезодорированном растительном масле.

Проведенные лабораторные, клинические и фармако-токсикологические исследования показали, что ветеринарный каролин является эффективным лечебно-профилактическим средством.

Токсикологическая оценка ветеринарного стерильного препарата каролин проводили на поросятах и цыплятах.

Каролин не вызывал гибели животных и птиц в течение всего периода наблюдения, не влиял на их общее состояние и поведение. Рефлексы оставались сохраненными. При этом нарушений функциональной активности органов пищеварения и мочеотделения не наблюдалось.

Изучение субхронической токсичности на телятах, в ходе которого изучали влияние каролина на функцию почек, пищеварительного тракта и картину крови, получены данные, свидетельствующие о том, что физико-химические показатели мочи и фекалий оставались в пределах физиологической нормы, а в крови повышалось содержание эритроцитов, общего белка (на 17,5%), каротина (в 2 раза) и витамина, А (в 1,8 раза), а белка (на 17,5%), каротина (в 2 раза) и витамина, А (в 1,8 раза), а также наблюдалась тенденция к увеличению гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови и снижению альбуминовой. Остальные показатели не претерпевали существенных изменений и не отличались от контрольных. I.

В субхроническом опыте изучали влияние каролина на печень поросят. По результатам исследований сделан вывод, о том, что введение препарата в корм в пределах нормы повысило уровень общего белка, а количественное содержание билирубина, фермента AJ1T и ACT у поросят опытной и контрольной групп не различались. Это указывает на то, что каролин, длительно назначаемый поросятам в дозах, превышающих терапевтические, не оказывает на них токсического действия. На этих же поросятах была проведена ветеринарно-санитарная экспертиза, которая показала, что применение препарата не изменяет вкусовых и других качеств мяса.

Местнораздражающее действие каролина изучали методом накожных аппликаций на морских свинках и кроликах. В течение 5 дней экспеI римента препарат не вызвал у подопытных животных никаких изменении.

Фармакодинамика каролина характеризуется активацией основных видов обмена веществ, в том числе, белкового — за счет повышения уровня общего белка на 7,2−33,1% и его фракций, витаминного — за счет повышения уровней витаминов, А в 1,3−1,9 раз, Е и В2 и стимуляции эритрона 8% и гемопоэза — на 7,7%.

Препарат повышает общую неспецифическую резистентность организма животных за счет повышения бактерицидной на 13,4% и лизоцим-ной в 3 раза активности, увеличения гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови на 11,58%. Фармакокинетика каролина характеризуется повышением содержания витамина, А (на 14,2−88%) и каротина (в 2,2−3,3 раза) в сыворотке крови, в печени — витамина, А на 10,4−63% и каротина на 19,5−41%.

Разработка показаний к применению и изучение лечебно-профилактической эффективности каролина проведена на разных видах животных и птиц.

В трех сериях опытов определяли эффективность препарата при различных послеродовых патологиях у коров. Для этого животных опытных и контрольных групп подвергали клиническим и гематологическим исследованиям.

В ходе эксперимента было установлено, что у коров опытных групп, получавших каролип, случаев задержаний последа было на 14,5%, 12,5 и I.

10% меньше, чем в контрольной группе. На 10%. 15% и 22,4% меньше коров заболело острым гнойно-катаральным эндометритомна 8,8%, 10%, 10,1% меньше зарегистрировано животных с расстройством функции яичниковна 13−20 дней короче сервис-периодна 0,5−1,0 ниже индекс осемененияна 7,5%-10% меньше коров с персистентным желтым телом в сравнении с животными контрольной группы.

Биохимические исследования крови коров показали, что назначение препарата перед и после родов оказывает существенно влияние на поддержание высокого уровня витамина, А и каротина в крови, что создает благоприятные условия для течения метаболических процессов, связанных с обеспечением родового акта и нормальной послеродовой инволюции половых органов. '.

Проведена серия исследований по изучению влиянию каролина на супоросных свиноматока через их организм на новорожденных поросят, Применяемые в промышленном свиноводстве технологии (ранний отъем молодняка, интенсивное использование свиноматок и др.) и возникающие стрессы усиливают потребность свиней в витаминах. Прежде всего это относится к витамину А, который повышает устойчивость животных к заболеваниям и стресс факторам, способствует росту и сохранности молодняка.

После применения препарата супоросным свиноматкам снизилась частота возникновения синдрома ММА.

Различия в сохранности поросят опытной и контрольной групп (в 21 I день на 2,04% и в 30 дней на 1,29%) свидетельствуют о том, что добавление в рацион каролина, повышает жизнеспособность поросят. В ходе проведенных исследований при назначении каролина поросятам-отъемышам были получены достаточно высокие для производственных условий показатели их сохранности 7,5 и 5,0%.

Увеличился прирост живой массы поросят (на 5,1% и 5,7%) в сравнении с контрольными животными. Внутримышечная инъекция препарата увеличила прирост живой массы на 2,05%. Сохранность в этой группе была выше па 7,5% в сравнении с животными контрольной группы.

Эффективность каролина была испытана в птицеводстве на курах-несушках и цыплятах.

Ежедневное скармливание каролина курам-несушкам из расчета 2 л/т корма позволяет получить яйцо с хорошими товарными качествами, обеспечить потребность в витамине, А и бета-каротине, что, в свою очередь, оказывает положительное влияние на оплодотворяемость яиц и выводимость цыплят.

