Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы

Диссертация: Идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Основными задачами онкогеномики являются изучение молекулярных механизмов канцерогенеза и разработка оптимальных методов предупреждения, диагностики и мониторинга онкологических заболеваний. В связи с этим особое значение приобретает проблема идентификации генов, вовлеченных в канцерогенез, и их подробная характеристика. Один из подходов к решению этой задачи основывается на анализе… Читать ещё >

Содержание

  • СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
  • Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Роль эпигенетики в изучении патогенеза рака молочной железы и разработке молекулярных маркеров канцерогенеза
      • 1. 1. 1. Краткая характеристика рака молочной железы
      • 1. 1. 2. Значение метилирования ДНК в норме и при патологии
      • 1. 1. 3. Особенности метилирования CpG-островков генов, вовлеченных в канцерогенез
      • 1. 1. 4. Значение нарушений метилирования ДНК при РМЖ как молекулярных маркеров канцерогенеза
        • 1. 1. 4. 1. Аномальное метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез, при РМЖ
        • 1. 1. 4. 2. Преимущества метилирования ДНК как молекулярного маркера канцерогенеза
        • 1. 1. 4. 3. Аномальное метилирование ДНК в биологических жидкостях при РМЖ
    • 1. 2. Методы анализа метилирования ДНК
      • 1. 2. 1. Методы исследования полногеномного метилирования
      • 1. 2. 2. Ген-специфический анализ метилирования. ф 1.2.2.1. Основные принципы ген-специфического анализа метилирования
        • 1. 2. 2. 2. Выбор метода ген-специфического анализа метилирования
      • 1. 2. 3. Методы поиска дифференциально метилированных CpG-островков
        • 1. 2. 3. 1. Метилчувствительное рестрикционно-ориентированное геномное сканирование
        • 1. 2. 3. 2. Метилчувствительный репрезентативно-дифференциальный анализ (МЧ-РДА)
        • 1. 2. 3. 3. Вычитательная гибридизация хромотографически изолированных пулов CpG-островков
        • 1. 2. 3. 4. Метилчувствительный фингерпринтинг (МЧФП)
        • 1. 2. 3. 5. Амплификация интерметилированных CpG-островков
        • 1. 2. 3. 6. Идентификация дифференциально метилированных CpG-островков с использованием микрочиповых технологий
  • Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
    • 2. 1. Клинический материал
    • 2. 2. Забор крови и операционного материала
    • 2. 3. Выделение геномной ДНК
    • 2. 4. Выделение РНК
    • 2. 5. Модификация метода МЧФП
      • 2. 5. 1. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции
      • 2. 5. 2. Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР) с использованием CG-богатых праймеров
      • 2. 5. 3. Электрофорез в ПААГ
      • 2. 5. 4. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра
      • 2. 5. 5. Амплификация фрагментов CpG-островков и определение нуклеотидной последовательности
    • 2. 6. Рестрикционный анализ
    • 2. 7. Метил-чувствительная ПЦР со специфическими праймерами
    • 2. 8. Обработка ДНК бисульфитом натрия
    • 2. 9. Метил-специфический сиквенс
    • 2. 10. Синтез кДНК
    • 2. 11. ОТ-ПЦР в реальном времени
    • 2. 12. Микросателлитный анализ
    • 2. 13. Программное обеспечение
  • Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
    • 3. 1. Оптимизация метода поиска аномально метилированных CpG-островков
    • 3. 2. Идентификация дифференциально метилированных CpG-островков в образцах ДНК больных РМЖ
    • 3. 3. Характеристика метилирования исследуемых генов в нормальных тканях человека
    • 3. 4. Анализ метилирования и экспрессии исследуемых генов в образцах опухолей РМЖ
      • 3. 4. 1. Анализ метилирования и экспрессии теш BIN
      • 3. 4. 2. Анализ метилирования и экспрессии гена LAMC
      • 3. 4. 3. Анализ метилирования и экспрессии гена. SEMA6B
      • 3. 4. 4. Анализ генов, кодирующих субъединицы ионных каналов
      • 3. 4. 5. Анализ метилирования и экспрессии гена VCIP
      • 3. 4. 6. Анализ метилирования и экспрессии гена PSMTF
    • 3. 5. Оценка эффективности модификации метода МЧФП и информативности выявленных эпигенетических маркеров канцерогенеза

Идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Основными задачами онкогеномики являются изучение молекулярных механизмов канцерогенеза и разработка оптимальных методов предупреждения, диагностики и мониторинга онкологических заболеваний. В связи с этим особое значение приобретает проблема идентификации генов, вовлеченных в канцерогенез, и их подробная характеристика. Один из подходов к решению этой задачи основывается на анализе эпигенетических особенностей генома опухолей. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов подразумевает изменения генома, отличные от структурных вариаций кодирующих областей генов. К эпигенетическим явлениям относятся, в частности, метилирование-деметилирование ДНК и гистонов, ацетилирование-деацетилирование гистонов, полиморфизмы повторяющихся последовательностей в регуляторных областях генов.

В настоящее время разработан ряд методов, позволяющих выявлять аномально метилированные локусы в геноме опухолевой клетки. Идентифицированные с помощью подобных методов гены в дальнейшем характеризуются с точки зрения их молекулярной патологии при канцерогенезе, в частности, оценивается их экспрессия, структурные нарушения и метилирование в норме и патологии. Особое внимание целесообразно уделять подробной характеристике особенностей метилирования изучаемых генов. Это обусловлено тем, что анализ маркеров метилирования на сегодняшний день является оптимальным инструментом молекулярно-генетической диагностики и мониторинга в онкологии. По специфичности он не уступает анализу экспрессии генов, значительно превосходя последний по простоте и доступности. Что же касается анализа структурных аномалий, он остается достаточно дорогостоящей процедурой и находит применение, в основном, в диагностике наследственных онкологических синдромов.

