Изменение колонизационной резистентности кишечника при дисбактериозах, обусловленных антибиотиками широкого спектра действия

Актуальность исследования. Организм человека с населяющей его микрофлорой составляет единую экологическую систему — макроорганизм-микрофлора, при превышении компенсаторных возможностей которой возникают микроэкологические нарушения. В поддержании динамического равновесия между микрофлорой и макроорганизмом важная роль принадлежит макроорганизму, контролирующему с помощью разнообразных факторов состав микрофлоры (В.И. Вершинина, 1981; М. М. Шкарупета, 1990; J.P. Grill et al., 1995). С другой стороны, достигнутые в последние десятилетия успехи в изучении нормальной микрофлоры, позволили сформулировать положение, что нормальная микрофлора организма человека является своеобразным «экстракорпоральным органом, регулирующим биохимические реакции и физиологические функции макроорганизма в естественных условиях его обитания» (Б. А. Шендеров, 1998). Нормальная микрофлора выполняет множество функций, поддерживающих постоянство внутренней среды макроорганизма (Б.А. Шендеров, 1998; О. Н. Минушкин с соавт., 1999). Изменения в микробиоценозах служат предвестником отклонений в физиологическом состоянии макроорганизма (И.Н. Блохина, В. Г. Дорофейчук, 1979).

Одной из важнейших функций нормальной микрофлоры является поддержание в кооперации с организмом хозяина колонизационной резистентности макроорганизма, обеспечивающей его противоинфекционную защиту. Снижение колонизационной резистентности ведет к увеличению содержания условно-патогенных микроорганизмов в полостях организма, сообщающихся с внешней средой, развитию эндогенных инфекций, суперинфекций различных локализаций (В.М. Бондаренко с соавт., 1987; А. А. Ленцнер, Х. П. Ленцнер, 1986, 1988; Н. Н. Костюкова, 1989; К. Х. Алмагамбетов с соавт., 1991; А. В. Вальппев с соавт., 1997; Ю. В. Езепчук, 1998; К. Orrhage et al., 2000). Считается, что уровень и состояние колонизационной резистентности зависят от количественного и качественного состава микрофлоры в биоценозах и условий ее обитания (А.А. Воробьев с соавт., 1997; В. М. Бондаренко с соавт.,.

2003). Качественные и количественные изменения типичного для данного микробиоценоза состава микрофлоры определяется как дисбактериоз данного отдела (А.Ф. Билибин, 1975; В. Г. Петровская, О. П Марко, 1976; Б. В. Пинегин с соавт., 1984; В. Н. Красноголовец, 1989; ЕМ. Горская с соавт., 1994; В. М. Коршунов с соавт., 1994, 1997, 1999; А. А. Воробьев, Б. А. Шендеров с соавт., 1996,1997; В. Г. Лиходед с соавт., 1999; И. Б. Куваева, 2001: D. Hentegens, 1996). Причины возникновения дисбактериозов многочисленны и разнообразны (Т.А. Логадырь, 1990; О. Г. Крамарь, 1997; О. Н. Минушкин с соанг., 1999; Л. В. Крамарь с соавт., 2002; В. М. Бондаренко с соавт., 2003). Одной из ведущих причин, приводящих к развитию дисбактериозов кишечника, является широкое, не всегда обоснованное и рациональное использование антибиотиков (Б.А. Шендеров, 1988; Л. И. Кафарская с соавт., 1991; А. Ю. Барановский, Э. А. Кондрашина, 2000; В. М. Бондаренко с соавт., 2003; N. Lambert-Zechowsky et al., 1985). По данным отечественных исследователей дисбактериозы кишечника регистрируются у 65−90% населения страны.

В доступной литературе достаточно полно отражены вопросы изменения характера микрофлоры при дисбактериозах (И.А. Бочков с соавт., 1991; В. Г. Акимкин с соавт., 1996; Б. А. Ефимов с соавт., 1996; В. М. Коршунов с соавт., 2001; Н. Haenel, 1975; S.L. Gorbach, 1985), изучены биологические свойства условно-патогенных микробов, колонизирующих кишечник людей с дисбактериозом (И.Б. Куваева, Г. Г. Кузнецова, 1993; С. А. Калашникова, 1999; Н. В. Королева, 2001; Е. В. Кудря, 2002; Л. А. Леванова с соавт., 2002), описаны многочисленные изменения органов и систем (С.И. Сытник, 1988, 1994; Д. Г. Кулинич с соавт., 1992; А. А. Воробьев с соавт., 1996; Б. А. Шендеров, 1996; А. В. Валышев с соавт., 1997; И. Б. Куваева, 2001; Ю. В. Несвижский, 2003), видов обмена у людей с дисбактериозом (И.Б. Куваева, 1976; С. Д. Митрохин, 1989; С. Д. Митрохин, Б. А. Шендеров, 1991), разработана тактика восстановления микрофлоры у людей с дисбактериозом (А.А. Ленцнер с соавт., 1987; Е. А. Беюл с соавт., 1992; Б. А. Ефимов, 1993; Л. Н. Мазанкова, 1998; И. Е. Кюнкрикова, 2000; И. Б. Куваева, 2001; В. М. Бондаренко с соавт., 2003; R. Fuller, 1989; P.L. Conway et al., 1994).

Однако практически отсутствуют данные о механизмах развития дисбактериоза, нет единого мнения о связи дисбактериоза с иммунитетом. В частности, не до конца ясно, что первично в этом процессе — нарушения ли микрофлоры ведут к развитию иммунодефицитов, либо микроэкологические сдвиги в биоценозах развиваются вследствие неблагоприятного воздействия внешних факторов на систему защиты организма, особенно на местном уровне. Не до конца выяснены механизмы, влияющие на развитие микроэкологических изменений, увеличение численности условно-патогенных бактерий в биотопах организма.

