Катаболизм фенольных соединений в связи с их функциями у некоторых высших растений

Растения способны синтезировать огромное количество вторичных соединений, в число которых входят такие большие и разнообразные группы как фенольные соединения, изопреноиды и алкалоиды. Некоторые вторичные соединения могут проявляться только в единичных случаях, другие широко распространены в растительном мире, они могут быть специфичны на уровне различных таксономических групп (порядков, семейств, родов, видов). В пределах одного растения могут наблюдаться различия в составе вторичных соединений, органы и части органов могут различаться в проявлении их биосинтетического потенциала. В основе структурной и функциональной специализации клеток у высоко развитых организмов лежат биохимические и морфологические принципы. Образование вторичных соединений и образование морфологически специализированных клеток в многоклеточном организме является составной частью процесса дифференциации. Морфологическая и анатомическая дифференциация часто совпадает с экспрессией вторичного метаболизма. Особенно наглядно связь между экспрессией вторичного метаболизма и программой дифференциации организма показана в исследованиях с микроорганизмами (Лукнер, 1979).

Актуальность проблемы.

Фенольные соединения интенсивно изучались в течение трех последних десятилетий. Значительные успехи достигнуты в изучении химической структуры и биосинтеза многих классов фенольных соединений. Выделены и изучены ферменты, катализирующие различные стадии их образования в растениях (НагЬогпе, 1988; Запрометов, 1993).

Функции фенольных соединений в растениях важны и многообразны. Известно, что они участвуют в процессах биологического окисления, фотосинтеза, энергетического обмена, иммунитета, роста, репродукции и др. Тем не менее, имеющиеся на сегодняшний день данные о роли фе-нольных соединений в жизни растений остаются неполными и противоречивыми, что объясняется, в некоторой степени односторонней изученностью их метаболизма. Если вопросы биосинтеза фенольных соединений изучены достаточно подробно, то катаболический аспект до настоящего времени мало исследован. Функции фенольных соединений до сих пор рассматривают, главным образом, в связи с их образованием, не учитывая при этом различные пути расщепления.

В настоящее время способность высших растений к расщеплению фенольных соединений уже не вызывает сомнений. Однако, длительное время считалось, что растения способны только синтезировать фенольные соединения. Образование фенольных соединений рассматривали как механизм для удаления побочных продуктов метаболизма из основного обмена, а освобождение запасенной в них энергии приписывали исключительно микроорганизмам, которые используют эти продукты после отмирания растений (Тауэре, 1968).

Первоначальные предположения о превращении фенольных соединений в высших растениях были основаны на наблюдениях по накоплению этих соединений в молодых активно метаболизирующих тканях, снижению уровня или полному исчезновению в отдельных органах на некоторых стадиях роста и развития.

Первое экспериментальное доказательство способности высших растений к глубокому расщеплению флавоноидов вплоть до разрыва бензольных ядер, А и В было получено М. Н. Запрометовым в 1959 г. при введении 14С меченых катехинов в чайное растение. Было установлено, что при катаболизме катехинов в чайном растении значительная часть метки включается во фракцию органических кислот, остальная радиоактивность распределяется между соединениями самой различной природы вплоть до С02. Это свидетельствует о том, что катехины, введенные в чайное растение, подвергаются глубокому расщеплению и что продукты расщепления включаются в основной обмен. Позднее аналогичные данные были получены в работах С. В. Дур-мишидзе и сотр. (1968, 1973, 1974).

В. Барц и сотр., работая с культурами клеток ряда растений, пришли к выводу, что флавонолы могут расщепляться под действием пероксидаз. Среди продуктов расщепления флавонолов ферментами растений были обнаружены соответствующие им 2,3-диоксифлаваноны и оксибензойные кислоты, образующиеся из кольца В. Флороглюцин и флороглюцинкарбоновая кислота не были обнаружены в качестве фрагментов, образующихся из кольца А. На этом основании они предполагают, что флороглюцин и флорглюцинкарбоновая кислота сразу подвергаются дальнейшему расщеплению, хотя при введении этих субстратов извне в суспензии клеток не наблюдали их расщепления (Hosel, Barz, 1972; Hosel et al., 1975; Barz, Hosel, 1979). Разрушение бензольного ядра меченного 14С пирокатехина с образованием меченой углекислоты было показано в исследованиях С. Прасада и Б. Эллиса (Prasad, Ellis, 1978). Однако, многие катаболические аспекты метаболизма фенольных соединений остаются до сих пор недостаточно изученными.

