Цитостатическая активность низкомолекулярных продуктов опухолевых клеток

Проблема заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований — одна из наиболее актуальных в современной медицине. По данным Всемирной Организации Здравоохранения ежегодно в мире умирает от рака более 4 миллионов человек. Рак входит в число трех основных причин смерти.

Существование противоопухолевого иммунного ответа не вызывает сомнения. Опухолеспецифический иммунный ответ демонстрируется в экспериментах in vitro и in vivo, а опухолеассоциированные антигены с идентифицированы для многих опухолей [10,95]. Однако опухоль использует множественные пути для ускользания от надзора иммунной системы. Пассивные механизмы избегания иммунного ответа связаны со структурными изменениями опухолевой клетки — отсутствие или недостаточность презентации опухолеспецифичных антигенов на опухолевых клетках, снижение экспрессии молекул гистосовместимости, отсутствие костимулирующих молекул и молекул адгезии [151,165].

Менее охарактеризованы и понятны изменения в опухолевых клетках, которые обусловливают более агрессивные способы резистентности, включающие активную деструкцию эффекторных клеток иммунной системы [102,104]. Опухолевые клетки используют комплекс защитных механизмов, позволяющих им активно вмешиваться в противоопухолевый иммунный ответ. Среди них особое место принадлежит способности опухолевых клеток продуцировать широкий спектр иммуносупрессорных медиаторов, результатом действия которых является угнетение функциональной активности опухолеспецифических клеток, в первую очередь Т-лимфоцитов. Рост опухоли сопровождается развитием системной иммуносупрессии, выраженность которой различна при разных видах опухоли. Участие в этих процессах отдельных иммуносупрессорных агентов, продуцируемых опухолевыми клетками, охарактеризовано (ТРФ-|3, ИЛ-10, ПГЕ2,>Ю) [68,183,190]. В то же время, признается, что в развитии иммуносупрессии при опухолевом процессе задействованы не только эти известные медиаторы, но очевидно и другие неидентифицированные агенты [82,130,143,180]. Особый интерес вызывают низкомолекулярные молекулы, которые могут оказывать антипролиферативное действие. Но природа и механизмы их действия не определены.

С другой стороны, продуцируемые опухолью антипролиферативные агенты могут оказывать аутокринное негативное действие, подавляя рост опухоли (ТРФ-|3, NO), либо позитивное, являясь аутокринными ростовыми факторами (ИЛ-10, ПГЕ2) [41,65,74,157,172]. Направленность аутокринного действия определяется спектром медиаторов, продуцируемых опухолевой клеткой. Остается открытым вопрос о влиянии низкомолекулярных медиаторов опухолевых клеток на собственный рост.

Особое место среди опухолевых клеток занимают лейкозные клетки, для которых микроокружением является костный мозг. Полученные ранее данные свидетельствуют, что клетки костного мозга обладают выраженной способностью тормозить рост лейкемических клеток in vitro и in vivo за счет растворимых медиаторов, в том числе низкомолекулярных [11,12,20 169]. Не до конца ясно, какую роль оказывают опухолевые клетки на функциональные способности клеток костного мозга. Роль низкомолекулярных медиаторов в этом процессе не исследована.

Таким образом, углубление и накопление знаний о механизмах взаимоотношения опухоли и иммунной системы позволит найти новые подходы к иммунотерапии онкозаболеваний.

Все вышесказанное определило цель и задачи исследования.

Цель работы — исследовать механизмы действия низкомолекулярных продуктов, продуцируемых лейкозными клетками, на иммунный ответ и рост опухолевых клеток in vitro.

Задачи исследования:

1.Выделить и охарактеризовать низкомолекулярные продукты лейкозных клеток L1210 иР815 и нормальных клеток костного мозга и оценить их влияние на пролиферативную активность Ти В-лимфоцитов.

2.0ценить влияние низкомолекулярных продуктов лейкозных клеток и нормальных клеток костного мозга на пролиферацию опухолевых клеток.

3.Исследовать влияние низкомолекулярных продуктов лейкозных клеток и нормальных клеток костного мозга на иммуносупрессорную и противоопухолевую активность костномозговых клеток. 4. Охарактеризовать антипролиферативные механизмы действия низкомолекулярных продуктов клеток Ы210иР815.

Научная новизна работы.

Впервые получен низкомолекулярный опухолевый медиатор клеточных лейкозных линий Р815и L1210 (ОСФ), который по физико-химическим и функциональным характеристикам отличается от всех ранее описанных супрессорных факторов костномозгового происхождения. ОСФ не является белком, имеет молекулярный вес <0,5kDa, термостабилен, резистентен к ферментному протеолизу, действию липазы и фосфолипазы С, не чувствителен к обработке нейраминидазой. Показано, что ОСФ обладает прямой иммуносупрессорной антипролиферативной активностью за счет блокады клеточного цикла и индукции апоптоза и отменяет иммуносупрессорное действие клеток костного мозга. ОСФ не обладает аутокринной цитостатической активностью и не влияет на цитостатическую активность клеток костного мозга.

Научная и практическая значимость работы.