Поскольку изменения количественного и качественного состава микрофлоры, определяющие уровень и состояние колонизационной резистентности, могут зависеть от действия конкретных факторов (в частности, от действия антибиотических препаратов) целью работы явилось изучение некоторых особенностей колонизационной резистентности при дисбактериозах кишечника, обусловленных антибиотическими препаратами. Для реализации цели предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить количественный и качественный состав микрофлоры кишечника взрослых людей с дисбактериозом, обусловленным введением антибиотических препаратов.

2. Исследовать биологические свойства представителей резидентной микрофлоры у людей с дисбактериозом.

3. Выявить микроэкологические изменения характера микрофлоры кишечника мышей в динамике экспериментального дисбактериоза, обусловленного разными антибиотиками широкого спектра действия.

4. Проследить за изменением биологических свойств микроорганизмов, представителей резидентной флоры, при экспериментальном дисбактериозе, обусловленном антибиотиками.

5. Определить изменение некоторых показателей неспецифической резистентности организма в динамике экспериментального дисбактериоза, обусловленного приемом антибиотика.

6. Сопоставить изменения факторов неспецифической резистентности организма с характером микроэкологических нарушений.

Научная новизна:

• Установлено, что при дисбактериозе, обусловленном приемом антибиотиков, как у взрослых людей, так и в эксперименте, отмечаются наиболее выраженные изменения со стороны таких представителей резидентной микрофлоры, как эшерихии и лактобактерии.

• Впервые установлено, что антибиотики широкого спектра действия существенно снижают активность кислородзависимых бактерицидных систем местных непрофессиональных фагоцитов (энтероцитов и колоноцитов). Наиболее значительное снижение активности отмечено в колоноцитах.

• Выявлено, что увеличение численности в микробной популяции эшерихий со сниженной ферментативной активностью и условно-патогенных бактерий зависит от активности кислородзависимых бактерицидных систем местных непрофессиональных фагоцитов (энтероцитов и колоноцитов).

Практическая значимость. Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии по теме «Отношение паразит-хозяин в биоценозах кишечника при лекарственном дисбактериозе» в рамках договора № 034/201/003 (2001;2005 гг.).

Полученные результаты позволили установить, что одним из механизмов, способствующих развитию микроэкологических изменений в кишечнике, может быть снижение активности местных факторов неспецифической защиты, в частности, активности кислородзависимых систем колоноцитов и энтероцитов.

Использование лактосодержащих продуктов функционального питания, в частности, кисло-молочного «Наринэ» может явиться средством профилактики дисбактериозов при проведении антибиотикотерапии препаратами широкого спектра действия.

Материалы диссертации включены в учебные программы и используются в лекционных и практических курсах кафедры биохимии и микробиологии Ростовского Государственного Университета для студентов, специализирующихся по микробиологии, а также Факультета Усовершенствования Врачей Ростовского Государственного Медицинского Университета по курсу микробиологии.

Разработано и внедрено в практику учебно-методическое пособие для студентов биолого-почвенного факультета РГУ «Симбионтная микрофлора желудочно-кишечного тракта человека. Дисбактериоз и его коррекция».

Получен патент на изобретение «Питательная среда для выделения лактобактерий» (№ 2 202 609 от 20.04.2003 г.).

Оформлен и представлен на согласование в ГИСК им. JI.A. Тарасевича Экспериментально-производственный регламент на питательную среду для выделения и культивирования бифидобактерий, жидкую (ГТ-среда).

Получено разрешение Комитета медицинских иммунобиологических препаратов на внедрение в практику без проведения Гос. испытаний питательной среды для выделения и культивирования бифидобактерий, жидкой (ГТ-среда) (Выписка из протокола № 6 от 14.06.2001 г.).

Материалы диссертации использованы при подготовке Аналитического обзора «Новые подходы к коррекции и профилактике дисбакгериозов», направленного в Департамент организации и развития медицинской помощи населению МЗ РФ.

Положения, выносимые на защиту:

• При дисбактериозе кишечника, обусловленном введением антибиотиков, как у людей, так и в эксперименте на животных, происходят значительные изменения в составе кишечных микробиоценозов. Изменения полостной и мукозной микрофлоры носят синхронный характер и выражаются в основном в изменениях количественного состава и характера популяций эшерихий и лактобактерий, где нарастает численность эшерихий со сниженной ферментативной активностью, гемолитических эшерихий, лактобактерий со сниженной кислотообразующей активностью.

• При дисбактериозе, обусловленном антибиотиками широкого спектра действия, изменяются биологические свойства представителей нормальной резидентной флоры. Существенно снижаются антагонистическая и адгезивная активности эшерихий и лактобактерий, что свидетельствует об утрате ими функции поддержания колонизационной резистентности.

• Под действием антибиотиков значительно изменяются показатели местной неспецифической резистентности: снижается активность кислородзависимых бактерицидных систем местных непрофессиональных фагоцитов. Снижение активности кислородзависимых бактерицидных систем предшествует изменениям в составе нормальной микрофлоры. Максимум снижения активности кислородзависимых бактерицидных систем коррелирует с повышением в составе нормальной микрофлоры количества эшерихий со сниженной ферментативной активностью и условно-патогенных микроорганизмов, особенно протея и гемолитических эшерихий. Использование «Наринэ» стимулирует активность кислородзависимых бактерицидных систем, приводит к уменьшению в кишечной микрофлоре количества эшерихий со сниженной ферментативной активностью и условно-патогенных бактерий.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии», посвященной 90-летию Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии (1999), научной конференции «Актуальные вопросы биологии и медицины», посвященной 30-летию кафедры микробиологии, вирусологии, и иммунологии Кабардино-Балкарского Государственного Университета (г. Нальчик, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 26 работ, изданы методические рекомендации, оформлен патент на питательную среду, оформлен экспериментально-производственный регламент.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов.