Анализ аномалий метилирования должен опираться на фундаментальную научную основу. В частности, необходимо значительно расширить генный состав применяемых диагностических панелей. Список хорошо изученных диагностических и прогностических маркеров метилирования не превышает на сегодняшний день двух десятков, причем многие из них не являются специфичными. Все применяемые маркеры должны быть четко охарактеризованы с точки зрения тканеспецифичности опухолей, информативности, особенностей метилирования CpG-островков в норме и при патологии.

Коротко актуальность проблемы можно выразить следующим образом:

1. Злокачественные новообразования относятся к одним из наиболее социально значимых болезней. Использование в клинической практике высокоинформативных предиктивных, диагностических и прогностических молекулярных маркеров канцерогенеза должно способствовать формированию групп риска, раннему выявлению заболеваний, повышению эффективности дифференциальной диагностики, определению тактики лечения и контролю за его эффективностью.

2. Существующие панели молекулярно-генетических маркеров канцерогенеза не обеспечивают необходимого уровня эффективности диагностики, что объясняется, в первую очередь, недостатком всесторонне изученных маркеров.

3. На сегодняшний день одним из оптимальных инструментов молекулярно-генетической диагностики и мониторинга в онкологии является анализ маркеров метилирования. Тем не менее, выбор таких маркеров часто проводится на случайной основе без учёта эпигенетических характеристик конкретных геномных локусов. Совершенствование молекулярно-генетической диагностики онкозаболеваний невозможно без идентификации новых генов, вовлечённых в канцерогенез, и подробной характеристики особенностей эпигенетической регуляции их функционирования в норме и при патологии.

Целью настоящей работы является идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы.

Задачи исследования.

1. Оптимизация методологии скрининга дифференциального метилированния геномов нормальных и опухолевых клеток.

2. Идентификация локусов генома человека, аномально метилированных в образцах РМЖ и определение их принадлежности к конкретным генам.

3. Оценка частот метилирования CpG-островков выявленных генов в норме и при РМЖ.

4. Высокоразрешающее картирование метилирования CpG-островков изучаемых генов.

5. Изучение особенностей экспрессии исследуемых генов при РМЖ.

6. Оценка информативности выявленных эпигенетических маркеров канцерогенеза.

Научная новизна.

В результате проведенного исследования разработана эффективная и экономичная модификация метода поиска дифференциально метилированных CpG-островков в геноме опухолевых клеток. На основании применения этой методики выявлено семь областей генома человека, дифференциально метилированных в ДНК из образцов тканей РМЖ и принадлежащих CpG-островкам генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Для указанных генов впервые проведен анализ метилирования их промоторных областей при РМЖ, а также в нормальных тканях молочной железы и лимфоцитах периферической крови здоровых доноров. Построены высокоразрешающие карты метилирования CpG-островков генов LAMC3, SEMA6B и BIN1. Проведен количественный анализ экспрессии указанных генов в операционном материале РМЖ и клеточных линиях РМЖ. Подробное исследование метилирования и экспрессии генов, выявленных в ходе работы, в злокачественных опухолях проведено впервые, и полученные результаты свидетельствуют о значительной роли эпигенетических факторов в регуляции функции этих генов при канцерогенезе.

Практическая значимость.

Разработанная система скрининга дифференциального метилирования геномов высоко воспроизводима, подробно охарактеризована и может быть использована в дальнейшем в работах по характеристике эпигенетических нарушений, ассоциированных с социально значимыми заболеваниями. В настоящем исследовании скрининг дифференциального метилирования CpG-островков в 40 парных (опухоль и норма) образцах ДНК больных РМЖ позволил выявить семь генов, экспрессия которых подвержена аномальной эпигенетической регуляции при канцерогенезе: LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Разработаны методики мультилокусной метилчувствительной ПЦР для CpG-островков каждого из изучаемых генов, предназначенные для оценки статуса их метилирования в материале опухоли. В выборке из 98 образцов РМЖ проведена оценка частот аномального метилирования генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Анализ экспрессии перечисленных генов в 16 парных образцах ДНК больных РМЖ позволил провести предварительную оценку информативности снижения экспрессии каждого из генов как маркера канцерогенеза. Созданные карты метилирования соответствующих CpG-островков генов LAMC3, SEMA6B и BIN1 и результаты проведённого экспрессионного анализа изучаемых генов представляют собой базу для разработки научно обоснованных систем эпигенетических маркеров канцерогенеза.

Апробация работы.

Материалы исследования докладывались на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2005;2006 гг., на конференции Российского общества медицинских генетиков в 2005 г. (г. Уфа), на конференции «Биомедицина и биобезопасность» в 2005 г. (г. Москва), конференции по функциональной геномике Европейского Научного Фонда в 2005 г. (г. Осло). По результатам работы опубликовано 3 статьи и 5 тезисов. Решением Научного комитета Европейской конференции генетики человека (Амстердам, 2006) исследование признано лучшей научной работой коллектива молодых ученых.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная модификация метилчувствительного фингерпринтинга является эффективной системой скрининга дифференциального метилирования геномов.

2. Промоторные области генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1,KCNH2, CACNG4 и PSMF1 подвергаются аномальному метилированию при РМЖ.

3. Разработаны карты метилирования CpG-динуклеотидов промоторных районов генов LAMC3, SEMA6B и BIN1.

