Принципы технологии получения противоопухолевых препаратов на основе моноклональных антител

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ Российского федерального агентства здравоохранения и социального развития Фармацевтический факультет Кафедра управления и экономики фармации и фармацевтической технологии Курсовая работа на тему:

Принципы технологии получения противоопухолевых препаратов на основе моноклональных антител Выполнила: студентка IV курса группы № 474

Соловьева О.Н.

Руководитель: к.б.н. Горлова И.С.

Н.Новгород, 2015

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ГИБРИДОМНОЙ ТЕОРИИ

2.1 ИММУНИЗАЦИЯ

2.2 СТАДИЯ СЛИЯНИЯ

2.3 СТАДИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ГИБРИДОМ В КУЛЬТУРЕ

2.4 СТАДИЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ.

2.5 ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА МКАТ

2.6 ПОЛУЧЕНИЕ ГОТОВОГО ПРЕПАРАТА

2.7 КОНТРОЛЬ ГОТОВОГО ПРЕПАРАТА

3. КЛАССИФИКАЦИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ МКАТ

4. МЕХАНИЗМ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ

5. КЛИНИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МКАТ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ГАТ — культуральная среда, содержащая гипоксантин — аминоптерин — тимидин МкАТ — моноклональные антител НАФ — неполный адъювант Фрейнда

ПАФ — полный адъювант Фрейнда

1.

ВВЕДЕНИЕ

Моноклональные антитела — это антитела, являющиеся продуктом одного клона и обладающие строго определённой специфичностью по отношению к антигенам. Моноклональные антитела гомогенны как по специфичности, так и по физико-химическим свойствам.

Современная технология получения моноклональных антител основана на совместном применении двух независимо возникших биологических подходов.

Первый из этих подходов связан с получением индуцированных миелом у мышей. Эти опухоли представляют собой продукты злокачественной пролиферации единичных клонов В-клеток, каждый из которых секретирует иммуноглобулины одного какого-то вида, причем некоторые из этих иммуноглобулинов реагируют с антигенами окружающей среды.

Второй метод заключается в получении гибридов путем слияния двух

соматических клеток. Разработка техники гибридизации соматических клеток широко проводилась после открытия феномена спонтанной гибридизации. При слиянии плазматических мембран клеток образуются клетки с двумя или большим числом ядер — гетерокарионы. После первого деления ядра сливаются и образуется одно ядро с набором хромосом от всех партнеров — образуется гибридная клетка. Низкую частоту слияния клеток увеличивают используя ряд реагентов: вирус Сендай, лизолецитин, полиэтиленгликоль (ПЭГ) .

Гибридома, полученная в результате слияния антителообразующей клетки лимфоидной ткани иммунизированного животного и клетки плазмацитомы, наследует от одной родительской клетки способность к секреции антител определенного идиотипа и от другой (клетки плазмацитомы) — способность к неограниченному росту in vitro.

На современном этапе созданы десятки тысяч высокоаффинных антител, связывающихся с белками, углеводами, нуклеиновыми кислотами, а также низкомолекулярными антигенами. На их основе получены коньюгаты с различными функциональными соединениями, токсинами, ферментами, магнитными частицами, радиоактивными и рентгеноконтрастными атомами и т. п. Эти коньюгаты находят широчайшее применение в научных исследованиях, медицине, ветеринарии.

2. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ГИБРИДОМНОЙ ТЕОРИИ Смысл гибридомной технологии заключается в создании гибридной клетки (получившей название «гибридома»), получаемой путем слияния антителопродуцирующего В-лимфоцита и опухолевой клетки миеломного или плазмацитомного ряда. Такая гибридома, как уже было сказано ранее, обладает свойством секретировать антитела, взятой у В-лимфоцита, и способностью к бесконечному делению, взятой у опухолевой клетки.

Источником В-лимфоцитов для получения гибридомы служат лимфоидные органы животного, гипериммунизированного тем антигеном, против которого хотят получить МкАТ. Гипериммунизация сильно повышает процентное содержание В-лимфоцитов, продуцирующих антитела желаемой специфичности, в общей популяции клеток лимфоидного органа. Лимфоциты, выделенные из тканей селезенки, лимфоузлов, периферической крови, не способны к самостоятельному делению и живут в культуре всего 10−14 дней. Миеломные клетки, напротив, могут жить и делиться в культуре сколь угодно долго, но не продуцируют антитела нужной специфичности (чаще используют линии миелом или плазмацитом, вообще не продуцирующие никаких антител).