Список литературы

включает 266 источников, в том числе, отечественных 180 и зарубежных 86. Работа иллюстрирована 40 таблицами и 23 рисунками.

Выводы.

1. При дисбактериозе кишечника, обусловленном применением антибиотиков широкого спектра действия, происходят значительные изменения в составе кишечной микрофлоры, снижение показателей местной неспецифической защиты, что свидетельствует о нарушении колонизационной резистентности.

2. Изменение состава кишечной микрофлоры характеризуется уменьшением количества постоянных (резидентных) представителей микрофлоры (бифидобактерий, лактобактерий, эшерихий), увеличением частоты находок и количества эшерихий со сниженной ферментативной активностью, гемолитических эшерихий, изменением видового состава лактобактерий в сторону значительного уменьшения содержания Lactobacillus acidophilus, нарастанием количества лактобактерий со сниженной кислотообразующей активностью.

3. Эшерихии со сниженной ферментативной активностью и лактобактерии, выделенные, как от людей, получавших антибиотики, так и от животных с экспериментальным лекарственным дисбактериозом, обладают низкой антагонистической активностью в отношении условно-патогенных бактерий (протеи, клебсиеллы), низкой адгезивной активностью, а также приобретают персистентные характеристики, что свидетельствует об увеличении их агрессивности и снижении их роли в поддержании колонизационной резистентности кишечника.

4. Обнаружена четко выраженная зависимость между содержанием лизоцима в копрофильтратах людей, получавших антибиотики широкого спектра действия, и количеством бифидои лактобактерий в составе кишечной микрофлоры: снижение содержания данных эубионтов сопровождается достоверным снижением частоты обнаружения лизоцима в копрофильтратах.

5. Установлено, что при экспериментальном дисбактериозе, обусловленном использованием антибиотиков широкого спектра действия, происходит существенное изменение активности кислородзависимых бактерицидных систем профессиональных (перитонеальные макрофаги) и непрофессиональных (энтероциты и колоноциты) фагоцитов. Наиболее значительное снижение активности кислородзависимых бактерицидных систем регистрируется в колоноцитах и энтероцитах по сравнению с перитонеальными макрофагами, что указывает на снижение местной неспецифинеской резистентности.

6. Выявлена четко выраженная зависимость характера изменений микрофлоры кишечника от состояния активности кислородзависимых бактерицидных систем колоноцитов и энтероцитов: наибольшему снижению активности кислородзависимых бактерицидных систем соответствует максимальное количество эшерихий со сниженной ферментативной активностью и условно-патогенных микроорганизмов в составе микрофлоры.

7. Использование «Наринэ» с целью коррекции микрофлоры приводит. к повышению активности кислородзависимых бактерицидных систем местных фагоцитов и снижению количества условно-патогенных микроорганизмов.

Заключение

.

Дисбактериозы остаются актуальной проблемой здравоохранения. Микроэкологические изменения в микрофлоре кишечника регистрируются практически у 90% населения нашей страны (А.А. Воробьев с соавт., 1997). Накопленные знания позволяют считать микрофлору организма человека экстракорпоральным органом, выполняющим многообразные функции по поддержанию нормального гомеостаза (Б.А. Шендеров, 1998). Изменения в составе нормальной микрофлоры ведут к развитию процессов, сказывающихся на состоянии здоровья людей (И.Н. Блохина, 1979; Н. Н. Лизько, 1987; Е. М. Горская с соавт., 1992; А. А. Ленцнер, 1996; О. В. Бухарин, 1996; Б. А. Шендеров, 1996, 1998; В. М. Бондаренко с соавт., 2003).

Одной из важнейших функций нормальной микрофлоры является обеспечение колонизационной резистентности. Под колонизационной резистентностью понимают совокупность механизмов, придающих стабильность нормальной микрофлоре, предотвращающих заселение организма хозяина посторонними микроорганизмами (Б.А. Шендеров, 1988; О. В. Бухарин с соавт., 1996; А. А. Воробьев с соавт., 1997; В. М. Бондаренко с соавт., 2003). Снижение колонизационной резистентности, обусловленное различными причинами, приводит к значительному снижению противоинфекционной защиты организма, увеличению численности условно-патогенных микробов, их транслокации из мест первичной локализации с возможным развитием воспалительных заболеваний (В.Г. Петровская, 1982; К. Х. Алмагамбетов с соавт., 1991; В. М. Бондаренко 1996, 2003; О. В. Бухарин, 1999).

Колонизационная резистентность определяется множеством факторов, среди которых важное место занимают адгезивная и антагонистическая активности микробов, составляющих нормальную микрофлору, конкуренция за факторы питания и другие (Ю.В. Езепчук, 1985; В. И. Брилис, 1988; О. В. Бухарин, 1999). По мнению А. А. Воробьева с соавторами (1997), колонизационная резистентность зависит от количества и качества нормальной микрофлоры и условий ее обитания. Колонизационная резистентность также является одним из механизмов местного иммунитета и определяется состоянием иммунной системы. Однако до сих пор нет ясности в вопросе, что является первичным звеном в отношениях нормальной микрофлоры и иммунной системы. Возможно, что изменения в составе нормальной микрофлоры ведут к нарушению иммунного статуса, или, наоборот, изменения в состоянии иммунитета, наступающие под действием различных факторов, приводят к изменению в составе микробиоценозов (А.А. Воробьев с соавт., 1997).

