Разработка пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки и ее применение при выращивании цыплят-бройлеров

Актуальность работы.

В промышленном птицеводстве, в последнее время, ведущую роль в гибели молодняка стали занимать желудочно-кишечные заболевания бактериального происхождения (Гусев и др., 2003). Попытки контролировать проблему путем чередования схем применения антибиотиков и химических препаратов, в том числе нового поколения, не только не дали желаемого результата, а напротив, усугубили ее. Мировой опыт применения антибиотиков показал, что в данной ситуации они не обладают должной эффективностью, а штаммы многих возбудителей кишечных инфекций, циркулирующие в хозяйствах, приобрели множественную лекарственную резистентность к антибиотикам (Тараканов, 2000; Малик, Панин, 2001; ЗсИоеш а1 2002). В свою очередь это влечет к возможности длительного их персистирования в организме птицы и создает предпосылки для передачи возбудителя от птицы к человеку (Клименко, 2002; Булатов, 2003).

Таким образом, проблема профилактики и лечения кишечных инфекций сельскохозяйственной птицы, возбудителями которых являются условно-патогенные микроорганизмы, имеет не только экономическое, но и социальное значение (Хапугин и др., 1999).

Ужесточение требований к экологической безопасности продукции животноводства заставило во всем мире пересмотреть многие методические подходы к вопросам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болезней, возбудителями которых является условно патогенная микрофлора и признать необходимость разработки нового поколения экологически безопасных препаратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспечению биологической защиты сельскохозяйственных животных и птицы (Лизько, 1999).

Наиболее полно этим требованиям могут отвечать пробиотические кормовые добавки и препараты, в состав которых входят живые бактерии из числа основных представителей нормального кишечного микробиоценоза животных и птицы, такие как лактобациллы, бифидобактерии, энтерококки (Малик, Панин, 2001; Глушанова, Блинов, 2002; Fuller, Gibson, 1998).

Актуальная потребность в пробиотических кормовых добавках и препаратах привела к тому, что для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных и птицы стали использовать медицинские препараты, содержащие в своей основе штаммы микроорганизмов-пробионтов, выделенных от человека, и показавшие недостаточную эффективность вследствие отсутствия у них видоспецифичности (Павлова, Киржаев, Лапинскайте, 2002).

Ввиду этого представляется целесообразным разработка пробиотических кормовых добавок и препаратов, в том числе и на основе молочного сырья с использованием культур, выделенных от сельскохозяйственных животных и птицы для использования в ветеринарии.

Проблема рационального использования молочного сырья неразрывно связана с эффективной переработкой молочной сыворотки. Данный вопрос рассматривался в Международной молочной федерации (ММФ) и, неоднократно, на международных молочных конгрессах. Молочная сыворотка обладает пищевой и биологической ценностью, является богатой питательной средой для роста микроорганизмов. В то же время промышленной переработке подвергается только около 20% всего объема. Одной из причин такого нерационального использования служит недостаток эффективных технологий ее переработки (Ковтунова, Бушуева, Пинаева, 1985; Храмцов, 1990; Шиллер, 1983; Шильнаиков, Минакова, 1986; Мацерушка, 1998).

Цель работы — создание пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием микроорганизмов с выраженными пробиотическими свойствами из желудочно-кишечного тракта кур для применения в промышленном птицеводстве и разработка экспериментальной технологии ее получения.

Задачи исследования:

1. Выделить от здоровой птицы активные культуры микроорганизмов-пробионтов родов Enterococcus и Lactobacillus, способных активно развиваться на молочной сыворотке.

2. Разработать технологию получения пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием отобранных культур микроорганизмов.

3. Определить эффективность от применения пробиотической добавки на суточных цыплятах-бройлерах в период формирования микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

Научная новизна.

• По разработанным нами схемам впервые выделены штаммы микроорганизмов родов Enterococcus и Lactobacillus от сельскохозяйственной птицы, способные активно размножаться при культивировании на молочной сыворотке и обладающие пробиотическими свойствами.

• Разработана экспериментальная технология производства пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием отобранных культур

• Определена эффективность от применения пробиотической кормовой добавки на суточных цыплятах-бройлерах в период формирования микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

Практическая значимость.

Выделены перспективные для разработки пробиотических препаратов и кормовых добавок штаммы культур микроорганизмов родов Enterococcus и Lactobacillus.