В результате процедуры гибридизации (слияния) образуется гетерогенная популяция клеток, состоящая:

во-первых, из неслившихся клеток лимфоидного органа;

во-вторых, из неслившихся клеток миеломы;

в-третьих, из гибридов лимфоцит+лимфоцит и миелома+миелома;

в четвертых, из гибридов лимфоцит+миелома, из которых лишь часть стабильно продуцирует антитела нужной специфичности.

Понятно, что необходимо отделить интересующие клетки от всех остальных. От неслившихся лимфоцитов и гибридов лимфоцит + лимфоцит избавляться не нужно: через несколько дней они погибнут сами; от неслившихся опухолевых клеток и гибридов миелома + миелома избавляются с помощью селективных сред; среди оставшихся клеток (гибридов лимфоцит + миелома) отбирают нужные путем клонирования, когда из одной клетки выращивают популяцию клеток (клеточный клон) и отбирают среди таких клонов лишь те, которые стабильно продуцируют антитела требуемой специфичности.

Рассмотрим теперь подробнее каждый из этапов получения МкАТ.

2.1 ИММУНИЗАЦИЯ В первую очередь необходимо выбрать объект иммунизации. На сегодняшний день известны три вида гибридомных систем: мышиная, крысиная и человеческая. Самой распространенной сегодня является мышиная гибридома, а самая редкая — человеческая, чему имеется ряд причин:

а) мыши — наиболее хорошо изученный и доступный объект для работы в лаборатории, то же относится и к линиям мышиных миелом, используемых для слияния.

б) все линии крысиных миелом, адаптированные для гибридомных работ, запатентованы, поэтому коммерческое использование крысиных гибридом регламентируется соответствующими патентами.

в) гипериммунизацию грызунов провести проще, чем иммунизацию человека. В большинстве случаев гипериммунизация человека вообще невозможна по этическим соображениям.

г) источником иммунных В-лимфоцитов грызунов могут служить ткани любых лимфоидных органов, тогда как у человека возможно лишь взять периферическую кровь, где общее содержание В-лимфоцитов не превышает 20% от всех клеток.

д) при получении человеческой гибридомы существует проблема гистосовместимости клеток миеломы и В-лимфоцитов: у грызунов для слияния берутся В-лимфоциты и клетки миеломы, полученные от одной линии животных, и поэтому имеющих сходный репертуар антигенов гистосовместимости на клеточных поверхностях. Для человека это условие недостижимо, что в конечном итоге выражается очень низкой эффективностью слияния и крайне нестабильной антителопродукцией человеческих гибридом.

е) мышиные и крысиные антитела достаточно просто нарабатывать в асцитных жидкостях; для человеческих гибридом возможна наработка лишь в культуре, либо с применением генноинженерных методов.

Для иммунизации могут быть использованы мыши в возрасте 3−4 месяцев любого пола. Важно установить, что у мышей, клетки которых предполагается использовать в экспериментах по слиянию, в ответ на введение данного иммуногена образуются антитела. Известны 2 схемы иммунизации:

1. короткая схема иммунизации заключается в том, что антиген вводят дважды с двухнедельным интервалом в подушечки задних лап. Количество вводимого антигена берут в пределах от 5 до 200 мкг на мышь в зависимости от его доступности и иммуногенности, для токсичных антигенов доза может быть понижена до 0,1 мкг. Для первого введения антигена (раунда иммунизации) раствор антигена объемом 50−200 мкл смешивают с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), представляющего собой минеральное масло со взвесью убитых микобактерий. При активном перемешивании раствора антигена с ПАФ получается мелкодисперсная эмульсия, призванная замедлить и пролонгировать поступление антигена в ткани. Считается, что убитые микобактерии усиливают иммунный ответ. Второй раунд иммунизации проводят так же, как и первый, но с использованием неполного адъюванта Фрейнда (НАФ), в котором отсутствуют микобактерии.

В случае проблемных антигенов полезно иммунизировать группу животных разными дозами антигена и с использованием разных схем иммунизации. На третий или четвертый день после второго раунда иммунизации нужно взять пробы крови и проанализировать их на содержание антител против требуемого антигена. Для дальнейшей работы выбирают животное с максимальным титром. На четвертый день после второго раунда иммунизации животное забивают, и клетки подколенных лимфоузлов сливают с клетками миеломы;

2) в случае неэффективности короткой схемы иммунизации используют различные виды длинных схем. При этом обычно животных иммунизируют с интервалом 2−4 недели либо внутрибрюшинно, либо подкожно (реже внутривенно или орально), используя для первого раунда иммунизации ПАФ, а для последующих — НАФ.