Развитию дисбактериоза кишечника способствуют многие факторы, среди которых значительное место занимает нерациональное применение антибиотических препаратов. В доступной литературе последних лет (Е.М. Горская с соавт., 1995; А. Ю. Барановский с соавт., 2000; В. М. Бондаренко с соавт., 2003) прослежены изменения показателей общего иммунитета при дисбактериозе, обусловленном антибиотическими препаратами. В то же время, существует мнение (О.Н. Минушкин с соавт., 1999), что дисбактериоз является процессом, протекающим непосредственно на эпителиальных поверхностях слизистых оболочек, в частности, кишечника.

Поэтому представляло интерес проследить за изменением характера нормальной микрофлоры кишечника в зависимости от активности некоторых показателей местного иммунитета, что позволило бы выявить особенности колонизационной резистентности кишечника при дисбактериозе, обусловленном введением антибиотиков широкого спектра действия.

Так как колонизационная резистентность определяется составом нормальной микрофлоры (А.А. Воробьев с соавт., 1997), первым этапом исследования явилось изучение характера микроэкологических нарушений в составе микрофлоры кишечника людей, получавших короткие курсы антибиотических препаратов широкого спектра действия.

Анализ полученных данных позволил заключить, что применение антибиотических препаратов приводит к существенным изменениям в составе микробиоценоза кишечника. При этом в результате антибиотикотерапии изменяется состав постоянных представителей, как анаэробной, так и факультативно-анаэробной микрофлоры. Достоверно снижается количество бифидобактерий (lg 6,2 ± 0,5 КОЕ/г по сравнению с lg 8,4 ± 0,6 КОЕ/г в группе лиц не получавших антибиотики, t = 2,75). Отмечаются изменения в составе популяции эшерихий и лактобактерий: увеличивается содержание эшерихий со сниженной ферментативной активностью (lg 4,2 ± 0,4 КОЕ/г против lg 1,6 ± 0,4 КОЕ/г в группе лиц, не получавших антибиотики), гемолитических эшерихий (lg 1,03±0,8 против lg 0,3±0,03 КОЕ/г соответственно), лактобактерий со сниженной кислотообразующей способностью (в 3,6 раза по сравнению с людьми, не получавшими антибиотики).

В кишечной микрофлоре людей, получавших антибиотики, по сравнению с условно-здоровыми людьми, увеличивается количество условно-патогенных бактерий: лактозонегативных энтеробактерий (lg 2,45 ± 0,35 против lg 1,4 ± 0,3 КОЕ/г), бактерий рода Proteus (lg 1,3 ± 0,06 против lg 0,3 ± 0,03 КОЕ/г), гемолитических кокковых форм (lg 1,0 ± 0,05 против lg 0,5 ± 0,02 КОЕ/г), золотистых стафилококков (lg0,5 ± 0,01 против lg 0,3 ± 0,03 КОЕ/г), грибов рода Candida (lg 0,95 ± 0,06 против lg 0,7 ± 0,08 КОЕ/г).

В группе лиц, получавших антибиотики, достоверно чаще по сравнению с группой условно-здоровых людей встречаются случаи низкого содержания представителей резидентной микрофлоры. Особенно четко это выражено в популяциях эшерихий и лактобактерий. Случаи содержания эшерихий ниже 10 в группе лиц, получавших антибиотики, выявлены в 55,3 ± 2,0% случаев, тогда как в группе условно-здоровых лиц — в 17,2 ± 4,7% (t = 6,6). Сниженное содержание лактобактерий обнаружено в 69,5 ± 1,9% случаев против 42,2 ± 6,2% (t = 4,3). Сниженное количество бифидои лактобактерий сочеталось со снижением количества эшерихий с нормальной ферментативной активностью, что является характерной особенностью дисбиотических расстройств.

Анализ содержания в составе кишечной микрофлоры количества эшерихий со сниженной ферментативной активностью и гемолитических эшерихий в зависимости от количества присутствующих в кишечном микробиоценозе бифидои лактобактерий обнаружил отсутствие какой-либо связи. Гемолитические эшерихии и эшерихии со сниженной ферментативной активностью обнаруживались с одинаковой частотой как у людей с содержанием бифидои лактобактерий в пределах нормы, так и при их сниженном количестве (70,1 ± 2,7% и 66,7 ± 5,9% соответственно, t < 2).

Не удалось выявить какой-либо зависимости между содержанием бифидои лактобактерий в нормальном и сниженном количестве в составе микрофлоры и повышением численности лактозонегативных энтеробактерий. Видимо, как полагает В. Г. Лиходед с соавторами (1999), увеличение содержания в микробиоценозах гемолитических эшерихий и лактозонегативных энтеробактерий, определяется какими-то другими механизмами.

Так как в популяции эшерихий у людей, получавших антибиотики, существенно увеличивается количество эшерихий со сниженной ферментативной активностью, были изучены основные биологические свойства этих бактерий: антагонистическая, адгезивная активности, наличие персистентных характеристик. Обнаружено, что эшерихии со сниженной ферментативной активностью, по сравнению с эшерихиями с нормальной ферментативной активностью, обладают сниженной антагонистической, адгезивной, антилизоцимной активностью.

Антагонистическая активность эшерихий со сниженной ферментативной активностью сохраняется в отношении патогенных энтеробактерий: 75,3 ± 3,5% штаммов имели низкую, 24,6 ± 3,5% - среднюю и высокую степень активности в отношении шигеллсреди эшерихий с нормальной ферментативной активностью — 68,0 ± 6,6% и 32,0 ± 6,6% соответственно, t < 2. Существенно снижается антагонистическая активность по отношению к условно-патогенным энтеробактериям, имеющим большое значение при дисбактериозах кишечника. Так в отношении клебсиелл 90,0 ±.