4. Экспрессия генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1 нарушается при РМЖ, с преобладанием ее снижения для большинства изученных генов.

выводы.

1. Разработана оригинальная модификация метода метилчувствительного фингерпринтинга: исключены этапы радиоавтографирования гелей и клонирования продуктов реакции, расширены возможности визуального контроля на каждом этапе эксперимента.

2. Использование разработанной модификации метода позволило идентифицировать 7 генов, подвергающихся аномальной эпигенетической регуляции при РМЖ: LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1.

3. Определены частоты аномального метилирования промоторных CpG-островков выявленных генов при РМЖ. Значимые частоты аномального метилирования показаны для генов SEMA6B, BIN1, LAMC3 и KCNH2 (38%, 18%, 8% и 7%, соответственно). Метилирование указанных генов не характерно для морфологически неизмененных тканей молочной железы.

4. Проведено картирование метилирования CpG-островков генов с высокими частотами метилирования (SEMA6B, BIN1, LAMC3), что создаёт фундаментальную базу для разработки эффективных тест-систем анализа метилирования указанных генов.

5. Методом ПЦР в реальном времени показано снижение экспрессии генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1 в тканях РМЖ с частотами от 44% до 94%. Показано значительное снижение экспрессии генов LAMC3 и BIN1 в клеточной линии РМЖ MCF7 и генов BIN] и SEMA6B в клеточной линии РМЖ T47D.

6. Для генов SEMA6B и LAMC3 определены наиболее выраженные функциональные изменения при РМЖ (частота аномального метилирования SEMA6B — 38%, частота не менее чем 10-кратного снижения экспрессии SEMA6B -38%, частота не менее чем 10-кратного снижения экспрессии LAMC3 — 59%). Полученные результаты позволяют рекомендовать включение этих генов в панели диагностических маркеров канцерогенеза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Анализ эпигенетических нарушений в геномах опухолевых клеток является на сегодняшний день одним из оптимальных методов поиска новых генов, вовлеченных в канцерогенез. Результаты подобных исследований не только предоставляют доказательства участия тех или иных генов в развитии опухоли, но и создают фундаментальную базу для последующего включения идентифицированных генов в панели диагностических маркеров.

В настоящем исследовании была разработана эффективная модификация метода МЧФП, использование которой позволило идентифицировать семь генов, подвергающихся аномальной эпигенетической регуляции при РМЖ: LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Для указанных генов впервые проведен анализ метилирования их промоторных CpG-островков при РМЖ, а также в нормальных тканях молочной железы и лимфоцитах периферической крови здоровых доноров с помощью разработаных нами протоколов мультилокусных МЧ-ПЦР. Исследование было выполнено на материале 98 парных образцов РМЖ и 54 образцов периферической крови. В результате проведенного анализа для генов LAMC3, SEMA6B, BIN1, KCNH2 было показано наличие аномального метилирования в образцах РМЖ с частотой, превышающей 5% (от 7% до 38%). Для генов VCIP135, CACNG4 и PSMF1 частота метилирования составила менее 5%.

Включение гена в диагностическую панель возможно лишь после детальной характеристики особенностей его экспрессии и метилирования как в опухолевой, так и в нормальной ткани. В представленной работе было выполнено высокоразрешающее картирование исследуемых областей CpG-островков генов, имеющих высокие частоты метилирования (SEMA6B, BIN1, LAMC3), дающее представление о характере метилирования каждого С, 0-динуклеотида в составе фрагмента. Подобные карты являются необходимой базой для последующей разработки диагностических тест-систем с использованием изучаемых генов.

Проведен анализ экспрессии генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1 в тканях РМЖ. По результатам исследования показано снижение экспрессии всех генов с частотами от 44% до 94%. Сопоставление этих значений с относительно низкими частотами метилирования CpG-островков тех же генов при РМЖ показывает, что метилирование не является доминирующим механизмом инактивации большинства из них при РМЖ. Исключение составляет ген SEMA6B, для которого показаны сопоставимые значения частот метилирования и потери экспрессии. На основе высоких показателей этих значений предложено их использование как молекулярных маркеров канцерогенеза. Кроме того, рекомендована разработка нового маркера нарушения эпигенетической регуляции при раке на основе определения снижения экспрессии гена LAMC3.