На 10−14 день после каждого раунда иммунизации (начиная со второго) кровь иммунизируемых животных проверяют на содержание специфических антител. Если титр антител достиг желаемого уровня, проводят последний раунд иммунизации (называемый бустированием), вводя раствор антигена внутривенно без адъювантов, в количестве 1/10 от предыдущих доз. В результате бустирования избирательно стимулируются клоны, продуцирующие антитела высокой аффинности к антигену .

Некоторые приемы, позволяющие усилить иммунный ответ:

1. конъюгация (химическая сшивка) низкомолекулярного антигена (гаптена) с белком — носителем. Существует целый ряд низкомолекулярных соединений, не способных самостоятельно вызвать иммунный ответ по причине малого размера молекулы. В таких случаях гаптен конъюгируют с белком — носителем (часто в качестве белка — носителя берут бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин или гемоцианин улитки) и такой конъюгат используют для иммунизации. При этом возникает целый ряд проблем:

а) основной иммунный ответ будет направлен на белок — носитель, а не на молекулу гаптена, и это нужно будет учитывать при тестировании сывороток иммунизируемых животных и супернатантов гибридом. Тестирование должно отражать содержание антител именно к гаптену, а не к конъюгату в целом.

б) Пространственное строение гаптена (конформация), как правило, существенно изменяется в процессе конъюгирования с носителем, иногда настолько, что все антитела против участков гаптена, находящегося в составе конъюгата, не способны узнавать свободную молекулу гаптена. В таких случаях пробуют разные варианты конъюгирования, которые затрагивают при сшивке разные функциональные группы молекулы гаптена, либо используют разные «линкеры" — органические соединения, связывающие функциональные группы гаптена и белканосителя и увеличивающие экспонированность гаптена на поверхности носителя.

В целом метод конъюгирования хорошо зарекомендовал себя при получении антител против низкомолекулярных соединений.

Б) В том случае, когда мышей иммунизируют клетками человека, наблюдается выраженный ответ на видоспецифические антигены. Для того, чтобы направить иммунный ответ мышей на антигены, селективно экспрессированные на поверхности определенных клеток, может быть использован метод «маскировки» антителами. Например, он был успешно использован при получении моноклональных антител, специфичных к антигенам, избирательно эксперссированным на клетках миелоидного ряда человека. Клетки миелоидного ряда, которыми иммунизировали мышей для эксперимента по гибридизации, были нагружены мышиными антителами к лейкоцитам периферической крови человека. Смысл данного подхода заключается в том, что, нагружая клетки, удается замаскировать иммуногенные поверхностные белки, экспессируемые клетками человека.

Введенный внутрибрюшинно или внутривенно антиген достигает селезенки, и с этого момента данный орган обычно становится источником антитело-продуцирующих клеток, которые используются в экспериментах по слиянию.

2.2 СТАДИЯ СЛИЯНИЯ Успех экспериментов по гибридизации во многом зависит от тщательного и адекватного манипулирования с клетками во время процесса их слияния. В качестве сливающего агента используют полиэтиленгликоль. На стадии слияния выделяют следующие этапы:

1. суспензии клеток селезенки или лимфатического узла, выделенных из иммунизированной мыши, получают стандартным способом в «ледяном» забуференном фосфатами физиологическом растворе.

2. клетки миеломы выращивают в среде RPMI-1640, содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коровы (10−20%), пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин 100 мкг/мл), амфотерицин (0,25 мкг/мл) и 2-меркаптоэтанол (5*10−5 М). Такая среда называется полной средой. Она же используется и для добавления ГАТ — ингредиентов (культуральная среда, содержащая гипоксантин — аминоптерин — тимидин). Состав данной среды обусловлен следующими факторами. Нормальные соматические клетки (В-лимфоциты) могут использовать два метаболических пути синтеза нуклеотидов (пуринов и пиримидинов): основной и резервный путь.

В случае основного пути синтеза de novo нуклеотидов они образуются из аминокислот и углеводных предшественников. При резервном пути синтез нуклеотидов осуществляется из гипоксантина или дезокситимидина. Если по каким-либо причинам основной метаболический путь синтеза нуклеотидов блокируется (например, аминоптерином), то в нормальных клетках используется резервный путь синтеза нуклеотидов. В таком случае включается в работу фермент гипоксантин-гуанидин фосфорибозилтрансфераза и тимидинкназа, что обеспечивает синтез нуклеотидов по запасному пути. Клетки миеломы, используемые для гибридизации с В-лимфоцитами, отбираются мутантные, и у них отсутствуют указанные выше ферменты, таким образом такие клетки способны синтезировать нуклеотиды только по основному метаболическому пути.