Как один из способов рационального использования вторичного молочного сырья разработана экспериментальная технология производства пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки (подсырной и творожной) для применения на птицеводческих предприятиях.

Предлагаемая к применению пробиотическая кормовая добавка позволяет снизить гибель цыплят в первые дни жизни и, кроме того, обогатить рацион питания по углеводному компоненту, минеральным солям, биологически активным веществам, микроэлементам и др.

Пробиотическая кормовая добавка использована в работе ОАО «Птицефабрика Михайловская»: акт о проведении клинических испытаний экспериментальной пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки от 14 сентября 2003 гакт о внедрении в промышленное птицеводство пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки от 21 сентября 2003 г.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Выделенные от кур штаммы микроорганизмов обладают пробиотическими свойствами и необходимыми ростовыми качествами.

2. Разработана экспериментальная технология производства пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием отобранных штаммов микроорганизмов.

3. Исследован процесс формирования отдельных групп нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров при применении разработанного продукта.

4. Применение пробиотической кормовой добавки при выращивании суточных цыплят-бройлеров в промышленных условиях показало профилактический и положительный экономический эффект.

Работа выполнена на кафедрах микробиологии и ветсанэкспертизы, и технологии молока и молочных продуктов Саратовского ГАУ им. Н. И. Вавилова в рамках темы основного направления работы кафедры технологии молока и молочных продуктов — «Комплексная переработка вторичного молочного сырья».

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на Межрегиональной научной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа (Саратов, 2003), на Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов СГАУ, посвященной 115-летию со дня рождения академика Н. И. Вавилова (2002), на Международном симпозиуме Федеральный и региональный аспекты государственной политики в области здорового питания (Кемерово, 2002), на конференции в РосНИПЧИ «Микроб» Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте Микроб (Саратов, 2004).

Материалы диссертации представлены в отчетах НИР ИВМиБ в рамках ассоциации аграрного образования и науки за 2002;2003 г. г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 5 работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы, результаты исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Материалы диссертации изложены на 138 страницах машинописного текста, включая 14 рисунков, 23 таблиц. Список использованных литературных источников включает 118 наименований, в том числе 31 зарубежных.

— 126-выводы.

1. Разработана рациональная схема, показавшая высокую эффективность при выделении из содержимого кишечника здоровых птиц энтерококков и лактобацилл, обладающих высокой антагонистической активностью и способностью к культивированию на молочной сыворотке. В результате отобраны три варианта лактобацилл и восемь вариантов энтерококков потенциально пригодных для создания пробиотических препаратов.

2. Установлено, что при длительных пассажах на обезжиренном молоке отобранные штаммы лактобацилл и энтерококков остаются стабильными по свойствам антагонизма и кислотообразования.

3. Показано, что отобранное для получения пробоитической кормовой добавки симбиотическое сочетание двух штаммов — L. acidophilus 75 с Е. faecium 74 обладает выраженным синергизмом в свойствах кислотообразования и антагонизма к возбудителям кишечных инфекций.

4. Определены основные технологические параметры получения пробиотической кормовой добавки, влияющие на качество и санитарные показатели готового продукта (режим тепловой обработки, оптимальная температура сквашивания, количество вносимой закваски). Установлены возможные сроки хранения, составляющие, соответственно, не более 23 суток при 4 °C и не более 12 суток — при 20 °C.

5. Установлено, что применение пробиотической кормовой добавки в первые дни жизни цыплят способствует более быстрому формированию кишечного микробиоценоза, оказывает положительное влияние на клинический статус их организма, при этом гибель молодняка снижается с 2,61% до 1,47%, среднесуточный привес увеличивается на 3,51% (Р<0,05), затраты корма снижаются на 0,53 к.е. на 1 кг живой массы, а период откорма сокращается с 49 до 45 дней, что в общем выражается в положительном экономическом эффекте, составляющем 6 рублей 94 копейки на рубль затрат связанных с использованием пробиоитческой кормовой добавки.

— 118-ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Профилактика желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственной птицы, а особенно ее молодняка (в частности цыплят) в настоящее время является неотъемлемым мероприятием в организации любого рентабельного птицеводческого хозяйства (Гусев и др., 2003; Хапугин и др., 1999). В этих целях традиционное применение антибиотиков и химических препаратов ведет к появлению и накоплению лекарственно устойчивых штаммов возбудителей кишечных инфекций. Помимо риска заражения такими штаммами, через продукцию птицеводства возможно попадание и антибиотиков в организм человека, что при современных требованиях к экологической безопасности пищевых продуктов не допускается.

