Получение и оценка биологических свойств колицина Е2

Острые кишечные заболевания молодняка по широте распространения и охвату поголовья занимают ведущее место в патологии сельскохозяйственных животных. Отход молодняка в первые месяцы жизни (падеж, санитарный брак) в зависимости от уровня ведения животноводства достигает в среднем 10 — 30% и более.

Практически повсеместно регистрируемая заболеваемость молодняка свидетельствует о том, что эти заболевания не случайны и возникают как следствие постоянно присутствующих в среде обитания животных неблагоприятных факторов, закономерно вызывающих патологические изменения в организме.

ОКЗ являются основными причинами гибели молодняка в первый месяц после рождения. Устойчивость телят к ОКЗ зависит от уровня факторов естественной резистентности организма новорожденных животных, активности колострального иммунитета, который находится в прямой зависимости от качества молозива и его своевременного получения новорожденным молодняком.

Исследованиями Воронина Е. С. с соавт. (1991) установлено, что молодняк крупного рогатого скота, в большинстве случаев, рождается с низкой резистентностью организма. У новорожденных животных с пониженой неспецифической реактивностью на фоне высокой обсемененности условно — патогенными микроорганизмами внешней среды, а зачастую и молозива, происходит инфицирование и опережающее заселение кишечника, условно — патогенными и патогенными микроорганизмами и, как следствие, возникают ОКЗ, в этиопатогенезе которых активно участвуют энтеробактерии.

Имеющиеся и широко используемые в настоящее время моновакцины против колибактериоза и сальмонеллеза для иммунизации животных не всегда эффективны, поскольку в этиологии диарей в большинстве случаев участвует ассоциация 3 — 5, а иногда и большего количества возбудителей, преимущественно из семейства энтеробактерий.

Существенную роль в лечении и предупреждении ОКЗ играют препараты, способствующие восстановлению нормальной микробной среды в кишечнике. К ним относятся пробиотики, изготовленные на основе лактоба-цилл и бифидобактерий, которые наряду с антогонистическим действием благоприятно влияют на пищеварение, способствуют лучшему усвоению корма, участвуют в биосинтезе витаминов группы В, ряда незаменимых аминокислот, бактериоцинов и др. (30, 38).

Переболевание в раннем возрасте ОКЗ, содержание в помещении животных с разным иммунологическим фоном, воздействие различных стрессов, приводит к развитию иммунодефицитного состояния, способствующего повышенной восприимчивости молодняка к различным аутои экзопатогенам, и в итоге к массовым респираторным болезням. В настоящее время известно 10—15 различных вирусных и бактериальных агентов и их ассоциаций, способных вызывать кишечные и респираторные болезни телят (25, 26).

Лечение желудочно-кишечных болезней молодняка сельскохозяйственных животных остается в настоящее время одной из актуальных проблем ветеринарной медицины. Широко применяемые с этой целью антибактериальные препараты, наряду с положительным воздействием на течение и форму заболевания, вызывают побочные эффекты: возникновение антибиотикоре-зистентных штаммов микроорганизмов, развитие дисбиотических состояний кишечника, аллергические реакции и др.

Одним из способов предупреждения развития антибиотикоустойчивых форм микроорганизмов является периодическая замена широко применяющихся антибиотиков новыми или редко применяющимися.

Однако получение новых групп антибактериальных препаратов на основе усложненных способов синтеза и новых технологий влечет за собой значительное повышение затрат на лечение.

В связи с этим интерес представляет разработка дешевых антибактериальных средств, не приводящих к развитию дисбиотических изменений в желудочно-кишечном тракте и не требующих коррекции нарушений микрофлоры кишечника биопрепаратами.

Новые возможности в реализации этого подхода открылись благодаря созданию полифункционального биопрепарата нового поколения — колицина Е2, обладающего антибактериальными, антиоксидантными и иммуномоду-лирующими свойствами (4, 7, 8).

В научных публикациях последних лет, по проблеме создания препаратов методами генной инженерии, появляется большое количество информации, касающейся получения препаратов, имеющих бактериальную и вирусную природу и способных воздействовать благотворно одновременно на несколько систем организма.