Полученные данные расширяют представления о роли растворимых медиаторов лейкозных клеток в регуляции иммунологических функций и опухолевого роста. Показано, что низкомолекулярные медиаторы опухолевых клеток Р815 и L1210 оказывают иммуносупрессорное действие и не влияют на опухолевый рост. Физико-химические и функциональные характеристики ОСФ обусловливают целесообразность определения молекулярной структуры этого фактора и получения нового фармакологического препарата, обладающего иммуномодулирующим действием.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Опухолевые клетки секретируют низкомолекулярные <0,5kDa антипролиферативные медиаторы.

2. Опухолевый супрессорный фактор (ОСФ) по физико-химическим и функциональным свойствам отличается от низкомолекулярного костномозгового фактора (КСФ).

3. Низкомолекулярный ОСФ вовлечен в регуляцию как Т-, так и В-клеточных реакций.

4. лейкозные клетки не способны к ауторегуляции in vitro посредством. низкомолекулярных растворимых продуктов и контактного торможения.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации представлены на отчетных сессиях ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1997 г., 2000г), семинарах лаборатории регуляции иммунопоэза ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1997;2004г), на российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клиническои онкологии (Томск, 2004 г.). Апробация диссертации состоялась 13 января 2005 г. на расширенном семинаре ГУ НИИ Института клинической иммунологии СО РАМН.

Публикации По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в центральной печати.

Объем и структура диссертации.

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов, списка литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, включающего 3 таблицы и 18 рисунков.

Список литературы

содержит 198 литературных источников, из них 183 зарубежных.

ВЫВОДЫ:

1. Низкомолекулярные 0,5kDa продукты опухолевых клеток L1210 и Р815 обладают иммуносупрессорным действием, так как ингибируют пролиферацию КонАи ЛПСстимулированных спленоцитов и генерацию цитотоксических лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов.

2.0пухолевые клетки L1210 и Р815 являются продуцентами супрессорного фактора (ОСФ), имеющего молекулярную массу меньшую или близкую 0,5kDa. Для него характерна термостабильность, резистентность к ферментному протеолизу, к действию липазы и фосфолипазы С и не чувствительность к обработке нейраминидазой, из чего следует, что ОСФ не является белком.

3. Механизмом антипролиферативного действия ОСФ является индукция апоптоза и блокада клеточного цикла митогенстимулированных Ти В-лимфоцитов, поскольку увеличивается количество апоптотических КонАи ЛПС-стимулированных лимфоцитов и количество лимфоцитов в Go/Gi-фазе.

4. Лейкозные клетки не чувствительны к аутокринному воздействию низкомолекулярных продуктов, так как ОСФ не изменяет пролиферацию, не блокирует клеточный цикл опухолевых клеток L1210 и Р815 и не вызывает их апоптоз. Лейкозные клетки не способны к собственному контактному торможению, так как изменение плотности клеток в культуре не влияет на их рост, но сохраняют определенную чувствительность к контактному торможению со стороны клеток костного мозга, поскольку выраженность супрессорного действия костномозговых клеток в отношении пролиферации опухолевых клеток уменьшается по мере снижения плотности распределения клеток в совместных культурах.

5. ОСФ отменяет опосредованную клетками костного мозга иммуносупрессорную активность, поскольку нивелирует антипролиферативное действие клеток костного мозга на КонАи ЛПС-стимулированный бластогенез. ОСФ не влияет на цитостатическое противоопухолевое действие клеток костного мозга, так как не изменяет пролиферативный ответ клеток L1210 и Р815 на действие клеток костного мозга.

6. Наличие иммунорегуляторных функций у ОСФ свидетельствует об участии низкомолекулярных медиаторов, продуцируемых опухолевыми клетками, в ускользании опухоли из-под системы противоопухолевого иммунного надзора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

При опухолеобразовании значительно расширяется количественный и качественный состав цитокинов, обладающих как местной, так и дистантной активностью. Не только хорошо охарактеризованные полипептиды, но и низкомолекулярные молекулы могут предохранять опухолевые клетки от иммунного надзора.

Полученные данные свидетельствуют, что низкомолекулярные медиаторы лейкозных клеток мышинной лимфомы L1210 и мастоцитомы Р815 обладают ингибирующим действием на иммунную систему и не эффективны в подавлении опухолевого роста. Доминирующей составляющей иммуносупрессорной активности растворимых продуктов лейкозных клеток является идентифицированный впервые опухолевый супрессорный фактор с молекулярным весом <0,5kDa. ОСФ оказывает прямое цитостатическое действие на пролиферативную активность Ти Влимфоцитов, вызывая их анергию, и не проявляет опосредованного иммуносупрессорного действия. Но, с другой стороны, сами опухолевые клетки не чувствительны к аутокринной регуляции низкомолекулярными продуктами и к контактному торможению. Находясь в костном мозге, лейкозные клетки подвергаются цитостатическому действию со стороны нормальных клеток костного мозга и могут отменять их иммуносупрессорное действие, что способствует сдерживанию опухолевого роста. Выход лейкозных клеток в периферическое кровеносное русло приводит к системной иммуносупрессии, что при отсутствии аутокринного цитостатического влияния ведет к прогрессированию опухолевого процесса.