2,4%, в отношении двух видов протеев 98,7 ± 0,9% и 100% штаммов эшерихий со сниженной ферментативной активностью обладали низкой степенью антагонистической активности (в случае эшерихий с нормальной ферментативной активностью — 64,0 ± 6,7%, 86,0 ± 4,9% и 76,0 ± 6,0%- t = 3,7, t = 4, t = 2,5 соответственно). В отношении протеев не выявлялись высокоактивные штаммы эшерихий со сниженной ферментативной активностью.

Низкий уровень среднего показателя адгезии обнаруживался у 56,0 ± 7,0% эшерихий со сниженной ферментативной активностью против 38,0 ± 6,8% эшерихий с нормальной активностью (t = 2). Среднеадгезивных и высокоадгезивных эшерихий со сниженной ферментативной активностью было зафиксировано соответственно 34,0 ± 6,7% и 10,0 ± 4,2% соответственно против 44,0 ± 7,0 и 18,0 ± 5,4% штаммов с нормальной ферментативной активностью.

Изменения биологических свойств эшерихий со сниженной ферментативной активностью может свидетельствовать об утрате ими своей роли в обеспечении колонизационной резистентности.

Изучение состава популяции лактобактерий, выделенных от людей, получавших антибиотики, показало, что существенно меняется их видовой состав. Так снижается число видов в популяции (у условно-здоровых — 14, у получавших антибиотики — 9), снижается численность L. acidophilus (с 12,0% в группе условно-здоровых до 1,4% в группе лиц, получавших антибиотики), появляются виды более свойственные другим отделам, в частности L. salivarius (12,0% против 1,0% у условно-здоровых людей), возрастает роль L. bulgaricus (1,4% против 1,0% соответственно).

Как известно, антагонистическая активность лактобактерий в отношении патогенной и условно-патогенной флоры складывается из их способности синтезировать биологически активные вещества. Изучение лизоцимной активности лактобактерий показало, что у людей, получавших антибиотики, достоверно реже обнаруживались штаммы, способные к синтезу лизоцима: 24,5 ± 4,3% против 37,6 ± 4,6% у условно-здоровых людей (t = 2, l).

Использование разработанной нами питательной среды для выделения лактобактерий (патент № 22 002 609 от 20.04.2003 г.) позволило выявить неоднородность популяции лактобактерий по признаку кислотообразования. У людей, получавших антибиотики, увеличивается количество лактобактерий со сниженной кислотообразующей активностью (51,4 ± 3,8% против 14,1 ± 4,3% в группе условно-здоровых людей, t = 6,7).

Большинство штаммов лактобактерий, выделенных от людей, получавших антибиотики, обладало низкой степенью антагонистической активности в отношении шигелл (55,5 ± 4,4% против 9,0 ± 2,8% в группе условно-здоровых лиц, t = 9,3), клебсиелл (77,4 ± 3,7% против 35,0 ± 4,8%, t = 7,1), двух видов протеев (76,6 ± 3,7% и 75,8 ± 3,8% против 21,0 ± 4,0% и 18,0 ± 3,8%, t = 10,3 и t = 10,9 соответственно). В группе лиц, получавших антибиотики, не обнаруживалось высокоактивных штаммов в отношении клебсиелл и протеев.

Полученные данные об изменении биологических свойств лактобактерий также свидетельствуют о частичной утрате ими способности к поддержанию колонизационной резистентности.

Обнаружение существенных качественных и количественных изменений в составе микробиоценозов кишечника людей, получавших антибиотики, и изменений биологических свойств основных представителей резидентной микрофлоры послужило основанием для проведения второго этапа исследования — экспериментального — воспроизведения дисбактериоза, обусловленного антибиотиками широкого спектра действия. Использование экспериментальной биологической модели позволило проследить не только за изменениями в составе полостной, но и пристеночной микрофлоры, а также показателей местной неспецифической резистентности организма.

Характер микрофлоры животных, получавших антибиотики, был сопоставлен с характером микрофлоры животных, не получавших антибиотики. Анализ полученных данных свидетельствует, что введение терапевтических доз антибиотиков привело к изменению характера полостного микробиоценоза.

Обращает на себя внимание, что количество бифидобактерий в результате антибиотикотерапии снизилось незначительно (lg 7,7 ± 0,2 КОЕ/г против lg 8,0 ± 0,6 КОЕ/г в группе контрольных животных), в то время как снижение количества лактобактерий было более выраженным (lg 6,3 ± 0,2 против lg 7,1 ± 0,5 КОЕ/г соответственно, t = 1,6). В составе полостной микрофлоры мышей достоверно снизилось количество эшерихий (lg 5,4 ± 0,3 против lg 7,4 ± 0,4 в группе интактных животных, t = 4). Существенно возросло количество условно-патогенных микроорганизмов, в том числе, лактозонегативных энтеробактерий (lg 2,5 ± 0,2 против lg 1,9 ± 0,6 КОЕ/г в контроле), бактерий рода Proteus (lg 2,8 ±0,1 против lg 2,1 ± 0,1 КОЕ/г), гемолитических форм в основном за счет кокковых видов (lg 2,3 ±0,1 против lg 0,4 ± 0,07 КОЕ/г), стафилококков, в том числе, золотистых (lg 1,6 ± 0,2 против lg 1,0 ± 0,3 КОЕ/г).