Клетки миеломы, находящиеся в логарифмической фазе роста, собирают и отмывают однократно бессывороточной средой RPMI-1640.

3. Равные количества миеломных и лимфоидных клеток смешивают и дважды отмывают путем центрифугирования в бессывороточной среде RPMI-1640 при 37 °C.

4. К осадку клеток, разбитому с помощью легкого потряхивания центрифужной пробирки, добавляют 1 мл предварительно нагретого 40%-ного раствора ПЭГ. Клетки инкубируют около 1 мин в присутствии ПЭГ, который затем медленно разбавляют бессывороточной средой RPMI, добавляемой по каплям 5 мл в течение первых пяти минут, и затем более быстро еще 15—20 мл). После этого клетки центрифугируют и осторожно переносят с помощью пипетки во флакон, содержащий предварительно нагретую среду ГАТ.

5. На этой стадии к слившимся клеткам могут быть добавлены сингенные фидерные (питающие) клетки. Их получают, инъецируя 5—8 мл полной среды в брюшную полость неиммунизированной мыши. При обратном изъятии большей части этого объема отбирается такое количество перитонеальных макрофагов, которое достаточно для получения примерно 120 мл среды, содержащей фидерные клетки. Другими источниками фидерных клеток служат нормальная селезенка и тимус.

6. Плотность полученной смеси доводят до 1—5)-105 клеток/мл, после чего по 1 мл суспензии осторожно разливают в лунки 24-луночного планшета (или 96-луночного). Планшет переносят в термостат с регулируемым составом атмосферы и увлажнением.

День проведения эксперимента по слиянию обозначают как нулевой день — день 0. На 1-й, 2-ой, 3-ий день после слияния осторожно заменяют по 1 мл среды из каждой лунки на 1 мл среды ГАТ. Важно не потревожить клетки в лунках, в частности, избежать перемещения клеток на одну сторону лунки при добавлении свежей среды. Кроме того, чрезвычайно важно избежать перекрестного переноса клеток из одних лунок в другие. Если клетки не повреждаются во время смены среды, то начавшие расти гибридомы должны образовывать достаточно обособленные колонии, что видно под микроскопом.

2.3 СТАДИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ГИБРИДОМ В КУЛЬТУРЕ В первое время наличие больших количеств клеточных обломков, а также несинхронность гибели в среде ГАТ неслившихся миеломных клеток затрудняет обнаружение гибридных клеток. Однако через 7—9 дней начинают появляться небольшие кластеры клеток, имеющих типичную морфологию гибридом. В зависимости от изначальной плотности клеток в рассеваемой смеси в каждой лунке может оказаться один или более кластеров. В этот период надо следить не только за ростом гибридов и изменением цвета среды в лунках, но также и за наличием зараженных лунок, которые необходимо соответствующим образом обрабатывать.

Когда кластеры гибридных клеток достигнут размера 2—3 мм в диаметре, супернатанты (надосадочная жидкость) можно будет тестировать на наличие антительной активности. Иногда при использовании высокоиммуногенных антигенов при скрининге наблюдается высокий уровень фона, обусловленный антителами, синтезированными нормальными плазматическими клетками, которые не слились, но оказались в лунках на начальной стадии и продолжали секретировать антитела в течение нескольких дней после рассева. Эти остаточные антитела негибридомного происхождения можно удалить до проверки на активность, если при «подкармливании» хотя бы один раз полностью сменить среду и провести анализ через 1—-3 дня — время, необходимое для того, чтобы в среде появилось достаточное количество антител, секретированных гибридомой.

2.4 СТАДИЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ В зависимости от того, каким образом планируется использовать моноклональные антитела, их можно выделять множеством различных способов.

Полученную продуцирующую гибридому дважды клонируют на фидере из клеток селезенки и тимуса мышей. Для приготовления фидера кусочки тимуса и селезенки измельчают на гомогенизаторе Поттера в ростовой среде (например, RPMI-1640), взвесь клеток фильтруют через ткань и полученную суспензию клеток разливают по 0,1 мл в лунки 96 ячейкового микропланшета. Через несколько дней (3−7) содержимое лунок используют как фидер.

Клетки продуцирующего клона снимают пипетированием, подсчитывают и разводят ростовой средой до конечной концентрации 50 клеток в 10 мл. Полученную взвесь разливают по 0,1 мл в лунки фидера. Видимые колонии появляются через 10−14 дней.