Нормальная жизнедеятельность организма невозможна без развитой многоступенчатой системы регуляции и координации различных его функций, осуществляемых специальными веществами — биорегуляторами. Это осуществляется с помощью витаминов, гормонов, нейромедиаторов, которые способны повышать защитно-приспособительные возможности организма. Среди них видное место занимают противоокислительные вещества или антиок-сиданты.

Антиоксиданты обеспечивают необходимую активность антиокислительной системы — универсальной регулирующей системы организма, контролирующей уровень свободнорадикальных реакций окисления и препятствующей накоплению продуктов окисления (42, 71, 91, 104, 126, 128).

Многочисленные работы последних лет показывают, что состояние анти-оксидантной недостаточности (так называемая, свободнорадикальная патология или синдром пероксидации) как неспецифическая патофизиологическая реакция способствует развитию различных заболеваний (52, 114, 120, 123).

В настоящее время в связи с распространением в животноводстве индустриальных технологий наблюдается повышенная потребность в антиокси-дантах. Это обусловлено целым рядом причин: инфекционные, желудочно-кишечные, респираторные заболевания;

— вакцинации животных против вирусных заболеваний;

— недостаток и плохое качество кормов, наличие в них нитритов, нитратов, солей тяжелых металлов;

— низкое содержание в кормах в весенний период естественных антиоксидантов — каротина, витаминов А, Е, С и др.;

— низкая температура, повышенная влажность, недостаток света в помещениях;

— гиподинамия в зимний период;

— физиологические и технологические стрессы — роды, перемещения, перестановки и др.

В настоящее время наибольшее распространение в животноводстве получили обладающие антиоксидантными свойствами витамины А, Е, С, микроэлемент селен, органические соединения деполен, селенопиран и другие (10, 11, 49, 91). Из новых препаратов хорошо себя зарекомендовал амбиол (41).

Бурное развитие биологии в последние годы привело к раскрытию новых закономерностей окислительно-восстановительных реакций в организме млекопитающих, роли антиоксидантов в этих процессах, созданию новых антиоксидантов широкого спектра действия, полученных методом генной инженерии.

На базе лаборатории ветеринарной иммунологии ГУ Зональный НИИСХ Северо-Востока им. Н. В. Рудницкого (г. Киров) в 2000 г. был сконструирован генно-инженерными методами гибридный штамм Bacillus subtilis pBColE2 -продуцент гибридного колицина Е2, патент РФ на изобретение № 2 188 233 получен 27 августа 2002 года (5).

Ряд авторов (3, 4, 6, 7, 8) в своих исследованиях показали, что гибридный колицин Е2 обладает оригинальными биологическиими свойствами.

Таким образом, изучение биологических свойств гибридного колицина Е2 показало возможность применения его как ветеринарного препарата, для профилактики и лечения инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных. Тем не менее, возникла настоятельная необходимость более детального изучения механизма действия колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят и широкого применения его в ветеринарной практике.

Цель и задачи исследований.

Целью настоящей работы являлось усовершенствование методов получения и очистки колицина Е2 и оценка его лечебно-профилактической эффективности при желудочно-кишечных болезнях телят.

Для решения были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы получения и очистки колицина Е2.

2. Определить биологические свойства колицина Е2 in vivo и in vitro.

3. Изучить антибактериальную активность колицина Е2 в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

4. Оценить лечебно-профилактическую эффективность колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях телят.

5. Разработать рекомендации по применению колицина Е2.

Научная новизна.

Получен рекомбинантный штамм B. subtilis рВсо1Е2 — продуцент гибридного колицина Е2.

В результате проведенных исследований была изучена трансформация структурного гена Е. coli К12 в клетки бактерии В. subtilis. Было установлено, что миниклетки, которые образуются при асимметричном делении мутантов Е. coli К12, не содержат геномную ДНК, но могут содержать плазмидную ДНК родительской клетки. При этом Col-плазмиды транслируются с образованием полипептидов.

Установлено, что колицин Е2 состоит из двух полипептидных субъединиц — собственно бактериоцина с молекулярной массой 68 кДа и белка иммуно-сти с молекулярной массой 10 кДа. Колицин Е2 проникал через клеточные мембраны бактерий матричного штамма Е. coli К12, а также штаммов Pseu-domonas, Salmonella, Haemophilus, Streptococcus и вызывал эндонуклеазную деградацию бактериальной ДНК, т. е. не отличался видовой специфичностью, при общей высокой бактерицидности.