В результате антибиотикотерапии произошли изменения в составе мукозной микрофлоры. Мало изменилось количество бифидои лактобактерий, ассоциированных с поверхностью крипт. В составе эшерихий отмечено значительное увеличение их количества (lg 4,5 ± 0,2 против lg 2,2 ± 0,1 КОЕ/г в контрольной группе мышей), главным образом за счет эшерихий со сниженной ферментативной активностью, доля которых в популяции достигла 90%. В мукозной микрофлоре мышей, подвергшихся антибиотикотерапии, резко увеличилось содержание условно-патогенных бактерий. Количество гемолитических кокковых форм выросло в 18 раз (с lg 0,2 ±0,01 в контрольной группе до lg 3,6 ± 0,1 КОЕ/г у мышей с лекарственным дисбактериозом), лактозонегативных энтеробактерий — в 3,6 раза (с lg 1,2 ± 0,1 до lg 4,3 ±0,1 КОЕ/г соответственно), бактерий рода Proteus — в 9,25 раза (с lg 0,4 ± 0,02 до lg 3,7 ± 0,2 КОЕ/г соответственно), стафилококков, в том числе золотистых, и грибов рода Candida.

Поскольку мукозная микрофлора вносит основной вклад в обеспечение колонизационной резистентности (О.В. Чахава, 1982; Б. В. Пинегин с соавт., 1984; Д. Ван-дер-Ваай, 1992; M.J. Orrhage et al., 1994), изменение ее состава служит свидетельством нарушения колонизационной резистентности кишечника.

Использование различных антибиотиков для создания экспериментального лекарственного дисбактероза позволило сопоставить характер изменений в микробиоценозах кишечнка. Было обнаружено, что при сохранении основных тенденций, характеризующих нарушения состава кишечной микрофлоры, степень выраженности этих нарушений зависела от выбранного антибиотка. Отмечено, что из трех использованных антибиотиков наибольшее действие на состав микрофлоры оказывал гентамицин, в меньшей степени цефазолин, наиболее щадящим было действие ципрофлоксацина.

Был прослежен характер изменений состава кишечной микрофлоры мышей в динамике экспериментального лекарственного дисбактериоза.

Проведенные исследования количественного состава полостной и мукозной микрофлоры показали, что бифидои лактобактерии подвергались наименьшим изменениям. Численность их популяций на протяжении всего срока наблюдений практически мало отличалось от уровня значений контрольной группы.

В динамике дисбактериоза обнаруживались значительные изменения количества эшерихий. Так, наблюдавшееся на 3−5 сутки некоторое увеличение общего количества эшерихий (lg 7,8 ±0,1 против lg 7,4 ± 0,4 КОЕ/г у контрольных животных) в полостном микробиоценозе, сменялось резким падением их количества после 5-х суток (на 10-е сутки — lg 6,0 ± 0,2 КОЕ/г, к концу срока наблюдения — lg 4,0 ± 0,3 КОЕ/г). С 5-х суток наблюдений начинался рост численности эшерихий со сниженной ферментативной активностью. К 17-му дню их доля в популяции кишечных палочек приближалась к 100%.

В мукозной микрофлоре, начиная с 3−5 суток наблюдений, зафиксирован рост общего количества эшерихий и одновременное увеличение доли эшерихий со сниженной ферментативной активностью в структуре популяции, достигающей к 17-му дню 100%.

Численность условно-патогенных бактерий, как в полостном, так и мукозном микробиоценозе, увеличивалась уже к 5-м суткам наблюдений, в несколько раз превышая значения контрольной группы мышей. К концу срока наблюдений обнаруживалась тенденция к снижению количества условно-патогенных микроорганизмов, особенно четко выраженная в полостном биотопе.

Таким образом, изменения, отмеченные при экспериментальном дисбактериозе у животных, в определенной степени соответствуют изменениям, отмеченным в микробиоценозе кишечника людей, получавших антибиотики: изменяется структура популяции эшерихий в сторону нарастания численности эшерихий со сниженной ферментативной активностьюнарастает количество и частота высева условно-патогенных микроорганизмов, в частности, лактозонегативных энтеробактерий, протеев, стафилококков, гемолитических кокковых формнесколько снижается количество лактобактерий. Изменения в составе полостной и мукозной микрофлоры носят в основном синхронный характер.

Изучение биологических свойств эшерихий со сниженной ферментативной активностью, преобладающих в кишечнике мышей с экспериментальным лекарственным дисбактериозом, показало, что степень их антагонистической и адгезивной активности была низкой. Большинство штаммов обладало низкой антагонистической активностью в отношении P. mirabilis (66,7 ± 4,8%), P. vulgaris (63,6 ± 4,9%), S. aureus (62,5 ± 4,9%). В отношении шигелл и клебсиелл 42,7 ± 5,0% и 45,8 ± 5,1% штаммов были низко активными. Высокая степень антагонистческой активности среди всех изученных штаммов встречалась в единичных случаях (2,1 ± 1,4 — 9,4 ± 3,0%). 90,0 ± 4,2% выделенных от мышей эшерихий со сниженной ферментативной активностью имели низкий уровень среднего показателя адгезии. Высокоадгезивных штаммов не обнаруживалось.

В то же время для эшерихий со сниженной ферментативной активностью, выделенных из кишечника мышей, была характерна высокая частота встречаемости антилизоцимного признака (98,4 ± 1,1% исследованных штаммов). Степень выраженности способности к инактивации лизоцима была также высока и приближалась к уровню условно-патогенных энтеробактерий (5,6 мкг лизоцима/ мл среды и 5,4 мкг/мл соответственно). Данное обстоятельство свидетельствует о нарастании патогенных свойств в популяции эшерихий, вегетирующих в кишечнике мышей с экспериментальным лекарственным дисбактериозом, и утрате ими места нормальных эубионтов.