Предложенная модификация метода поиска дифференциально метилированных CpG-островков и проведенная характеристика эпигенетической патологии ряда генов при РМЖ будут использованы в дальнейшем при разработке новых панелей диагностических маркеров канцерогенеза.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Д.В., Немцова М. В., Стрельников В. В. и др. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях // 2004. Молекулярная биология. 38(2), 213−223.
  2. В.В., Жевлова А. И., Стрельников В. В. и др. Аномальное метилирование некоторых генов-супрессоров при спорадическом раке молочной железы.// Мол. Биол. 2003,4, 693−703.
  3. В.В., Стрельников В. В., Зборовская И. Б. и др. Аномальное метилирование CpG-островков генов pl6/CDKN2A и pl4/ARF при немелкоклеточном раке легкого и остром лимфобластном лейкозе. // 2004. Молекулярная биология. 38(6), 966−972.
  4. М.А., Иванов А. А., Северин С. Е. Межклеточное взаимодействие // 2003. М. «Медицина». С. 82.
  5. Abe М., Okochi Е., Kuramoto Т., Kaneda A., Takato Т., Sugimura Т., Ushijima Т. Cloning of the 5' upstream region of the rat pi 6 gene and its role in silencing. // 2002. Jpn. J. Cancer Res. 93(10), 1100−6.
  6. Amigorena S., Choquet D., Teillaud J.L., Kom H., Fridman W.H. Ion channel blockers inhibit В cell activation at a precise stage of the G1 phase of the cell cycle. Possible involvement of K+ channels. //1990. J. Immunol. 144,2038 2045.
  7. Amir R.E., Van den Veyver I.B., Wan M., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. //1999. Nat. Genet. 23(2), 185−188.
  8. Andersen T.I. et al. Prognostic significance of TP53 alteraions in breast carcinoma. // 1993. Br. J. Cancer. 68,540.
  9. Arapshian A., Kuppumbatti Y.S. et al. Methylation of conserved CpG sites neighboring the beta retinoic acid response element may mediate retinoic acid receptor beta gene silencing in MCF-7 breast cancer cells. // 2000. Oncogene. 19,4066−4070.
  10. Arver В., Du J., Chen L. et al. Hereditary breast cancer. // 2000. Semin. Cancer Biol. 10, 271−288.
  11. Bachman K.E., Herman J.G., Corn P.G. etal. Methylation-associated Silencing of the Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-3 Gene Suggests a Suppressor Role in Kidney, Brain, and Other Human Cancers. //1999. Cancer Res. 59,798−802.
  12. Baylin S.B., Herman J.G., Graff J.R., et al. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia//1998. Adv. Cancer. Res. 72,141−196.
  13. Benedict W.F., Xu H-J., Takahashi R. The retinoblastoma gene: its role in human malignancies. // 1990. Cancer Invest. 8,535−540.
  14. Berns E.M. et al. Association between RBI gene alterations and factors of favourable prognosis in human breast cancer without effect on survival. // 1995. Int. J. Cancer. 64, 140.
  15. Bestor Т.Н. The DNA methyltransferases of mammals // 2000. Hum. Mol. Genet. 9, 2395 2402.
  16. Bhatia K., Siraj A., Hussain A., Bu R., Gutierrez M. The Tumor Suppressor Gene 14−3-3 er is commonly methylated in normal and malignant lymphoid cells. // 2003, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 12,165.
  17. Bianco Т., Chenevix-Trench G., Walsh D.C. et al. Tumor-specific distribution of BRCA1 promoter region methylation supports a pathogenetic role in breast and ovarial cancer. // 2000. Carcinogenesis. 21,147−151.
  18. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. // 2002. Genes & Dev. 16,621.
  19. Bishop D.T. BRCA1 and BRCA2 and breast cancer incidence. // 1999. Ann. Oncol. 10, 113−119.
  20. Borresen-Dale A.L. TP53 and breast cancer. // 2003. Human Mutat. 21,292−300.
  21. Bovenzi V., Le N.L., Cote S. et al. DNA methylation of retinoic acid receptor beta in breast cancer and possible therapeutic role of 5-aza-2'-deoxycytidine. // 1999. Anticancer Drugs. 10,471−476.
  22. Brock G.J.R., Huang Т.Н., Chen C., Johnson K.J. A novel technique for the identification of CpG islands exhibiting altered methylation patterns (ICEAMP). // 2001. Nucleic Acids Res. 29,123.
  23. Chan J.K., Wong C.S. Loss of E-cadherin is the fundamental defect in diffuse-type gastric carcinoma and infiltrating lobular carcinoma of the breast. //2001. Adv. Anat. Pathol. 8,165−172.
  24. Chan T.A., Hermeking H., Lengauer C. et al. 14−3-3Sigma is required to prevent mitotic catastrophe after DNA damage. //1999. Nature. 401,616−620.
  25. Chedotal A., Keijan G., Moreau-Fauvarque C. The brain within the tumor: new role for axon guidance molecules in cancers. // 2005. Cell Death Differ. 12(8), 1044−1056.
  26. Chen R.Z., Pettersson U., Beard C., et al. DNA hypomethylation leads to elevated mutation rates //1998. Nature. 395(6697), 89−93.
  27. Christensen C.R., Klingelhofer J., Tarabykina S., Lukanidin E. et al. Transcription of a novel mouse semaphorin gene, M-semaH, correlates with the metastatic ability of mouse tumor cell lines //1998. Cancer. Res. 58,1238 1244.
  28. Clement G., Bosnian F., Fontolliet C., Benhattar J. Monoallelic methylation of the APC promoter is altered in normal gastric mucosa associated with neoplastic lesions. // 2004. Cancer. Res. 64,6867.