Существует возможность консервирования гибридом при низкой температуре. Гибридомы необходимо замораживать на ранних стадиях во время развития культур, не дожидаясь получения массовой культуры, желательно в середине логарифмической фазы. Таким образом, получают банк культур, что позволяет возобновить культуру в случае ее гибели. Стабильные культуры гибридом выдерживают замораживаем в течение нескольких раз. Затем гибридомы суспендируют в среде RPMI-1640 с добавлением 20% сыворотки плода коровы и ДМСО в количестве 50−70 г/л. Клетки первоначально охлаждают до 2−4°С, а затем выдерживают в сосуде Дьюара в течение 1−3 ч и переносят в жидкий азот.

МкАТ выделяют из асцитической жидкости мышей, которым внутрибрюшинно инокулируют клетки продуцируемой гибридомы. Получение асцитической жидкости состоит в следующем: за 3−10 дней до инокуляции клеток гибридомами мышам внутрибрюшинно вводят мл вазелинового масла (полужидкого парафина или пристана — 2,6,10,14 — тетраметилпептадекан) для индукции роста гибридом в асцитной среде. 107 клеток гибридомы инокулируют мышам внутрибрюшиннои через 7−8 дней, в зависимости от накопления асцита, собирают асцитную жидкость. Асцитную жидкость, полученную от разных мышей, объединяют и центрифугируют в течение 20 мин при 2500 g (при 4°С). Супернатант асцитической жидкости, содержащей неочищенный раствор МкАТ хранят при -50°С. В асцитической жидкости мышей концентрация МкАТ может достигать — 5−10 мг/мл. На данной стадии необходимо обращать внимание на генотип и пол животных. Замечено, что использование гибридов мышей позволяет увеличить выход МкАТ в асцитической жидкости. Использование гибридов также позволяет уменьшить скорость роста опухолей. Увеличению выхода МкАТ способствует обработка полостей органов (брюшной, грудной, сердечной) 0.3 М раствором натрия хлорида.

2.5 ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА МКАТ Выделяют МкАТ путем аффинной хроматографии на сорбенте А-сефароза. Асцитную жидкость размораживают и центрифугируют в течение 20 мин при 2500 g (4°С). Супернатант диализуют против 0,1 М натрий фосфатного буфера, рН 8,0 в течение 12−16 ч при 4 °C. Полученный диализат наносят на колонку с протеин-А-сефарозой. После этого связавшиеся с сорбенотом иммуноглобулины элюируют 0,1 М цитратным буфером, рН 3,0. Полученный концентрат элюируют, например, ультрафильтрацией и используют для получения лекарственных препаратов.

2.6 ПОЛУЧЕНИЕ ГОТОВОГО ПРЕПАРАТА После проведения контроля (ВЭЖХ анализ) и подтверждения соответствия раствора МкАТ предъявляемым требованиям раствор стабилизируют полисорбатом 80, проводят стерилизующую фильтрацию через мембраны с размером пор 0,22 мкм и разливают в первичную упаковку в асептических условиях.

2.7 КОНТРОЛЬ ГОТОВОГО ПРЕПАРАТА Необходимо отметить, что получение препаративного количества МкАТ возможно не только из асцитической жидкости мышей, но и путем культивирования гибридом в культуральной среде. После отбора гибридомных клеток, синтезирующих необходимые антитела, можно приступить к их массовому производству. Гибридомы переносят на ростовую среду и начинают культивирование. При культивировании можно проводить добавление питательной среды или ее отдельных компонентов. С производством МкАТ в ростовой среде связан вопрос с отмиранием клеток в зависимости от условий культивирования. Клетки в культуре гибнут, используя 2 механизма. Первый механизм — некроз, связанный с пассивной гибелью клеток под воздействием экстремальных факторов. Второй механизм — апоптоз, связанный с программированием клеточной гибели. Этот ответ клетки является результатом реализации ее генетической информации под влиянием индукторов апоптоза, таких как уровень истощения в среде глюкозы, витаминов и аминокислот. Данный фактор должен учитываться при разработке оптимальных условий производства МкАТ (рис. 1) и требует всесторонней валидации процессов производства.

Основные методы контроля препаратов МкАТ позволяют полностью оценить качество предлагаемых препаратов:

1. Чистота и примеси — определение проводят методом ВЭЖХ.

2. Активность. Определение проводят биологическими методами с обязательным использованием стандартного образца.