Исходя из структуры, реакции расщепления флавонолгликози-дов можно условно разделить на три последовательные стадии, катализируемые соответствующими ферментами: 1) гидролиз глико-зидной связи- 2) превращение и разрушение флавоноидной структуры и 3) расщепление ароматического кольца.

Изучение ферментов, участвующих в этих процессах и продуктов, образующихся на разных стадиях расщепления, сделало бы более полной картину метаболизма фенольных соединений в растениях.

Выяснение биологического значения этих широко распространенных соединений предполагает также изучение их катаболизма на разных уровнях организации — на уровне различных таксонов, организмов, а также в органах, частях органов и тканях в процессе развития растений.

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось изучение специфических ферментов, катализирующих различные стадии катаболизма фенольных соединений у высших растений, установление их локализации на разных уровнях организации растительных систем и выяснение механизма их участия в жизнедеятельности растений.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Провести скрининг на содержание ферментов, катализирующих расщепление фенольных соединений, различных таксономических групп (семейств, родов и видов) высших растений.

2. Дать характеристику ферментам, катализирующим различные этапы катаболизма фенольных соединений, у растений, с высокой их активностью и содержанием этих соединенийвыделить и идентифицировать некоторые продукты ферментативных реакций.

3. Изучить распределение фенольных соединений и ферментов, катализирующих их расщепление, в индивидуальных растениях, органах и тканях в процессе их развития.

ВЫВОДЫ.

1. Изученные высшие растения содержат специфические ферменты, катализирующие различные стадии катаболизма флавонолгликози-дов: гидролиз гликозидной связи, превращение и разрушение флавоно-идной структуры и расщепление ароматического кольца.

2. Комплексы специфических ферментов катаболизма флавонолгли-козидов характерны для отдельных таксономических групп растений, что предполагает существование альтернативных путей расщепления.

3. Высокая органои тканеспецифичность ферментов различных ступеней расщепления свидетельствует о том, что альтернативные пути катаболизма имеют место и в пределах одного и того же органа, в его функциональных частях (части цветков, ткани листьев).

4. Специфические ферменты катаболизма проявляют избирательность действия на соединения, характерные для растений, из которых они выделены.

5. В катаболизме фенольных соединений играют определенную роль пероксидазы, способные осуществлять каскад реакций расщепления от разрушения флавоноидной структуры до расщепления ароматического кольца.

6. Пероксидазы, расщепляющие флавоноловые агликоны, широко распространены в растительном мире, присутствуют почти во всех органах растений и мало изменяются в процессе развития и обёпе-чивают, по-видимому, общий для большинства растений путь расщепления этих соединений.

7. Специфическое распределение фенольных соединений и ферментов их катаболизма в органах и тканях растений в зависимости от выполняемых ими функций обусловливает и специфические пути превращения. Полифункциональность соединений одной и той же структуры, таким образом, обеспечивается различными путями расщепления под действием специфических ферментов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Проведенные исследования показали, что высшие растения содержат специфические ферменты, катализирующие различные стадии катаболизма фенольных соединений от более сложных флаво-ноидных гликозидов через простые фенольные соединения до продуктов нефенольной природы, включая: 1) реакции гидролиза- 2) реакции превращения и разрушения флавоноидной структуры и 3) реакции расщепления ароматического кольца.

Однако, пути метаболизма для одних и тех же химических структур значительно варьируют в зависимости от видовой принадлежности, специализации органов, их частей, тканей и клеток и выделение такой последовательности является условным. В разных видах растений были обнаружены специфические ферменты, катализирующие различные стадии катаболизма фенольных соединений.

1) Фермент, специфически осуществляющий гидролиз флаво-нолгликозидов, удалось выделить методом электрофореза в полиа-криламидном геле из листьев володушки, отделив ее от перокси-дазы, и изучить некоторые ее свойства. Гликозидаза володушки проявляла строгую субстратную специфичность как по отношению к аг-ликону, так и к углеводной части, ее основными субстратами служили флавонол-3-рутинозиды, накапливающиеся в этих растениях в больших количествах. При этом углеводный фрагмент отщеплялся в виде дисахарида-рутинозы.