Исследовано действие гибридного колицина Е2 на процесс инфицирования клеток культуры ПЭК герпес вируса третьего типа (штамм Румын) возбудителя инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Впервые проведена комплексная оценка возможности использования колицина Е2 в ветеринарной практике в качестве профилактического и терапевтического средства при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят.

Учитывая, что Колицин Е2 является эффективным антибактериальным препаратом в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, предложено применение Колицина Е2 в комплексе с симптоматическими средствами лечения.

Практическая и теоретическая значимость работы.

Сконструирован гибридный штамм Bacillus subtilis pBColE2 — продуцент колицина Е2, обладающего антибактериальными и антиоксидантными свойствами, который депонирован и зарегистрирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ГУ Зонального НИИСХ Северо-Востока им. Н. В. Рудницкого под номером В-771.

Показано, что колицин Е2 обладает высокой лечебно-профилактической эффективностью при острых желудочно-кишечных болезнях молодняка крупного рогатого скота.

Установлено, что эффективной профилактической дозой колицина Е2 для телят является 20 мг на 10 кг живой массы при внутримышечном его применении в течение 4−6 дней. Терапевтический эффект для больных новорожденных телят проявляется в дозе 20 мг на 10 кг веса при внутримышечном его применении в течение 6 дней.

Полученный колицин Е2 зарегистрирован Ветфармбиосоветом Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ (протокол № 3 от 06.06.2000 г. 1 157-ОП).

Разработана схема применения препарата при желудочно-кишечных и респираторных заболеваниях сельскохозяйственных и домашних животных.

Составлено и утверждено временное наставление по применению колицина Е2 в ветеринарии (в порядке широких производственных испытаний 2001;2004 гг): Одобрено Ветфармбиосоветом Департ. ветеринарии Минсель-хоза РФ (протокол № 3 от 06.06.2000 г.) ООП57-ОП. Утв. Департ. ветеринарии Минсельхоза России 12.03.2001 за № 13−4-03/0039 (35).

Внедрена в производство схема применения колицина Е2 с профилактической и терапевтической целью.

Результаты изучения используются практическими ветеринарными врачами Российской Федерации при лечении и профилактике болезней животных.

Подготовлен и утвержден комплект нормативно-технической документации на препарат колицин Е2.

Разработаны практические рекомендации на Колицин Е2.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследования генетической цепи по конструированию штамма-продуцента колицина Е2, синтеза и очистки колицина Е2.

2. Результаты изучения биологических свойств препарата.

3. Результаты изучения лечебно-профилактического действия колицина Е2 при желудочно-кишечных заболеваниях телят.

Апробация работы: основные положения диссертации были доложены и обсуждены: на международных конгрессах:

— IX международный ветеринарный конгресс (Москва, 2001);

— XI международный ветеринарный конгресса (Москва, 2003) — на международных конференциях:

— международная научно-практическая конференция «Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, Крейтц-фелда — Якоба и другие прионные болезнилистериоз, болезнь Ауэски, болезнь Тешена» (Покров, 2001).

— международная научная конференция «Актуальные проблемы развития животноводства» (Львов, 2003) — на научно-практических конференциях:

— научно-практическая конференция «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров, 2001).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 научных работ в сборниках международных и научно-практических конференций и конгрессов и в научных журналах.

Объем и структура диссертации. Основной текст работы изложен на 128 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, библиографического списка (103 отечественных и 35 зарубежных авторов), приложений. Диссертация иллюстрирована 33 таблицами и рисунками.

ВЫВОДОВ.

1. В связи с высокой антибиотикорезистентностью выделяемых от новорожденных телят микроорганизмов для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней животных необходимо применять препарат колицин Е2.

2. С целью профилактики желудочно-кишечных болезней новорожденных телят колицин Е2 применять сразу после рождения в дозе 20 мг на 10 кг живой массы телят внутримышечно, 1 раз в сутки в течение 4−6 дней.

3. С лечебной целью при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят колицин Е2 необходимо применять при первых появлениях клинических признаков заболевания в дозе 20 мг на 10 кг живой массы телят внутримышечно, 1 раз в сутки в течение 6 дней.

4. Учитывая, что колицин Е2 является эффективным антибактериальным препаратом в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов рекомендуется применять колицин Е2 в комплексе с симптоматическими средствами лечения.