Исследование сигнальных функций пероксида водорода в процессе фагоцитоза

Во всех живых клетках непрерывно идут процессыподстройки метаболизма в соответствии с внешними воздействиями, к которым относятся изменения химического состава и физических свойств окружающей клетку среды. Если клетка входит в состав многоклеточного организма, то во внешней среде постоянно появляются биологически активные вещества, производимые другими клетками организма. В любой клетке всегда задействованы разнообразные механизмы восприятия и передачи внешней информации и механизмы, регулирующие метаболизм клетки в соответствие с происходящими во внешней среде изменениями. Киназно-фосфатазные сигнальные каскады являются распространенным вариантом таких механизмов.

Около 2% генов человека кодируют протеиновые киназы и фосфатазы, а около 30% всех белков человека постоянно подвергаются фосфорилированию и дефосфорилированию. Киназно-фосфатазные сигнальные каскады участвуют в регуляции большинства аспектов жизнедеятельности клетки.

Регуляция активности киназ осуществляется белками активаторами и репрессорами, молекулами-мессенджерами небелковой природы, пространственным совмещением киназы с субстратом, димеризацией и аутофосфорилированием.

Антагонистами киназ являются фосфатазы, осуществляющие дефосфорилирование субстратов. Регуляция активности фосфатаз также может осуществляться очень разнообразными путями. Один из важнейших механизмов — окисление и восстановления редокс-активных цистеинов в составе фосфатаз. Селективное окисление цистеинов в активных центрах фосфатаз осуществляется пероксидом водрода, производимым ферментами ЫАБРН оксидазами (МОХ).

Примечательно, что впервые КАРРН оксидазы были открыты и охарактеризованы в нейтрофилах. Именно активность КАЭРН оксидаз обеспечивает т.н. окислительный взрыв, то есть явление увеличения немитохондриального потребления кислорода фагоцитирующими клетками. После открытия окислительного взрыва, продукция ИАОРН оксидазами супероксид-анион радикала и пероксида водорода рассматривали только с точки зрения токсичности активных форм кислорода (АФК) для интернализованных в фагоцит бактериальных или эукариотических клеток. В последнее время более подробное изучение механизмов фагоцитоза показало, что ключевая роль в обезвреживании чужеродных клеток в фагосомах принадлежит в большей степени протеазам, нежели пероксиду водорода и супероксид-анион радикалу. Ввиду низкой реактивности, пероксид водорода плохо подходит на роль токсического агента, однако, попадая в фагосому, способен при реакции с СГ образовывать гипохлорную кислоту, существенно более эффективную для окислительного разрушения бактериальныз клеток. Однако сам по себе пероксид водорода, легко диффундирующий сквозь липидные мембраны и поэтому не накапливающийся в фагосоме, вряд ли может рассматриваться, как высокотоксичное для бактериальных клеток вещество.

В последнее время показана ключевая роль NADPH оксидазы в создании условий для активации протеаз в фаголизосоме. Перенося электроны через мембрану, NADPH оксидаза участвует в создании в просвете фагосомы необходимых для активации протеаз условий.

Наряду с изучением путей, которыми фагоцит уничтожает бактериальные клетки в фагосомах, стали появляться всё новые данные о нахождении «главного фагоцитарного фермента» «NADPH оксидазы в нефагоцитирующих клетках. Была показана сигнальная функция для ферментов NOX в нефагоцитирющих клетках. Активность NADPH оксидаз в нефагоцитирующих клетках оказалась связаной с модуляцией активностей разнообразных сигнальных каскадов.

Таким образом, изучение АФК-зависимой внутриклеточной передачи сигнала в последнее время привело к переосмыслению феномена продукции супероксид аниона и пероксида водорода в эукариотических клетках. Особенно интересным авторам данной работы кажется изучения окислительного взрыва в фагоцитирующих клетках. Ещё 30 лет назад окислительный взрыв в фагоцитах рассматривался исключительно как способ разрушить клетки патогена с помощью АФК. В настоящее время, предположение о существовании сигнального аспекта окислительного взрыва, когда пероксид водорода выступает в качестве сигнальной молекулы, выглядит всё более правдоподобным.