2) Флавонолрасщепляющий комплекс володушки содержал пе-роксидазу, катализирующую дальнейшее расщепление агликонов. В качестве продуктов пероксидазного расщепления кверцетина были идентифицированы 2,3-диоксифлаванон, ранее полученный при действии на флавонолы фермента из нута (Hosel, Barz, 1972), и впервые в качестве продукта расщепления флавонолов ферментом из растений была идентифицирована флороглюцинкарбоновая кислота — фрагмент, образующийся из кольца А. Пероксидаза проявляла широкую субстратную специфичность, окисляя халконы, флаво-ны, флавонолы. Однако, 3-гликозиды флавонолов не расщеплялись под действием пероксидазы.

Но пероксидаза, хотя, по-видимому, играет важную роль в расщеплении флавоноидов, не относится к ферментам собственно фла-воноидного метаболизма.

В листьях гречихи посевной нами был обнаружен фермент, способный окислять кверцетин и в отсутствие перекиси водорода. Подобный фермент был выделен ранее из растений мяты (Ргеу-8Ьгос!ег, Ваге, 1979). Флавонолрасщепляющий комплекс гречихи включал, кроме того, и пероксидазу. Оба фермента использовали в качестве субстрата кверцетин с образованием одного и того же продукта 2,3-диоксифлаванона. Ферменты были разделены ионообменной и гель-хроматографией и электрофорезом и различались по свойствам: оптимумам рН, температуры, устойчивостью к нагреванию, молекулярным массам и субстратной специфичностью. В отличие от пероксидазы фермент, условно названный нами флавонолок-сидазой, проявлял высокую субстратную специфичность. Его действие строго ограничивалось флавонолами, незамещенными в положении С—3 и имеющими незамещенные 3', 4'-диоксигруппировку в кольце В.

3) Изучали способность растений к расщеплению более простых фенольных соединений, в частности, образующихся из кольца, А флороглюцинкарбоновой кислоты и из кольца В — протокатеховой кислоты. Бесклеточные экстракты из листьев володушки расщепляли эти соединения только в присутствии перекиси водорода с образованием продуктов нефенольной природы. Причем, расщепление протокатеховой кислоты катализировала при рН 5,0 выделенная электрофоретически пероксидаза, действующая на флавонолы. Действие на флороглюцинкарбоновую кислоту обнаруживали лишь бесклеточные экстракты при рН 7,0−7,5.

Бесклеточные экстракты гречихи посевной также расщепляли оксибензойные кислоты только в присутствии перекиси водорода,.

Поиски специфических ферментов, катализирующих расщепление ароматического кольца, вели, исходя из предположения, что они должны присутствовать в растениях с высоким содержанием простых фенольных соединений. В качестве такого объекта была выбрана осина. Бесклеточные экстракты листьев осины расщепляли кофейную кислоту в отсутствие перекиси водорода с образованием в качестве продукта вещества, имеющего максимум поглощения при 255 нм. Фермент был специфичен к кофейной кислоте, расщеплял также хлорогеновую кислоту (эфир кофейной кислоты с хинной кислотой). Фермент активировался при прибавлении ионов меди, ингибирование фермента наблюдали в присутствии медь-хелатирующего агента — диэтилдитиокарбамата натрия. Можно предположить, что в состав активного центра фермента входит медь, так как добавление Си2+ в присутствии ДЭДТК полностью восстанавливает ферментативную активность.

Таким образом, удалось обнаружить специфические ферменты и идентифицировать некоторые продукты катализируемых ими реакций всех трех стадий расщепления.

Полученные в работе экспериментальные данные по распределению флавонолгликозидов и расщепляющих их ферментов на разных уровнях организации растительных систем свидетельствуют о том, что пути метаболизма флавонолгликозидов, несмотря на общность их химической структуры, значительно различаются в катабо-лическом аспекте в пределах различных таксономических групп. Даже в пределах одного растения органы, части органов, ткани и субклеточные структуры различаются направленностью реакций превращений этих соединений.