  29. Conway K.E., McConnell B.B., Bowring C.E. et al. TMS1, a Novel Proapoptotic Caspase Recruitment Domain Protein, Is a Target of Methylation-induced Gene Silencing in Human Breast Cancers // 2000. Cancer Res. 60,6236−6242.
  30. Costello J.F., Plass C. Methylation matters // 2001. J. Med. Genet. 38,285−303.
  31. Costello J.F., SmiragliaD.J., Plass C. Restriction landmark genome scanning // 2002. Methods. 27(2), 144−149.
  32. Cross H., Charlton J., Xinsheng N., Bird A. Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column //1994. Nat. Genet. 6,236−244.
  33. Cross S.H., Bird A.P. CpG islands and genes //1995. Curr. Opin. Genet. Dev. 5(3), 309 314.
  34. Deng G. et al. Loss of heterozygosity and p53 gene mutations in breast cancer. // 1994. Cancer Res. 54,499.
  35. Deng G., Chen A., Hong J., Chae H.S., Kim Y.S. Methylation of CpG in a small region of the hMLHl promoter invariably correlates with the absence of gene expression. // 1999. Cancer Res. 59,2029−33.
  36. Du Y., Carling Т., Fang W. et al. Hypermethylation in Human Cancers of the RIZ1 Tumor Suppressor Gene, a Member of a Histone/Protein Methyltransferase Superfamily. //2001. Cancer Res. 61, 8094−8099.
  37. Duliami E., Hillinck J., Ibanez de Caceres et al. Tumor supperssor gene promoter hypermethylation in serum of breast cancer patients. // 2004. Clin. Cancer Res. 10, 61 896 193.
  38. Enmark E., Pelto-Huikko M., Grandien K. et al. Human estrogen receptor beta-gene structure, chromosomal localization, and expression pattern. // 1997. J. Clin. Endocr. Metab. 82,4258−4265.
  39. Esteller M., Corn P.G., Urena J.M. et al. Inactivation of glutathione S-transferase PI gene by promoter hypermethylation in human neoplasia. // 1998. Cancer Res. 58,4515−4518.
  40. Esteller M., Sparks A., Toyota M., Sanchez-Cespedes M. Analysis of Adenomatous Polyposis Coli promoter hypermethylation in human cancer. // 2000. Cancer Res. 60, 4366.
  41. M., С orn P., В aylin S., H erman J. A gene hypermethylation profile of human cancer. //2001. Can.Res. 61,3225−3229.
  42. Evron E., Dooley W.C., Umbricht C.B. et al. Detection of breast cancer cells in ductal lavage fluid by methylation-specific PCR. // 2001b. Lancet. 357,1335−1336.
  43. Evron E., Dooley W.C., Umbricht C.B. et al. Detection of breast cancer cells in ductal lavage fluid by methylation-specific PCR. // 2001. Lancet. 357, 1335−1336.
  44. Evron E., Umbricht C.B., Korz D. et al. Loss of Cyclin D2 Expression in the Majority of Breast Cancers Is Associated with Promoter Hypermethylation // 2001a. Cancer Res. 61, 2782−2787.
  45. Ferguson A.T., Nass S.J. DNA methylation and breast cancer. // 2000. Oncogene, 6, 1398−1409.
  46. Ferguson A.T., Evron E., Umbricht C.B. et al. High frequency of hypermethylation at the 14−3-3 a locus leads to gene silencing in breast cance // 2000. PNAS, 97,6049.
  47. Frigola J., Ribas M., Risques R., Peinado M.A. Methylome profiling of cancer cells by amplification of inter-methylated sites (AIMS). // 2002. Nucleic Acids Research 30(7) -e28.
  48. Ge K., DuHadaway J., Du W., Herlyn M., Rodeck U., Prendergast G.C. Mechanism for elimination of a tumor suppressor: Aberrant splicing of a brain-specific exon causes loss of function of Binl in melanoma. //1999. PNAS. 96,9689−94.
  49. Ge K., Duhadaway J., Sakamuro D., Wechsler-Reya R., Reynolds C., Prendergast G.C. Losses of the tumor suppressor BIN1 in breast carcinoma are frequent and reflect deficits in programmed cell death capacity. // 2000. Int. J. Cancer. 85(3), 376−83.
  50. Ge K., Minhas F., Duhadaway J., et al. Loss of heterozygosity and tumor suppressor activity of Binl in prostate carcinoma. // 2000a. Int. J. Cancer. 86(2), 155−61.
  51. Givant-Horwitz V., Davidson В., Reich R. Laminin-Induced Signaling in Tumor Cells: The Role of the Mr 67,000 Laminin Receptor // 2004. Cancer Res. 64,3572 3579.
  52. Gonzalgo M.L., Jones P.A. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). //1997. Nucleic Acids Res. 25,2529−2531.
  53. Gonzalgo M.L., Liang G., Spruck C.H., Zingg J.M., Rideout W.M., Jones P.A. Identification and characterization of differentially methylated regions of genomic DNA by methylation-sensitive arbitrarily primed PCR. //1997. Cancer Res. 57,594 599.
  54. Graff J.R., Herman J.R., Myohanen S. et al. Mapping patterns of CpG island methylation in normal and neoplastic с ells i mplicated b oth u pstream a nd d ownstream r egion i n d e novo methylation. //1998. J. Biol. Chem. 227,22 322−22 329.
  55. Han S., Ahn S.H., Park K. et al. P16INK4a protein expression is associated with poor survival of the breast cancer patients after CMF chemotherapy. // 2001. Breast Cancer Res. Treat. 70,205−212.
  56. Hao J., Yang Y., McDaniel K.M., Dalkin B.L., Cress A.E., Nagle R.B. Differential expression of laminin 5 (alpha 3 beta 3 gamma 2) by human malignant and normal prostate. //1996. Am. J. Pathol. 149,1341 1349.