В ходе изучения биологических свойств лактобактерий, выделенных от мышей в динамике экспериментального лекарственного дисбактериоза, было отмечено снижение их колонизирующей способности. Способностью к синтезу лизоцима в незначительной степени обладали только 15,0 ± 3,5% лактобактерий. Большинство изученных штаммов обнаружило низкую антагонистическую активность в отношении Kl. pneumoniae (75,0 ± 4,3%), P. vulgaris (72,0 ± 4,5%), P. mirabilis (70,0 ± 4,6%), S. aureus (87,0 ± 3,4%), а также в отношении шигелл (49,0 ± 5,0%). Высокая антагонистическая активность в отношении указанных штаммов встречалась в единичных случаях (1,0 ± 0,9 — 5,0 ± 2,0%). Подавляющее большинство штаммов лактобактерий, выделенных от мышей, были неадгезивными (84,0 ± 5,2% по СПА и 64,0 ± 6,8% по ИАМ).

Так как существенную роль в поддержании колонизационной резистентности организма играет местный иммунитет (Г.И. Подопригора, 1990), представляло интерес выяснить, как изменяется активность показателей местной неспецифической резистентности в динамике экспериментального дисбактериоза. К числу местных неспецифических факторов противоинфекционной защиты относится фагоцитарная активность местных макрофагов, а также антибактериальные и антивирусные субстанции (лизоцим, интерферон) (Я.С. Шварцман, Л. Б. Хазенсон, 1978; Л. Б. Хазенсон, 1984).

Считается, что снижение содержания лизоцима ведет к ослаблению колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника (Э.Г. Щербакова с соавт., 1999, 2000), поэтому была изучена частота встречаемости различных концентраций лизоцима в копрофильтратах людей, получавших и не получавших антибиотики.

Анализ полученных данных показал, что в копрофильтратах лиц, получавших антибиотики, достоверно чаще обнаруживались высокое содержание лизоцима (79,3 ± 1,2% против 31,2 ± 5,8% в группе условно-здоровых лиц, t = 8,2), что может свидетельствовать о наличии воспалительного процесса в слизистой (О.В. Бухарин с соавт., 1979).

Так как содержание лизоцима в кишечнике складывается из лизоцима, секретируемого слизистой оболочкой, и микробного лизоцима (О.В. Бухарин с соавт., 1985), была проанализирована зависимость между содержанием лизоцима в копрофильтратах и изменениями в составе микрофлоры кишечника людей, получавших антибиотики.

Установлена четкая зависимость между содержанием лизоцима в копрофильтратах и содержанием бифидои лактобактерий в составе кишечной микрофлоры людей с дсбактериозом, обусловленным антибиотическими препаратами. Снижение содержания бифидои лактобактерий сопровождалось достоверным снижением частоты обнаружения лизоцима в копрофильтратах (t = 2,1). Количественные значения лизоцима в копрофильтратах таких людей были также ниже, чем у людей с нормальным содержанием бифидои лактофлоры (2,45 мкг/мл и 3,25 мкг/мл соответственно).

Не обнаружено достоверных отличий (t = 0,4) в частоте выявления и количестве лизоцима в копрофильтратах в зависимости от преобладания в составе кишечной микрофлоры людей с лекарственным дисбактериозом эшерихий с нормальной либо сниженной ферментативной активностью.

Наличие в составе микрофлоры кишечника высоких количеств условно-патогенных микроорганизмов, для которых лизоцим служит фактором межмикробного взаимодействия, сопровождалось частым обнаружением высоких концентраций лизоцима в копрофильтратах. Тем не менее, не обнаружено достоверного различия в частоте обнаружения высоких концентраций лизоцима в копрофильтратах и увеличением количества лактозонегативных энтеробактерий в кишечной микрофлоре.

Складывается впечатление, что содержание лизоцима в копрофильтратах людей с дисбактериозом, обусловленным антибиотиками, зависит как от состава кишечной микрофлоры, так и от состояния слизистой оболочки кишечника, что согласуется с точкой зрения В. М. Бондаренко с соавторами (2003) о измененном морфологическом статусе слизистой оболочки толстого кишечника при дисбактериозе.

Изучение содержания лизоцима в копрофильтратах мышей в динамике экспериментального дисбактериоза также показалоналичие определенной зависимости между характером изменений состава микрофлоры кишечника и количеством лизоцима в копрофильтратах. Достоверное увеличение количества высеваемых из кишечника условно-патогенных микроорганизмов, в особенности стафилококков, сопровождалось повышением концентрации лизоцима в копрофильтратах.

О.Н. Минущкин с соавторами (1999), В. М. Бондаренко с соавторами (2003) предлагают рассматривать развитие микроэкологических нарушений как патологический процесс, протекающий непосредственно на поверхности эпителиоидных клеток кишечника — энтероцитах и колоноцитах. Однако механизмы, обусловливающие снижение местной неспецифической резистентности, в частности, изменение фагоцитарной активности местных непрофессиональных фагоцитов и связь этихпроцессов с измененимем характера микрофлоры при дисбактериозах, вызванных антибиотиками, не до конца ясны.

Известно, что исход фагоцитарной реакции определяется состоянием бактерицидных систем фагоцитирующих клеток, поэтому была исследована активность кислородзависимых бактерицидных систем непрофессиональных фагоцитов кишечника (энтероцитов и колоноцитов) и перитонеальных макрофагов в динамике экспериментального дисбактериоза, обусловленного антибиотиками широкого спектра действия.

Порведенные исследования показали, что активность кислородзависимых бактерицидных систем (КЗБС) эпителиоидных клеток кишечника интактных мышей определялась на сравнительно высоком уровне (142,3 ±11,4 Ед. в энтероцитах, 156,5 ± 12,6 Ед. в колоноцитах), превышая значения активности КЗБС перитонеальных макрофагов (117,8 ± 9,4 Ед.).