3. Гомогенность. Определение проводят одним из вариантов электрофореза, например, электрофорезом в полиакриаламидном геле с додецилсульфатом при сравнении со стандартным образцом. Препарат считают гомогенным, если основные полосы образца и эталона совпадают по интенсивности.

4. Значение рН (проводят потенциометрически).

5. Содержание белка. Проводят УФ-спектрофотометрией.

6. Бактериальные эндотоксины определяют с помощью LAL-теста.

7. Стерильность.

8. Вода — определяется для лиофилизированных препаратов по методу Фишера.

9. Прозрачность, цветность, механические включения.

3. КЛАССИФИКАЦИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ МКАТ Среди препаратов, получаемых на основе моноклональных антител, выделяют 4 поколения, используемых в терапевтической практике Терапевтические МкАТ первого поколения по происхождению и составу представляют собой иммунноглобулины животных (в основном мыши). Несмотря на низкий уровень побочных эффектов, это поколение МкАТ имеет 3 основных недостатка:

ограниченная эффективность — Fc-фрагмент МкАТ животных не способен из-за видовых различий полноценно участвовать в иммунологических реакциях в организме человека;

развитие толерантности — чужеродное происхождение приводит к распознаванию МкАТ I поколения иммунной системой человека и выработке на них блокирующих антител (HAMA ответ);

«слабая» фармакокинетика — МкАТ животных нестабильны в кровотоке человека, быстро метаболизируются и выводятся.

После расшифровки последовательности генов иммуноглобулина человека и развития технологии получения синтетической кДНК на смену МкАТ первого поколения пришли химерные МкАТ — второе поколение. В этих препаратах антитело «собрано» из фрагментов молекул Ig человека и мыши, причем в приблизительно равных соотношениях. Данные антитела также могут приводить к HAMA-ответу.

Во второй половине 1990;х годов было разработано третье поколение МкАТ, в которых доля мышиных антиген-распознающих последовательностей составляет от 5 до 10%, а более 90% молекулы антитела представлены Ig человека.

Наконец, МкАТ четвертого поколения представляют собой полностью реконструированные молекулы Ig человека. Антитела четвертого поколения можно вводить многократно практически без риска развития блокирующего иммунного ответа, а фармакокинетические параметры этих препаратов приближены к эндогенным Ig человека (то есть продолжительность действия 4−8 нед, а период полувыведения в среднем составляет 20 дней) В рамках III-IV поколения были разработаны несколько структурных модификаций МкАТ. К наиболее перспективным для клинического использования МкАТ можно отнести следующие:

Токсические МкАТ — антитела с пришитыми на Fc-фрагмент бактериальным токсином или радиоизотопом.

Fab-фрагменты — моноспецифические участки МкАТ, способные связывать лиганд;

Биспецифические МкАТ — каждый из Fab-фрагментов антитела имеет свою специфичность, и эти антитела способны связывать два различных лиганда одновременно.

Фузион-протеины — химерные молекулы, в которых Fab-фрагменты антитела заменены последовательностями из других белков (например, этанерцепт представляет собой соединение рецепторов к фактору некроза опухолей с Fc-фрагментом молекулы IgG1.

Рассмотрим немного подробнее токсические МкАТ. Иммунотоксины являются препаратами направленного действия и предназначены для избирательной элиминации клеточных популяций. Иммунотоксины состоят из векторной молекулы и цитотоксического агента. Из цитотоксических агентов наиболее часто применяются растительные рибосоминактивирующие белки второго типа (РИБ II), к которым относится рицин (R60) и вискумин (ML I). Несмотря на то, что R60 синтезируются в семенах клещевины, а ML I — в листьях омелы белой, оба белка имеют сходную третичную структуру и механизм действия. В составе ML I и R60 входит связывающая (В) и каталитическая (А) субъединицы. В-субъединица имеет галактосвязывающие центры и взаимодействуют с клеточными рецепторами, содержащими терминальную галактозу. Каталитическая субъединица токсинов проникает в цитоплазму и модифицирует 28 S РНК эукариотических клеток, останавливая синтез белка на уровне трансляции. Замена В-цепи на векторную молекулу в ряде случаев позволяет получить высокоэффективный препарат направленного действия.

4. МЕХАНИЗМ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ Одним из возможных способов для лечения рака является использование препаратов, полученных на основе моноклональных антител, которые связываются только с клеточными антигенами раковых клеток и индуцируют иммунологическую реакцию против клетки мишени рака. Такое моноклональное антитело может быть также модифицирован для доставки токсина, радиоизотопа, цитокина или другого активного конъюгата (рис. 2).