В данных условиях для профилактики кишечных инфекций сельскохозяйственной птицы целесообразно применять пробиотические препараты и кормовые добавки, содержащие в своем составе микроорганизмы (и/или их метаболиты) из числа основных представителей нормальной микрофлоры данного вида птицы (Лизько, 1999; Малик, Панин, 2001; Глушанова, Блинов, 2002; Fuller, Gibson, 1998). Наиболее перспективными в этом плане являются жидкие препараты и кормовые добавки содержащие микроорганизмы в физиологически активном состоянии, созданные на основе вторичного молочного сырья (молочной сыворотки или обезжиренного молока) (Залашко М.В., Залашко JI. C 1976; Выдрицкая, Ромашко 1999; Шиловская, Бастрыкина 1982).

Нами осуществлена разработка экспериментальной технологии получения пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки (подсырной и творожной) с использованием культур микроорганизмов из числа представителей нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицы / родов Enterococcus и Lactobacillus для применения в промышленном птицеводстве.

С этой целью по предложенным нами схемам было исследовано 40 проб фецес, из которых было выделено 14 культур лактобацилл и 29 культур энтерококков. Было отмечено, что частота выделения имела тенденцию к росту в сторону мая-июня, что как мы считаем, связано с обогащением рациона дополнительными питательными веществами при вольном содержании кур. От каждой культуры были изолированы варианты, среди которых 66 -лактобацилл и 145 — энтерококков.

При изучении отобранных вариантов лактобацилл особое внимание уделялось продолжительности свертывания молока, так как это косвенно указывает на уровень активности кислотообразования. По данным ряда авторов отмечено, что антагонистические свойства ацидофильной палочки в большинстве случаев активнее проявляются у ее культур со средним и высоким уровнем кислотообразования (более 170 °Т) (Гриневич 1981; Жубанова и др. 2002; Банникова 1975). Было установлено, что среди отобранных нами вариантов у наиболее активных (8%) предел кислотообразования в молоке составлял 210−237 °Т, скорость свертывания молока — 20−24 ч. Промышленные штаммы ацидофильной палочки (контроль) свертывали молоко быстрее (1617 ч), а предел кислотообразования составлял 251−296 °Т. что, как мы считаем, можно объяснить их направленной селекцией и лучшей адаптированностью к росту в молоке. При сравнении же со штаммами, изолированными из препаратов «Лаком-П» и «Галлиферм», по уровню предельной кислотности и скорости свертывания молока (соответственно 177−193 °Т и 22−26 ч) исследуемые варианты ацидофильной палочки незначительно превосходили их.

Другими, определяющими отбор, свойствами как у энтерококков так и у лактобацилл являлись устойчивость к желчи и щелочной реакции среды, а для лактобацилл еще и устойчивость к фенолу (которые являются и дифференциальными внутривидовыми признаками). Они косвенно указывают / на потенциальную возможность данных культур приживаться в кишечнике теплокровных и развиваться в нем, и являются одними из необходимых свойств, которыми должны обладать пробиотические штаммы микроорганизмов (Банникова, 1975; Малик, Панин, 2001).

Исследование вариантов культур энтерококков на отсутствие патогенности в тестах in vitro, показало что, лишь незначительная их часть обладает факторами патогенности (р-гемолиз выявлен у 4,1% культур, а-гемолиз — у 23,9%, фибринолитическая активность выражена у 3,1%). При этом выявленный a-гемолиз у энтерококков хотя и не является точным показателем патогенности (Биргер, 1982; Базаров, 1978), тем не менее такие варианты нами в дальнейшем не использовались. В тестах in vivo исследовались культуры энтерококков, показавшие отрицательные реакции в опытах in vitro. В ходе наблюдения падежа зараженных мышей не наблюдалось, а при их вскрытии каких-либо патологических изменений внутренних органов не выявлено.

При отборе по антагонистическим свойствам в отношении к тест-культурам возбудителей кишечных инфекций со стороны изучаемых вариантов культур было выявлено, что среди энтерококков вида E. faecium выраженные антагонисты встречаются — 3,6% случаев против 0,7% у Е. faecalis (в отношении только отдельных тест-культур), среди вариантов L. acidophilus таковых 4,5%. Повторное исследование антагонизма наиболее активных культур, проводимое параллельно по двум методам в основном подтвердило предварительные результаты. При этом сходимость результатов двух методов составила 89%, что говорит о их высокой достоверности. Таким образом на основе полученных данных нами были отобраны три варианта культур ацидофильной палочки (L. acidophilus 62, 75, и 142) и восемь вариантов культур энтерококков (E.faecium 24, 75, 74, 13ь 182,19ь 232 и 233).