При скармливании каролина, средний вес яйца увеличился на 1,3%. Отмечено повышение содержания каротиноидов в желтке яиц на 10,15%, 13%, 16,9%, что оказало положительное влияние на оплодотворяемость яиц, результаты инкубации и сохранность цыплят. Показатели инкубации для яиц, полученных от кур опытной группы, превышали данные контроля по выводимости на 2,47%, 6,8%, сохранности на 1,7%, по весу суточных цыплят на 1,55%. ¦

Добавление каролина в рацион кур-несушек улучшило товарный вид получаемых яиц (на 2 балла по шкале ВНИИТИП). При добавлении каролина, в рацион цыплят-бройлеров, в зависимости от дозировки, живой вес увеличился на 3,59% и 5,6%, а сохранность на 2,01% и 3,69% соответственно. Содержание каротина в печени увеличилось на 6,2−7,4 мкг, а витамина, А на 93,9−90,4 мкг.

Лечебную эффективность каролина изучали на курах-несушках с клинической картиной А-гиповитаминоза, подтвержденной лабораторными исследованиями: при определении в сыворотке крови и в желтке яиц витамина, А и каротиноидов, эти показатели были ниже нормы.

Установлено, что у группы птиц, получавших каролин, в среднем на 20-е сутки исчезали основные клинические признаки гиповитаминоза, тогда как в контрольной группе симптомокомплекс заболевания становился более выраженным.

Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что у птиц, получавших каролин, процент сохранности в сравнении с контрольными был выше: на 20-е сутки на 5%, на 40-е сутки — на 15%. У птиц опытной группы была более высокой интенсивность яйцекладки (на 20-е сутки — на 19,57%, на 40-е сутки — на 20,56%), в сравнении с контрольной группой.

Каролин оказал положительное влияние на процессы накопления витаминов в печени кур. Увеличился уровень каротина (на 20-е сутки в 6,57 раз, па 40-е сутки — в 30,57 раз), витамина, А (на 20-е сутки в 3,67 раза, на 40-е сутки в 3,9 раза), витамина Е (на 20-сутки в 1,98 раза, на 40-е сутки — в 2,87 раза).

Эти показатели у птиц контрольной группы, как при фоновом исследовании, так и при завершении эксперимента, находились за нижней физиологической границей.

При добавлении каролина в рацион кур-несушек увеличилось содержание каротина (на 20-е сутки — в 2,94 раза, на 40-е сутки — в 3,26 раза), витаминов, А (на 20-е сутки в 1,97 раза, на 40-е сутки — в 2,97 раза) и Е (па 20-е сутки — в 1,3, на 40-е суткив 1,53 раза) в желтке яиц. В контрольной группе, наоборот, прослеживалась тенденция к снижению этих показателей.

В результате анализа биохимических показателей сыворотки крови кур-несушек, пришли к выводу, что уровни каротина, витамина Л, общего белка и холестерина были ниже границы физиологической нормы, как в опытной, так и в контрольной группах. Но в группе птиц получавших каролин, уже на 20-е сутки наблюдалась тенденция к нормализации этих показателей, а на 40-е сутки эксперимента уровень каротина достоверно повысился в 3,8 раза, витамина, А в 8,6 раз, общего белка в 1,6 раза, холестерина в 2,2 раза. Эти показатели в контрольной группе за весь период эксперимента не претерпел значительных изменений, и также оставались ниже нормы.

Терапевтическую эффективность каролина изучали при гипотрофии поросят. Опытным поросятам назначали каролин внутрь, по 0,5 мл на кг массы тела, ежедневно в течение 60-ти дней. Исследования показали, что под влиянием препарата постепенно ослабевают и исчезают признаки болезни, возрастают темпы прироста массы тела: через 10 дней она выше на 236%, через 20 — на 198,5%, на 60-е сутки на 146,7%. Различие в сохранности между группами составило 20%. При этом происходит увеличение гемоглобина и эритроцитов в крови, общего белка и гамма глобулинов в сыворотке, активизируется биоконверсия — процесс преобразования корма в массу тела поросят.

Обобщая результаты опытов по изучению влияния препарата каролин на организм животных и птиц, можно утверждать, что наиболее типичным проявлением является интенсивное увеличение массы тела у растущих животныхповышение жизнеспособности организма не только у животных, получавших каролин, но и у полученного от них потомства. У коров лучше протекает беременность, роды, послеродовой период, нормализуется половой цикл, в связи с этим, последующее осеменение является более успешным. По результатам гематологических исследований крови наблюдается увеличение уровня каротина, витамина А, общего белка. При фракционировании белка отмечается повышение уровня гамма-глобулинов и снижение содержания альбуминовой фракции, увеличивается содержания эритроцитов со слабым повышением гемоглобина. По иммунологическим показателям увеличивается бактерицидная и лизоцимная активность сыворотки крови, процентное содержание Ти Влимфоцитов и наблюдается достоверное повышение местной иМмунной реактивности матки.

Проведенные исследования показали высокую биологическую и лечебно-профилактическую активность каролина при ряде заболеваний крупного рогатого скота, свиней и птиц. Препарат рекомендован Советом по ветеринарным препаратам Департамента ветеринарии Российской Федерации к применению в ветеринарной практике.