Все взятые в опыт антибиотики значительно снижали активность КЗБС, но в разной степени. Наиболее значительно активность КЗБС снижалась под действием цефазолина: в колоноцитах — в 4,4 раза, энтероцитах — в 3,6 раза, перитонеальных макрофагах — в 3,2 раза. Более умеренно снижалась активность под действием гентамицина: в колоноцитах — в 2,14 раза, энтероцитах — 1,9 раза, перитонеальных макрофагах — 1,7 раза. Самое низкое снижение активности кислородзависимых бактерицидных систем отмечалось при введении ципрофлоксацина: в колоноцитах — в 2 раза, в энтероцитах и перитонеальных макрофагах — в 1,4 раза.

Была изучена динамика изменений активности КЗБС при экспериментальном дисбактериозе, обусловленном гентамицином. Анализ полученных результатов показал, что падение активности КЗБС во всех исследованных клетках происходит с одинаковой закономерностью: наиболее четко снижалась активность КЗБС колоноцитов, в меньшей степени энтероцитов и перитонеальных макрофагов. Снижение активности КЗБС фиксировалось уже на 3−5 сутки после отмены антибиотика: в колоноцитах она падала до 46,0 ± 3,06 Ед., энтероцитах — 62,0 ± 5,5 Ед., перитонеальных макрофагах — до 45,0 ± 2,8 Ед. Начиная с 10-х суток после отмены гентамицина активность КЗБС фагоцитирующих клеток несколько повышалась, но и к концу срока наблюдений (31 сутки) оставалась в несколько раз ниже (в колоноцитах — в 3 раза, энтероцитах — в 2 раза, перитонеальных макрофагах — в 2,3 раза) показателей контрольной группы мышей.

Сопоставление результатов изучения активности КЗБС непрофессиональных фагоцитов в динамике экспериментального дисбактериоза, обусловленного цефазолином и ципрофлоксацином, позволило выявить наличие той же закономерности, что и при введении гентамицина: активность КЗБС снижается более значительно в колоноцитах, чем энтероцитах, снижение активности отмечается с 3 дня после отмены антибиотиков, максимум падения активности приходится на 3−10 сутки. В отличие от гентамицина активность КЗБС при введении цефазолина и ципрофлоксацина восстанавливалась более быстро и приближалась к показателям контрольной группы животных уже к 18 дню наблюдений.

Так как активность кислородзависимых бактерицидных систем в определенной степени влияет на состояние местного иммунитета, представляло интерес сопоставить данные об изменении активности КЗБС и микроэкологических нарушениях в микробиоценозах кишечника.

Была обнаружена прямая четко выраженная зависимость между изменениями активности КЗБС непрофессиональных фагоцитов кишечника и изменениями характера кишечной микрофлоры.

Наиболее низкие значения активности КЗБС сочетались со снижением количества нормальных эубионтов в микрофлоре кишечника (бифидобактерий до lg 6,0 ± 0,4, лактобактерий до lg 6,0 ± 0,3, эшерихий до lg 4,5 ± 0,4) и нарастанием в популяции эшерихий штаммов со сниженной, ферментативной активностью, которые с 17-х суток и до конца срока наблюдений составляли более 90% популяции. Падение активности КЗБС фагоцитирующих клеток на 3−5 сутки после отмены антибиотика сочеталось также с достоверным увеличением количества условно-патогенных микроорганизмов. На протяжении практически всего срока наблюдений низким значениям активности КЗБС соответствовали высокие количества лактозонегативных энтеробактерий, протеев, стафилококков, в том числе золотистых, гемолитических кокковых форм. Наблюдавшаяся к концу эксперимента тенденция к росту активности КЗБС колоноцитов и энтероцитов сочеталась с уменьшением численности условно-патогенных бактерий, высеваемых из кишечника мышей.

В настоящее время одним из основных средств коррекции микроэкологических сдвигов в кишечном биоценозе являются эубиотические препараты, содержащие лактобактерии, обладающие иммуномодулирующим действием (В.М. Коршунов с соавт., 1999; Е. В. Патрушева, 2000; И. Б. Куваева, 2001; В. А. Доценко, 2001; А. А. Воробьев, 2002). Поэтому была проведена коррекция экспериментального лекарственного дисбактериоза кисломолочным препаратом «Наринэ», представляющим собой ацидофильный штамм лактобактерий (А.Д. Амбарцумян, 1983; Г. Б. Гукасян с соавт., 2002).

Проведенные исследования показали, что под влиянием препарата «Наринэ» наблюдалось достоверное повышение активности фагоцитирующих клеток. При сопоставлении показателей активности КЗБС эпителиоидных клеток кишечника и перитонеальных макрофагов обнаружено, что более выраженный подъем активности наблюдался в большей степени в колоноцитах и энтероцитах, чем в макрофагах. Так активность колоноцитов при коррекции «Наринэ» выросла в среднем в 2,5 -2,8 раза, энтероцитов — в 2,4—3 раза, пертонеальных макрофагов — в 2 раза.

Сопоставление характера микрофлоры кишечника животных, получавших «Наринэ», и изменений активности КЗБС фагоцитов при коррекции дисбактериоза позволило установить, что повышение активности КЗБС профессиональных и непрофессиональных фагоцитов приводит к снижению численности лактозонегативных энтеробактерий, протеев и гемолитических форм.

Полученные результаты позволяют считать, что активность кислородзависимых бактерицидных систем эпителиоидных клеток кишечника может быть одним из факторов, способствующих изменению характера микрофлоры кишечника при дисбактериозе, обусловленном применением антибиотических препаратов.

Сопоставление результатов проведенных исследований позволило заключить, что при дисбактериозе, обусловленном применением антибиотических препаратов, наблюдается снижение колонизационной резистентности кишечника, связанное с нарушением защитной функции нормальной микрофлоры и нарушением механизмов местной неспецифической резистентности организма.