Одним из широко используемых в терапии раковых заболеваний прпаратов является Ритуксимаб (ТМ «МАБТЕРА»). Антитело ритуксимаб представляет собой сконструированное генно-инженерным способом гибридное моноклональное антитело, направленное против эпитопа во внеклеточной части трансмембранной молекулы CD20. Антитело является гибридом антитела человека и мыши, в котором фрагмент антигенсвязывающей части (Fab) является мышиным, а фрагмент части Fc получен от человека. Белок CD20 экспрессируется на В-лимфоцитах, но не на стволовых клетках или на зрелых плазматических клетках. CD20 экспрессируется также на подавляющем большинстве В-клеточных лимфом. CD20 вовлечен в регуляцию трансмембранной проводимости кальция и прогрессии клеточного цикла, но точная его функция неизвестна.

При связывании ритуксимаба с CD20 опосредуется иммунологическое уничтожение клеток путем связывания комплемента с частью Fc-фрагмента с активацией каскада комплемента, а также путем активации антителозависимой клеточной цитотоксичности.

Особый интерес представляет препарат Авастин (Бевацизумаб), который является первым препаратом МкАТ, ингибирующих ангиогенез — рост сети кровеносных сосудов, поставляющих опухоли питательные вещества и кислород. Мишенью препарата является белок, называемый фактором роста эндотелия сосудов. (VEGF), который является важнейшим фактором ангиогенеза. Авастин представляет собой рекомбинантные гуманизированные (химерные) МкАТ IgG1 с молекулярной массой 149 кДа. Антитела образуют комплекс с VEGF и тем самым блокируют его активность, в результате чего прекращается поставка крови к опухоли.

Препарат РеоПро (Абциксимаб) ингибирует агрегацию тромбоцитов путем связывания с интактным глюкопротеиновым рецептором (GP II/IIIa), принимающим активное участие в агрегации тромбоцитов (рис. 3).

РеоПро ингибирует агрегацию тромбоцитов путем предупреждения связывания фибриногена, фактора Виллебранда и других адгезивных молекул с рецепторным участком GP II/IIIa на активированных тромбоцитах.

Пролиферация опухолевых клеток частично опосредована мембранными рецепторами и факторами роста, обнаруженными в организме и являющимися мишенями для нового класса таргетных препаратов, одним из которых является Цетуксимаб. Цетуксимаб представляет собой химерные МКАТ IgG1, которые связываются с экстрацеллюлярным доменом EGFR (рис.4).

противоопухолевый моноклональный антитело

EGFR представляет собой трансмембранный гликопротеин. Его экспрессия определяется в 80−89% случаев рака толстой кишки. В роли лигандов EGFR наиболее часто выступают ростовые факторы EGF и фактор некроза опухоли-б (TGF-б), а также амфирегулин, эпирегулин, HB-EGF и в-целлюлин. Они взаимодействуют с рецептором, вызывая его гомодимеризацию (связывание лигандом двух идентичных рецепторов) или гетеродимеризацию (связывание мономера EGFR с другим представителем семейства, например HER2 или HER3). В результате происходит активация тирозинкиназы во внутриклеточном домене с последующим аутофосфорилированием рецептора и инициацией каскадов сигнальной трансдукции, участвующих в процессе пролиферации и опухолевой прогрессии. Цетуксимаб обладает высокой специфичностью и примерно в 10 раз большей аффинностью к рецепторам эпидермального фактора роста, чем его естественные лиганды EGF и TGF-б. Связывание цетуксимаба с EGFR приводит к димеризации рецепторов с последующим эндоцитозом и внутриклеточной деградацией комплекса антитело-рецептор, в результате чего плотность EGFR на поверхности клеток снижается.

Другой механизм наблюдается при структурном несовершенстве Fc-фрагментов МКАТ, а также при использовании в качестве лекарственных препаратов Fab-фрагментов и фузион-протеинов. Эти препараты играют роль рецепторных или химических антагонистов, препятствуя связыванию эндогенного лиганда со своим рецептором и активации внутриклеточной системы передачи сигнала. В результате происходит модификация биологического ответа (отсюда и название этой подгруппы — модификаторы биологических реакций). МКАТ, к Fc-фрагментам которых присоединены токсины или радиоизотопы (гемтузумаб озогамицин и ибритумомаб), представляют собой систему целевой доставки токсических агентов к определенной популяции клеток. После связывания с клеточным рецептором они интернализуются и создают внутри клетки-мишени концентрацию токсина или изотопа, несовместимую с ее жизнью. При этом они не проникают в нормальные клетки, и их максимальная концентрация в тканях и жидкостях организма значительно ниже токсической.