Важность изучения киназно-фосфатазных каскадов в живых клетках сложно переоценить. Это важнейшие регуляторные механизмы, которые, по сути, осуществляют связь между влияющими на клетки внешними факторами, биохимическими реакциями, идущими в самих клетках, и «поведением» клеток. Подробное изучение путей внутриклеточной передачи сигнала одинаково важно и для фундаментальных и для прикладных исследований в области клеточной биологии.

Исследования внутриклеточной передачи сигнала с участием пероксида водорода и других АФК п vivo затрудняются отсутствием достаточно быстрых и специфичеых методов детекции.

Кроме того, изучение внутриклеточной передачи сигнала подразумевает возможность изучать локализацию продукции АФК в живых интактных клетках.

Наиболее удачными инструментами для изучения редокс процессов в интактных индивидуальных клетках являются биосенсоры на базе флуоресцентных белков. На сегодня разработано и успешно применяется в клеточной биологии несколько генетически кодируемых сенсоров на базе зеленого флуоресцентного белка ОБР. Они представляют собой химерные белки, состоящие из флуоресцентного домена и домена, несущего редокс-активные цистеины.

При окислении цистеинов чувствительного домена происходит изменение спектра поглощения флуоресцентного белка, при восстановлении цистеинов тиол-восстанавливающими системами клетки происходит возвращение формы спектра в исходное состояние.

К недостаткам таких биосенсоров можно отнести меньший, по сравнению с другими методами детекции АФК, уровень сигнала по отношению к шуму. Кроме того, хромофорные группы всех вРР-подобных белков изменяют флуоресцентные свойства при изменении показателя рН. Словом, генетически кодируемые биосенсоры имеюр ряд недостатков, и, как и любые другие молекулярно-биологические инструменты, нуждаются в непрерывном усовершенствовании.

Таким образом, главной целью работы было изучение сигнальной роли фагоцитарной^ШРН оксидазы в процессе фагоцитоза. Улучшение применяемого в работе молекулярного инструмента, внутриклеточного высокочувствительного к пероксиду водорода биосенсора НуРег, так же входило в наши задачи.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

Целью работы было изучение сигнальной роли фагоцитарной NADPH оксидазы в процессе фагоцитоза, а также усовершенствование основного молекулярного инструмента для визуализации внутриклеточного Н2О2, биосенсора НуРег. Для достижения цели предстояло решить следующие задачи:

1) Разработка метода визуализации с помощью НуРег эндогенного Н2О2, вырабатываемого клетками при различных физиологических стимуляциях.

2) Изучение динамики продукции Н2О2 фагоцитирущими макрофагами.

3) Выявление взаимосвязи активации фагоцитарной NADPH оксидазы с активацией основных МАРК (Mitogen-Activated Protein Kinase) каскадов в фагоцитирующих макрофагах.

4) Оптимизация биосенсора НуРег с целью увеличения диапазона флуоресцентного ответа.

выводы.

1) В данной работе предложены и оптимизированы методы, позволяющие детектировать продукцию пероксида водорода на уровне индивидуальных клеток in vivo. С помощью флуоресцентного генетически кодируемого биосенсора НуРег показана продукция пероксида водорода в фагоцитирующих макрофагах и стимулированных факторами роста клетках HeLa и NIH-3T3.

2) Продукция пероксида водорода при окислительном взрыве в фагоцитирующих макрофагах носит кратковременный характер. Зависимость концентрации пероксида водорода от времени, измеренная для индивидуальных клеток, принципиально отличается от таковой, измеренной для популяции фагоцитирующих клеток.

3) Пероксид водорода, производимый макрофагами при фагоцитозе, выполняет сигнальную функцию в фагоцитах. Активация МАР-киназного каскада Erkl/2 при фагоцитозе зависит от продукции пероксида водорода NADPH оксидазами.

4) Продукция пероксида водорода является достаточным условием снижения вероятности повторных событий фагоцитоза в одной и той же клетке. На основе полученных данных сформулирована гипотеза о существовании в макрофагах сигнальных процессов, проходящих с участием пероксида водорода и приводящих к подавлению фагоцитоза.

5) Новые варианты биосенсора НуРег, разработанные и охарактеризованные в данной работе, обладают увеличенным, по сравнению с исходным биосенсором, диапазоном флуоресцентного ответа на пероксид водорода. Мутации, влияющие на динамический диапазон флуоресцентного ответа биосенсора, локализованы в чувствительном к пероксиду водорода, а не во флуоресцентном домене.