При обследовании 124 видов дикорастущих сосудистых растений сибирской флоры, принадлежащих к 95 родам из 27 семейств, на содержание флавонолгликозидов и расщепляющих их ферментов фла-вонолгликозиды обнаружили в 119 видах из всех семейств. Анализ данных по гликозидазной активности обследованных видов показал, что ферменты, гидролизующие флавонолгликозиды, содержатся в 37 видах из 10 семейств. Таким образом, большинство растений содержит флавонолгликозиды, но только небольшая часть из них проявляет способность к их гидролизу. Пероксидазы, катализирующие расщепление флавоноловых агликонов, были обнаружены в 112 видах. Можно сказать, что распространение пероксидаз сопоставимо с распространением флавонолов, т. е. почти повсеместно. Гликозидазы, участвующие в обмене флавонол-3-гликозидов были специфичны для отдельных семейств и, особенно, родов. Например, род Володушка, который отличается высоким содержанием флавонолгликозидов выделялся и активностью гликозидазы. Род Володушка был выбран для более детального исследования катаболических превращений флавонолгликозидов.

При изучении распределения гликозидазной и пероксидазной активности и флавонолгликозидов по органам володушки золотистой использовали цветки, листья, стебли и корни. Было установлено, что наибольшей гликозидазной активностью и высоким содержанием флавонолгликозидов обладали цветки и листья. В стеблях обнаружили низкую гликозидазную активность и низкое содержание флавонолгликозидов, а в корнях они практически отсутствовали. Содержание флавонолов и гликозидазная активность проявляли положительную корреляцию по стадиям развития: максимальная гликозидазная активность сопутствовала максимальному содержанию флавонолов в фазе цветения в листьях и в фазе бутонизации в цветках.

Однако, не все части органов функционируют подобно целому органу. В свою очередь, в пределах специализированного органа цветка, наблюдали варьирование в содержании флавонолгликозидов и гликозидазной активности в частях со специфическими функциями. В отличие от цельных цветков в частях цветка не всегда наблюдали прямую зависимость гликозидазной активности от содержания фла-вонолов. Наблюдаемое содержание флавонолгликозидов и активность расщепляющих их ферментов отражает характер реакций превращений, который определяется, по-видимому, функцией части цветка. Так, в лепестках, одной из функций которых является защита других частей цветка от УФ-радиации, наблюдали низкую активность ферментов, способствующую сохранению в них высокого содержания флавонолгликозидов. В тычинках, напротив, обнаружили самую высокую, по сравнению с другими частями цветка, гликозидазную активность при относительно низком содержании флавонолгликозидов. Для развития и функционирования пыльцы, по-видимому, имеют важное значение реакции превращения гликозилированных форм в негликозилированные. Это подтверждает известные литературные данные о том, что пыльцевым зерном усваиваются только свободные агликоны (Vong, Taylor, 1995).

Изучали характер распределения флавонолов и ферментов, катализирующих реакции превращения и расщепления флавоноидной структуры — флавонолоксидазы и пероксидазы — катализирующих одну и ту же реакцию — превращение кверцетина в 2,3-диоксифлаванон, в различных органах на разных стадиях развития растений гречихи посевной от семян в покоящемся состоянии до завязывания плодов.

Флавонолоксидаза появлялась только на 3-й день после прорастания семян перед резким возрастанием содержания флавонолов на 4-ый день и далее между ними почти постоянно существовала прямая зависимость как в распределении, так и в изменениях в процессе развития. Значительная пероксидазная активность обнаруживалась уже в первый день после прорастания. При этом между содержанием флавонолов и активностью пероксидазы не наблюдали какой-либо зависимости.

Более молодые активно функционирующие органы проявляли и более высокую флавонолоксидазную активность (бутоны цветки, первый настоящий лист -" семядольные листочки, верхние листья -" нижние листья). Пероксидаза, в противоположность этому, не претерпевала значительных изменений.

В бутонах, цветках и кожуре семян — органах выполняющих специфические функции, появляющихся и исчезающих на определенных этапах развития, обнаруживалась только флавонолоксидаза. Но проростки в первые два дня и зеленые плоды не содержали фла-вонолоксидазу, а в нижних листьях, стеблях и корнях активность ее была очень низкой. В то время как органы, присутствующие и жизненно необходимые на всех этапах развития, содержали пероксидазу.