Еще один интересный и очень перспективный в плане повышения активности и уменьшения нежелательных эффектов механизм действия характерен для особого типа МКАТ — абзимов, которые находятся пока в стадии разработки.

Абзимы — это антитела, обладающие одновременно и антиген-связывающей, и ферментативной активностью. Связываясь с лигандом, они способны необратимо его инактивировать за счет расщепления на короткие фрагменты, причем одна молекула абзима может уничтожить несколько молекул лиганда. В качестве примера можно привести моноклональный протабзим, гидролизующий поверхностный антиген gp120 ВИЧ, в результате действия которого у больных в течение длительного времени предотвращается персистенция ВИЧ.

5. КЛИНИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МКАТ По данным Управления по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (FDA) в настоящее время к использованию разрешены 17 терапевтических МКАТ и 6 наименований МКАТ для проведения радиоиммунографии, а еще 400 препаратов находятся на различных стадиях клинических испытаний.

Фактически МКАТ представляют собой технологию, способную обеспечить неограниченный источник высокоэффективных лекарственных препаратов в самых различных областях медицины. Но, учитывая относительную «молодость» этой области фармакологии и дороговизну производства, показаниями для уже зарегистрированных МКАТ являются тяжелые заболевания, для которых часто отсутствуют другие средства эффективной терапии.

Сегодня МКАТ в основном используются для терапии различных видов опухолей, а также для лечения хронических воспалительных заболеваний, в патогенезе которых присутствует аутоиммунный компонент

(ревматоидный артрит, болезнь Крона, псориаз, рассеянный склероз и т. д.) (табл.1).

Еще одна область медицины, где МкАТ себя хорошо зарекомендовали, — блокада реакции отторжения трансплантата после пересадки органов и тканей. Ряд антиинфекционных МкАТ (находящихся в стадии клинических испытаний) позволяет решить многие проблемы, связанные с вакцинацией пациентов с первичными и вторичными иммунодефицитами, а также с лечением инфекций, на возбудители которых в организме человека отсутствует полноценный иммунный ответ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гибридомы играют фундаментальную роль в прикладной иммунологии. Накопленный к настоящему времени опыт по разработке и клиническому использованию МкАТ позволяет смело назвать их «препаратами будущего». С появлением МкАТ в фармакологии исчезает один из наиболее трудоемких и непредсказуемых этапов создания лекарственных препаратов — начальный поиск эффективных и специфических действующих субстанций. Исходя из принципов получения МкАТ теперь достаточно определить ключевую молекулу, лимитирующую тот или иной патологический процесс, и при условии ее иммуногенности получение эффективного и высокоселективного лекарственного препарата является задачей чисто технической и быстро разрешимой.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абелеев Г. И. Моноклональные антитела. — Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова.

2. Антитела. Методы: Кн.1: Пер. с англ./Под ред. Д. Кэтти. — М.: Мир, 1991. — 287 с., ил. 115−130 стр.

3. Глава из книги «Введение в молекулярную иммунологию и гибридомную технологию»: [Электронный ресурс] //к.б.н. Солопова О. Н. URL: http://www.hybridoma.ru/glavi.htm. (Дата обращения: 11.05.2015).

4. Иммунология. В 3-х т. Т.3. Пер. с англ./ Под ред. У. Пола. — М.: Мир, 1987;1989. — 360 с., ил. 247−267 стр.

5. И. Г. Козлов. Моноклональные антитела — новая эра в фармакологии и терапии. //Кафедра фармакологии отдел иммунологии РГМУ.

6. Иммунология. Методы исследований. Пер. с англ./ Под общей ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. — М.: Мир, 1983. — 349 с., ил. 313−327 стр.

7.Краснопольский Ю. М., Борщевская М. И. Биотехнология иммунологических препаратов. — Харьков. Издательство «Фармитэк», 2008. — 312 стр., ил. 2 490 267 стр.

8. Моноклональные антитела. Использование в диагностике заболеваний и лечебные моноклональные антитела. Методические рекомендации для студентов лечебного, педиатрического, стоматологического и фармацевтического факультетов./Ю.И. Будчанов. — Тверь. 2012 г.

9. Новиков К. М., Малюченко Н. В. Моноклональные анттела против высокомолекулярного меланомо-ассоциириованного антигена как вектор для синтеза иммунотоксинов. — МГУ им. М. В. Ломоносова.