При определении свойств сбраживания различных углеводов изучаемыми культурами лактобацилл и энтерококков полученные результаты совпадали с данными и определителя Берджи и других авторов (Сорокин и др., 1973; Гриневич, 1981; Банникова и др., 1987; Базаров, 1979, Банникова, 1975).

Для более детального изучения и идентификации отбираемых вариантов лактобацилл и энтерококков нами проводилось определение морфологических, культуральных и физиологических свойств.

С целью создания пробиотической кормовой добавки было необходимо отобрать культуры со стабильными свойствами кислотообразования и антагонизма, а также провести скрининг симбиотических сочетаний.

Было установлено, что по кислотообразующим свойствам культуры ацидофильной палочки в совокупности являются более стабильными (отклонение в пределах от -2,0% до +4,9%) чем энтерококки, которые сильнее подвержены изменчивости (от +14,9% до -23,3% от начального уровня). В литературе встречаются сведения о том что культуры гомоферментативных термофильных молочнокислых палочек, в частности L. acidophilus и L. bulgaricus более стабильны в свойстве кислотообразования чем гомоферментативные термофильные молочнокислые стрептококки, с которыми у энтерококков большая степень сродства (Степаненко, 2002; Ганина, 1999; Charteris et al., 1997). Наиболее стабильными вариантами оказались варианты E. faecium 24, 7з, I82 и 233.

Антагонистическая активность при пересевах лактобацилл и энтерококков оказалась более вариабельной чем их свойства кислотообразования. Исследуемые культуры ацидофильной палочки были менее подвержены изменчивости (от -28,4% до +1,3%) чем культуры энтерококков, у которых наблюдался значительный разброс антагонистических свойств со стороны отдельных вариантов (от -100% до +10,7% от начального уровня). При этом у наиболее стабильных вариантов энтерококков Е. faecium 24, 7з, 7д, и I83 отклонение составляло от -16,9 до +10,7%, а у стабильного варианта L. acidophilus 75 — от -4,1% до +1,3%.

Следующим этапом нашей работы был подбор симбиотического сочетания культур двух видов (лактобацилл и энтерококков), в котором достигалось бы усиление их развития не в ущерб друг другу, или усиление физиологических функций одного или обоих видов. При этом нас больше интересовали следующие возможные варианты: усиление развития от совместного культивированияусиление молокосвертывающей способности и/или антагонистической активности. В литературе имеется достаточно много сведений о подобных эффектах при совместном культивировании молочнокислых палочек и стрептококков. Кроме того в молочной промышленности на принципе симбиотического сочетания основан и подбор культур для заквасок кисломолочных продуктов и сыров (Гриневич, 1981; Банникова, 1975; Банникова и др., 1987; Шаманова, 1998).

В ходе наших исследований из пяти было выявлено два сочетания L. acidophilus 14 г с Е. faecium 24, и L. acidophilus 75 с Е. faecium 14, культуры которых усиливали взаимное развитии друг друга, увеличивая титр клеток от 2,5 до 8,9 раз. Кроме того, дынные совместные жидкие культуры показали и увеличение уровня антагонизма по сравнению с их раздельным культивированием, что выразилось в увеличении зон задержки роста тест-культур. На основании этих данных можно сказать, что симбиотические отношения в упомянутых сочетаний носят двойственный характер, проявляющийся в мутуализме и синергизме входящих в них культур. Данные сочетания показали хорошую стойкость соотношения культур при пересевах. Однако при сравнении продолжительности свертывания молока упомянутые два сочетания были не самыми активными. В частности, сочетание L. acidophilus 4 г с Е. faecium 24 свертывало молоко в течение 4,67 ч, в то время как самое активное сочетание (L. acidophilus 75 с Е. faecium 7з) — за 4,34 ч. По совокупности свойств для дальнейшей работы нами было отобрано сочетание L. acidophilus 75 с Е faecium 74. Необходимо отметить, что варианты культур данного сочетания изолированы из одной пробы и вполне вероятно, что данный симбиоз является закономерным, но в силу малого числа выборки выявленных симбиозов мы этого утверждать не можем. В литературе имеются данные о том, что от одного организма хозяина гораздо чаще выделяются симбиотические сочетания микроорганизмов, чем от разных (Глушанова, Блинов, 2002).