  57. Hatada I., Kato A., Morita S., Obata Y., Nagaoka K., Sakurada A., Sato M., Horii A., Tsujimoto A., Matsubara K. A microarray-based method for detecting methylated loci. // 2002. J. Hum. Genet. 47(8), 448−451.
  58. Herman J.G., Merlo A., Mao L., et al. Inactivation of the CDKN2/pl6/MTSl gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers. // 1995. Can. Res. 55,4525−4530.
  59. Ни X.C., Wong I.H., Chow L.W. et al. Tumor-derived aberrant methylation in plasma of invasive ductal breast cancer patients. // 2003. Oncol. Rep. 10,1811−1815.
  60. Hughes F.M. Jr, Bortner C.D., Purdy G.D., Cidlowski J.A. Intracellular K+ Suppresses the Activation of Apoptosis in Lymphocytes //1997. J. Biol. Chem. 272,30 567 30 576.
  61. Hui R., Macmillan RD., Kenny FS et al. INK4a gene expression and methylation in primary breast cancer: overexpression of pl6INK4a messenger RNA is a marker of poor prognosis // 2000. Clin. Cancer Res. 6,2777−2787.
  62. Issa J.P. Aging, methylation and cancer // 2000. Histol. Histopathol. 15(3), 835−842.
  63. Ito Y., Kobayashi Т., Takeda T. et al. Expression of pi 6 and cyclin-dependent kinase 4 protein in primary breast carcinomas // Oncology. 54, 508−515.
  64. Jackers P., Minoletti F., Belotti D., Clausse N., Sozzi G., Sobel M.E. Isolation from a multigene family of the active human gene of the metastasis-associated multifunctional protein 37LRP/p40 at chromosome 3p21.3 //1996. Oncogene. 1. 13(3), 495−503.
  65. Jacob S., Moley K.H. Gametes and Embryo Epigenetic Reprogramming Affect Developmental Outcome: Implication for Assisted Reproductive Technologies // 2005. Pediatr. Res. 58,437 446.
  66. Jahr S., Hentze H., Englisch S. et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. // 2001. Cancer Res. 61,1659−1665.
  67. Jones P.A., Laird P.W. Cancer epigenetics comes of age //1999. Nat. Genet. 21(2), 163 167.
  68. Kaneda A., Kaminishi M., Yanagihara K. et al. Identification of silencing of nine genes in human gastric cancers. // 2002. Cancer Res. 62,6645−6650.
  69. Kennet S.B., Udvadia A.J., Horowitz J.M. Sp3 encodes multiple proteins that differ in their capacity to stimulate or repress transcription. // 1997. Nucleic Acids Res., 26, 31 103 117.
  70. Kerangueven F., Noguchi Т., Coulier F., et al. Genome-wide search for loss of heterozygosity shows extensive genetic diversity о f human breast с arcinomas. //1997. Cancer Res. 57, 5469−74.
  71. Keijean A., Dupont J.M., Vasseur C., et al. Establishment of the paternal methylation imprint of the human H19 and MEST/PEG1 genes during spermatogenesis // 2000. Hum. Mol. Genet. 9,2183−2187.
  72. Kious B.M., Baker C.V., Bronner-Fraser M., Knecht A.K. Identification and characterization of a calcium channel gamma subunit expressed in differentiating neurons and myoblasts // 2002. Dev Biol. 243(2), 249−259.
  73. Koch M., Olson P.F., Albus A., Jin W., Hunter D.D., Brunken W.J. Characterization and Expression of the Laminin Y3 Chain: A Novel, Non-Basement Membrane-associated, Laminin Chain. // 1999. J. Cell Biol. 145,605 618.
  74. Krassenstein R., Sauter E., Dulaimi E., et al. Detection of breast cancer in nipple aspirate fluid by CpG island hypermethylation. // 2004. Clin. Cancer Res. 10,28−32.
  75. Kuiper, G. G., Enmark, E., Pelto-Huikko, M., et al. Cloning of a novel estrogen receptor expressed in rat prostate and ovary. // 1996. PNAS 93,5925−5930.
  76. Kuroki Т., Trapasso F., Yendamuri S., Matsuyama A., et al. Allelic Loss on Chromosome 3p21.3 and Promoter Hypermethylation of Semaphorin 3B in Non-Small Cell Lung Cancer // 2003. Cancer Res. 63,3352 3355.
  77. Lapidus R.G., Ferguson A.T., Ottaviano Y.L. et al. Methylation of estrogen and progesterone receptor gene 51 CpG islands correlates with lack of estrogen and progesterone receptor gene expression in breast tumors. // 1996. Clin Cancer Res. 2, 805 810.
  78. Lee W. H., Lee E. Y. The retinoblastoma gene: from its basic understanding as a signal mediator for growth find differentiation to its use in the treatment of cancer. // 1997. Gan To Kagaku Ryoho. 24,1368−1380.
  79. Liang G., Carol E., Hung D. et al. DNA methylation differences associated with tumor tissues identified by genome scanning analisis. //1998. Genomics. 53,260−268.
  80. Liu M.C., Gelmann E.P. P53 gene mutations: case study of a clinical marker for solid tumors. // 2002. Semin. Oncol. 29,246−257.
  81. Lodygin D., Epanchintsev A., Menssen A., et al. Functional epigenomics identifies genes frequently silenced in prostate cancer. // 2005. Cancer Res. 65,4218−27.
  82. Lupas A.N., Martin J. AAA proteins // 2002. Curr. Opin. Struct. Biol. 12(6), 746−753.
  83. Martin K.J., Kwan C.P., Nagasaki K., et al. Down-regulation of laminin-5 in breast carcinoma cells // 1998. Mol Med. 4(9), 602−613.
  84. Martin-Satue M., Blanco J. Identification of semaphorin E gene expression in metastatic human lung adenocarcinoma cells by mRNA differential display // 1999. J. Surg. Oncol. 72(1), 18−23.
  85. Melki J.R., Vincent P.C., Brown R.D. HypermethylationofE-cadherin in leukemia.// 2000. Blood 95,10,3208−3213.