Таким образом, хотя флавонолоксидаза и пероксидаза гречихи посевной катализируют одну и ту же реакцию, очевидно, что они играют различную роль в метаболизме флавонолов. В органах и на стадиях развития, где присутствует только флавонолоксидаза при высокой концентрации флавонолов, по-видимому, преобладают реакции превращения флавоноидов без нарушения флавоноидной структуры, а при высокой активности пероксидазы в отсутствие фла-вонолоксидазы происходит только необратимое разрушение флавоноидов. При совместном присутствии этих ферментов, по-видимому, протекают оба типа реакции. Соотношение активностей флавонолок-сидазы и пероксидазы в различных органах определяет в них направленность реакций метаболизма флавоноидов.

Изучали распределение рутина в разных тканях листьев гречихи и локализацию расщепляющих его ферментов, как одного из механизмов, поддерживающих специфическое распределение рутина в этих тканях с учетом морфологических и возрастных различий листьев разных ярусов. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что ткани листьев гречихи различаются по содержанию рутина и превращающих его ферментов. Результаты исследований подтверждают преимущественное накопление рутина в верхнем эпидермисе листьев гречихи (Магдпа а1., 1990). Предполагают, что флавонолы, локализуясь в эпидермисе лицевой стороны листа, играют роль защитного экрана от УФ-облучения, так как они сильно поглощают в областях 250−260 нм и 350−380 нм, оказывающих повреждающее действие, в частности, вызывающих димеризацию пиримидиновых оснований в ДНК. По-видимому, самая низкая активность всех исследованных ферментов, катаболизирующих рутин в верхнем эпидермисе, способствует сохранению самой высокой его концентрации в этой ткани.

Соответственно, высокая активность специфических катаболизирующих ферментов (гликозидазы и флавонолоксидазы) в нижнем эпидермисе обусловливает, вероятно, более низкое содержание рутина и дает основание предполагать о важном значении в этой ткани реакций его катаболизма. Возможно, рутин в этой ткани играет роль запасного дыхательного субстрата.

Высокая активность флавонолоксидазы и пероксидазы в мезофилле при отсутствии гликозидазной активности (или слабой ее активности в листьях верхнего яруса) наводит на мысль о том, что последовательность реакций расщепления скоординирована между клетками тканей и имеет место межтканевой транспорт кверцетина как продукта гликозидазной реакции из тканей, где он может образоваться. Межтканевый транспорт предшественников как один из вариантов развития биосинтетических процессов рассматривают Ж. Граз-дина и сотр., исходя из результатов изучения межтканевого распределения биосинтетических ферментов и продуктов их реакций в листьях гороха (НгагсКпа а1., 1982).

Специфическое распределение рутина и расщепляющих его ферментов в тканях листьев гречихи обусловливает, по-видимому, различные физиологические функции рутина в зависимости от направленности реакций расщепления под действием присутствующих в этих тканях ферментов.

Таким образом, делая обзор экспериментальных данных по распределению флавонолгликозидов и превращающих их ферментов на разных уровнях организации растительных систем, необходимо отметить следующие общие положения: дифференциацию путей катаболизма фенольных соединений даже одинаковой химической структуры как на уровне разных таксономических групп, так и на уровне отдельных органов, их частей, тканей и клеток. При этом на уровне органов наблюдали положительную корреляцию между содержанием флавонолгликозидов и специфических флавонолпревращающих ферментов и сохранение этой корреляции в процессе развития во всех исследованных случаях — гликозидазы в цветках и листьях во-лодушки и флавонолоксидазы в цветках и листьях гречихи. Однако, уже на уровне цветков володушки и гречихи и тканей листьев гречихи такая зависимость не наблюдается: содержание флавонолов и активность специфических ферментов распределяется дифференцированно — высокое содержание поддерживается низкой активностью катаболических ферментов и, соответственно, высокая активность фермента обусловливает низкое содержание флавонолов или высокое содержание флавонолов сопровождается высокой активностью ферментов в зависимости от специализации части органа, ткани. Таким образом, орган растения является как бы замкнутой системой, в пределах которой существует корреляция и координация метаболизма флавонолгликозидов между его частями и тканями.