После выбора симбиотического сочетания для создания пробиотической кормовой добавки в нашу задачу входили выбор температуроно-временного режима тепловой обработки питательной среды (молочной сыворотки), а также оптимальной температуры ее сквашивания до конечной кислотности за наименьшее время. Определяющим фактором при выборе вида и режима тепловой обработки были требования по содержанию посторонней микрофлоры в молочной сыворотке, предъявляемыми к производству пробиотиков (Степаненко 2002), в соответствии с которыми в готовом продукте не должно содержаться в 1 г (мл): посторонней микрофлоры более 103−104 КОЕ, а присутствие БГКП не допускается вовсе. Нами было установлено, что для обеспечения данных требований достаточным является режим стерилизации при 110 °C без выдержки.

В ходе определения оптимальной температуры сквашивания молочной сыворотки из четырех температур близких к физиологическому оптимуму микроорганизмов закваски как наиболее подходящий со стороны длительности процесса, так и со стороны постоянства соотношения пробиотических культур нами был выбран интервал 40−42 °С. В этих условиях при внесении 3% закваски достигались наименьшая длительность сквашивания (18−19,5 ч) молочной сыворотки и наибольший титр микроорганизмов в готовом продукте (лактобацилл — 71±-19><10б КОЕ/мл, энтерококков — 469±73*106 КОЕ/мл). Поскольку молочная сыворотка является для микроорганизмов менее питательной средой чем обезжиренное молоко, то для сокращения времени сквашивания нами было увеличено количество вносимой закваски до 7−10%, что позволило сократить длительность процесса до 12,5−14,5 ч.

При определении безвредности полученного продукта на белых мышах нами не было выявлено у них каких-либо внешних клинических изменений.

В ходе установления сроков хранения готового продукта определяющими / факторами были снижение титра микроорганизмов-пробионтов (7,5 КОЕ/мл), уровень титруемой кислотности (свыше 140 °Т). Было установлено, что при температуре 4 °C хранение возможно в течение 22−24 суток, при 20 °C — не более 12 суток.

Заключительным этапом нашей работы было проведение клинических и производственных испытаний пробиотической кормовой добавки на цыплятах-бройлерах. В ходе клинических испытаний при ее выпаивании в течение 21 суток в дозе 2 мл/голову установлен положительный эффект от ее применения, что выразилось в более быстром формировании основных групп микрофлоры кишечника цыплят, особенно лактобацилл и энтерококков, популяции которых нарастали в 2−3 раза быстрее чем в контрольной группе и к седьмым суткам их уровень был выше на порядок. Среднесуточный привес массы тела цыплят составлял 42,1 г, что больше на 4,9 г чем в контрольной группе и больше на 3,4 г чем в группе получавшей молочную сыворотку сквашенную промышленным штаммом ацидофильной палочки. При этом случаев энтерита в опытной группе не отмечалось.

Производственные испытания показали, что дача суточным цыплятам-бройлерам пробиотической кормовой добавки ежесуточно в течение 10 дней в дозе 1 мл на 10 голов позволяет повысить у них среднесуточный прирост массы тела на 3,51% (Р<0,05), снизить гибель молодняка с 2,61% до 1,47%. При этом затраты корма снизились на 0,53 к.е. на 1 кг живой массы, а период откорма до массы забоя с 49 сократился до 45 дней.

При бактериологическом обследовании тушек птицы в группе, получавшей пробиотическую кормовую добавку санитарные показатели значительно выше чем в контрольной группе. Так частота выделения золотистого стафилококка из внутренних органов ниже на 6,1−12,9% чем в контроле, а кишечной палочкина 8,1−57,5%.

Таким образом, на основании проведенных клинических и производственных испытаний можно сделать вывод о том, что выпаивание / пробиотической кормовой добавки цыплятам-бройлерам с первых суток жизни способствует более быстрому формированию кишечного микробиоценооза, увеличению показателей роста, экономии корма и улучшению санитарных показателей качества птицы.

Экономический эффект от применении пробиотической кормовой добавки составил 6,94 рубль на рубль затрат, а предотвращенный экономический ущерб на один птичник с количеством цыплят 45 270 голов составил 24 429,1 рубля.