  86. Meyyappan M., Wong H., Hull C., et al. Increased Expression of Cyclin D2 during Multiple States of Growth Arrest in Primary and Established Cells // 1998. Mol. Cell Biol. 18,3163−3172.
  87. Miyakura Y., Sugano K., Konishi F., et al. Extensive methylation of hMLHl promoter region predominates in proximal colon cancer with microsatellite instability. // 2001. Gastroenterology. 121(6), 1300−9.
  88. Miyamoto K., Asada K., Fukutomi Т., et al. Methylation-associated silencing of heparan sulfate D-glucosaminyl 3−0-sulfotransferase-2 (3-OST-2) in human breast, colon, lung and pancreatic cancers. // 2003. Oncogene. 22,274−280.
  89. J., О hlsson G., R ank F., С elis J. Down-regulation of the Tumor Suppressor Protein 14−3-3
  90. Nessling M., Richter К., Schwaenen С., et al. Candidate genes in breast cancer revealed by microarray-based comparative genomic hybridization of archived tissue. // 2005. Cancer Res. 65(2), 439−447.
  91. Nilius В., Wohlrab W. Potassium channels and regulation of proliferation of human melanoma cells //1992. J. Physiol. 445,537 548.
  92. Nilsson 0., Chrysis D., Pajulo 0. et al. Localization of estrogen receptors-alpha and -beta and androgen receptor in the human growth plate at different pubertal stages. // 2001. J. Endocrinol 177,319−326.
  93. Okano M., Bell D.W., Haber D.A., Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development // 1999. Cell. 99(3), 247−257.
  94. Olek A., Oswald J., Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. // 1996. Nucleic Acids Res. 24,5064 5066.
  95. Ottaviano Y.L., Issa J.P., Pari F.F., et al. Methylation of the estrogen receptor gene CpG island marks loss of estrogen receptor expression in human breast cancer cells // 1994. Cancer Res. 54,2552−2555.
  96. Ozcelik H., To M.D., Couture J., et al. Preferential allelic expression can lead to reduced expression ofBRCAl in sporadic breast cancer. // 1998. Int. J. Cancer. 77,1−6.
  97. Pancrazio J.J., Tabbara I.A., Kim Y.I. Voltage-activated K+ conductance and cell proliferation in small-cell lung cancer //1993. Anticancer Res. 13 (4), 1231−4.
  98. Pardo L.A., Camino D., Sanchez A., Alves F., Bruggemann A., Beckh S. Oncogenic potential of EAG K+ channels. //1999. EMBO J. 18,5540 5547.
  99. Parrella P., Poeta M., Altomare V., Fazio V. Nonrandom Distribution of Aberrant Promoter Methylation of Cancer-Related Genes in Sporadic Breast Tumors. // 2004. Clin. Cancer Res. 10, 5349.
  100. Parker C., Rampaul R.S., Pinder S.E., et al. E-cadherin as a prognostic indicator in primary breast cancer. // 2001. Br. J. Cancer. 85,1958−1963.
  101. Paulin R., Grigg G.W., Davey M.W., Piper A. A. Urea improves efficiency of bisulphite-mediated sequencing of 5 methylcytosine in genomic DNA. // 1998. Nucleic Acids Res. 26,5009−5010.
  102. Raizis A.M., Schmitt F., Jost J.P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation//1995. Anal. Biochem. 226(1), 161−166.
  103. Raman V., Martensen S.A., Reisman D., et al. Compromised HOXA5 function can limit p53 expression in human breast tumours. // 2000. Nature. 405,974−978.
  104. Rathi A., Virmani A.K., Schorge J.O. et al. Methylation profiles of sporadic ovarian tumors and nonmalignant ovaries from high-risk women. // 2002. Clin Cancer Res. 8, 3324−3331.
  105. Rein Т., Zorbas H., DePamphilis M.L. Active mammalian replication origins are associated with a high-density cluster of mCpG dinucleotides. // 1997. Mol. Cell. Biol. 17,416−426.
  106. Rice J.C. and Futscher B.W. Transcriptional repression of BRCA1 by aberrant cytosine methylation, histone hypoacetylation and chromatin condensation of the BRCA1 promoter. // 2000. Nucleic Acids Res. 28,3233−3239.
  107. Rice J.C., Ozcelik H., Maxeiner P., et al. Methylation of the BRCA1 promoter is associated with decreased BRCA1 mRNA levels in clinical breast cancer specimens. // 2000. Carcinogenesis. 21,1761−1765.
  108. Rood В., Zhang H., Weitman D., Cogen P. Hypermethylation of HIC-1 and 17p Allelic Loss in Medulloblastoma. // 2002. Cancer Res. 62,3794.
  109. Rush L.J., Dai Z., Smiraglia D.J., Gao X., Wright F.A., Caligiuri M.A., Plass C., et al. Novel methylation targets in de novo acute myeloid leukemia with prevalence of chromosome 11 loci // 2001. Blood. 97(10), 3226−3233.
  110. Saitoh S. et al. p53 gene mutations in breast cancers in midwestern U.S. women: Null as well as missens-type mutations are associated with poor prognosis. // 1994. Oncogen. 9,2869.
  111. Sakamuro D., Elliott K.J., Wechsler-Reya R., Prendergast G.C. BIN1 is a novel MYC-interacting protein with features of a tumour suppressor. // 1996. Nat. Genet. 14(1), 69−77.
  112. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. // 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.
  113. Sathyanarayana U.G., Padar A., Huang C.X., Suzuki M., et al. Aberrant Promoter Methylation and Silencing of Laminin-5-Encoding Genes in Breast Carcinoma // 2003. Clin. Cancer Res. 9,6389 6394.
  114. Sathyanarayana U.G., Padar A., Suzuki M., Maruyama R., et al. Aberrant Promoter Methylation of Laminin-5-Encoding Genes in Prostate Cancers and Its Relationship to Clinicopathological Features // 2003. Clin. Cancer Res. 9,6395 6400.
  115. Sathyanarayana U.G., Toyooka S., Padar A., Takahashi Т., et al. Epigenetic Inactivation of Laminin-5-encoding Genes in Lung Cancers // 2003. Clin. Cancer Res. 9,2665 2672.
  116. Shapir В., Chakrabarty M., Cohn E.M., et al. Determination of circulating DNA levels in patients with benign or malignant gastrointestinal disease. // 1983. Cancer. 51, 2116−2120.
  117. Sherr C.J., Weber J.D. The ARF/p53 pathway. // 2000. Curr.Opin.Genet.Dev., 10, 94−99.
  118. Silva J., Silva J.M., Dominguez G. et al. Concomitant expression of pl6INK4a and pl4ARF in primary breast cancer and analysis of inactivation mechanisms. // 2003. J Pathol. 199,289−297.
  119. Silva J.M., Dominguez G., Villanueva M.J., et al. Aberrant DNA methylation of the pl6/INK4a gene in plasma of breast cancer patients. // 1999. Br. J. Cancer. 80, 12 621 264.
  120. Skryma R.N., Prevarskaya N.B., Dufy-Barbe L., et al. Potassium conductance in the androgen-sensitive prostate cancer cell line, LNCaP: involvement in cell proliferation. // Prostate-1997. Vol. 33, № 2. -P. 112−122.
  121. Toyooka S., Toyooka K.O., Maruyama R., DNA methylation profiles of lung tumors. // 2001. Molecular Cancer Therapeutica 1,61−67.
  122. Toyota M., Ho C., Ohe-Toyota M. et al. Inactivation of CACNA1G, a T-type calcium channel gene, by aberrant methylation of its 5' CpG island in human tumors. // 1999. Cancer Res. 59,4535−4541.
  123. Tsutsumi M., Tsai Y.C., Gonzalgo M.L., Nichols P.W., Jones P.A. Early acquisition of homozygous deletions of pl6/pl9 during squamous cell carcinogenesis and genetic mosaicism in bladder cancer. // 1998. Oncogene. 17(23), 3021−7.
  124. Umbricht C.B., Evron E., Gabrielson E., et al. Hypermethylation of 14−3-3 sigma (stratifin) is an early event in breast cancer. // 2001. Oncogene. 20,3348−3353.
  125. Una J.A., Ferrando A.A., Velasco G., et al. Structure and expression in breast tumors of human TIMP-3, a new member of the metalloproteinase inhibitor family // 1994. Cancer Res. 54,2091−2094.
  126. Ushijima T. Detection and interpretation of altered methylation patterns in cancer cells. // 2005. Nat. Rev. Cancer- 5(3), 223−31.
  127. Ushijima Т., Morimura K., Hosoya Y., et al. Establishment of methylation-1д sensitive-representational difference analysis and isolation of hypo- and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors //1997. PNAS. 94,2284 -2289.
  128. Varley J.M., Armour J., Swallow J.E., et al. The retinoblastoma gene is frequently altered leading to loss of expression in primary breast tumors. // 1989. Oncogen. 4,725 729.
  129. Warnecke P.M., Stirzaker C., Melki J.R., et al. Detection and measurement of PCR bias in quantitative methylation analysis of bisulphite-treated DNA // 1997. Nucleic Acids Res. 25,4422 4426.
  130. Wechsler-Reya R., Sakamuro D., Zhang J., et al. Structural Analysis of the Human BIN1 Gene. Evidence for tissue-specific transcriptional regulation and alternate RNA splicing. // 1997. J. Biol. Chem. 272,31 453−58.
  131. Widschwendter M., Jones P.A. DNA methylation and breast cancirogenesis. // 2002. Oncogene 21, 5462−5482.
  132. Woodfork K.A., Wonderlin W.F., Peterson V.A., Strobl J.S. Inhibition of ATP-sensitive potassium channels causes reversible cell-cycle arrest of human breast cancer cells in tissue culture //1995. J. Cell Physiol. 162(2), 163−71.
  133. Xu X.C., Sneige N., Liu X., et al. Progressive decrease in nuclear retinoic acid receptor beta messenger RNA level during breast carcinogenesis // 1997. Cancer Res. 57,4992−4996.
  134. Yan P. S., Perry M.R., Laux D.E., Asare A.L., Caldwell C.W., Huang Т.Н. CpG1. land Arrays: An Application toward Deciphering Epigenetic Signatures of Breast «
  135. Cancer // 2000. Clin. Cancer Res. 6,1432 1438.
  136. Yan P. S., Shi H., Rahmatpanah F., et al. Differential distribution of DNA methylation within the RASSF1A CpG island in breast cancer. // 2003. Cancer Res. 63, 6178−86.
  137. Yoshida R., Kimura N., Harada Y., et al. The loss of E-cadherin, and -catenin expression is associated with metastasis and poor prognosis in invasive breast cancer. // 2001. Int. J. Oncol. 18,513−520.
  138. Yu S.P., Yeh C.H., Gottron F., Wang X., Grabb M.C., Choi D.W. Role of the outward delayed rectifier K+ current in ceramide-induced caspase activation and apoptosis in cultured cortical neurons //1999. J. Neurochem. 73(3), 933−941.
  139. Zaiss D.M.W., Standera S., Kloetzel P.-M., Sijts A.J.A.M. PI31 is a modulator of proteasome formation and antigen processing // 2002. PNAS. 99,14 344 14 349.
  140. Zochbauer-Muller S., Fong K.M., Maitra A., et al. 5' CpG Island Methylation of the FHIT Gene Is Correlated with Loss of Gene Expression in Lung and Breast Cancer // 2001. Cancer Res. 61,3581−3585.
Заполнить форму текущей работой

На отлично!