Морфологическая оценка слизистых оболочек человека методом оптической когерентной томографии

Создание новых методов визуализации представляет собой актуальное и исключительно важное направление в биологии. Основными требованиями, предъявляемыми к современным технологиям, являются высокая разрешающая способность, возможность прижизненного быстрого получения изображений с минимальным повреждающим действием, портативность и относительная дешевизна регистрирующей аппаратуры. Такие тенденции в разработке новых методов построения изображений биологических тканей продиктованы современными подходами к изучению морфо-функционального состояния биологических тканей. Получение прижизненных изображений биологических объектов безвредным, безболезненным и нетравматичным способом весьма актуально как для фундаментальных исследований живых систем, так и для биомедицинских приложений — ранней диагностики заболеваний, применения адекватных, минимально инвазивных, органосохраняющих способов лечения.

Известные методы получения изображения биологических тканей, такие как рентгеновская компьютерная томография, магнитно-резонансная томография и ультрасонография, позволяют визуализировать структурные особенности тканей в человеческом организме с пространственным разрешением 1000−100 мкм [131, 272]. Этого, однако, недостаточно для идентификации многих важных патологических процессов, таких как атрофия, гиперплазия и метаплазия эпителия, отек и клеточная инфильтрация соединительной ткани и ранних неопластических изменений — дисплазии и карциномы in situ. В последнее время предпринимаются попытки приблизить разрешающую способность методов к клеточному уровню (~10 мкм), что стало возможным для ядерного магнитного резонанса с использованием сильного магнитного поля [304] и для таких оптических методов, как конфокальная микроскопия [235, 276] и низкокогерентная оптическая интерферометрия [21, 71, 125, 151, 298]. Последняя, на наш взгляд, имеет все предпосылки для того, чтобы стать одним из существенных шагов на этом пути.

Низкокогерентная оптическая интерферометрия^ дающая субмиллиметровое пространственное разрешение, была впервые использована в работе японских авторов [282] для наблюдения неоднородностей структуры в образцах материалов для оптоэлектроники.

Термин «оптическая когерентная томография» (ОКТ) появился в 1991 году в работе коллектива американских ученых под руководством^ З.С.Рирто^ [185], посвященной расширению возможностей низкокогерентной интерферометрии: к одномерной картине оптических неоднородностей в глубину зондируемого объекта было добавлено поперечное механическое сканирование луча, и запись двумерных изображений. Понятие «томография» не совсем точное и означает послойное-восстановление изображений путем решениянекоторой обратной математической задачи, однако термин «оптическая когерентная, томография» признан сейчас во всем мире-. На. настоящий’момент в мире более 100-исследовательских групп — из Массачусетского технологического института, Калифорнийского университета в Ирвайне, Венского университета, Медицинского лазерного центра в Любеке, Института прикладной физикиРоссийской Академии Наук (ИПФ РАН) в Нижнем Новгороде — развивают метод ОКТ, прежде всего, применительно к тканям человека.

Важными характеристиками метода ОКТ являются неинвазивность, безопасность используемого излучения' в ближнем инфракрасном (ИК) диапазоне с мощностью порядка 1 мВт. Глубина зондирования, достигающая" 1,5−2 мм, является достаточной для обследования покровных тканей, малодоступных для других высокоразрешающих методов получения изображения. Разрешение в 10−15 мкм позволяет различать структуру оптических неоднородностей биологических тканей, обусловленных вариациями коэффициента обратного отражения. Интерпретация этих изображений является серьезной задачей с точки зрения морфологии и представляет интерес для-клинического использования OKT. Информация о ткани, получаемая с помощью ОКТ, является прижизненной и отражает не только структуру, но и особенности ее функционального состояния. Метод исключает травму и не имеет ограничений, присущих традиционной биопсии.

Возможность ОКТ изучать внутреннюю структуру тканей с высоким разрешением делает метод весьма перспективным для проведения прицельной биопсии с целью раннего обнаружения рака и предраковых состояний [39, 153, 160, 173, 177, 185, 208, 215, 269, 270]- предоперационного планирования линии резекции и интраоперационного мониторинга в минимально инвазивной хирургии [92, 209, 211, 212, 214, 232, 266], дифференциальной диагностики заболеваний со сходными клиническими проявлениямимониторинга процессов репарации и раннего выявления рецидивов при наблюдении за отдаленными результатами лечения [124, 273]. Технические характеристики ОКТ обусловливают выбор объектов приложения метода. Ими могут быть кожа [15, 20, 53, 172, 227, 264], слизистые оболочки, [19, 96, 157, 189, 258, 263, 265, 268, 302, 317], кровеносные сосуды [126, 223, 224, 226, 283, 311], ткани глаза, прозрачные в ближнем ИК диапазоне [152, 175, 201, 219, 234, 288], зубы [73, 156, 307], мозговые оболочки и верхние слои тканей мозга после трепанации черепа или интраназального доступа [107, 232, 246, 247, 252, 253], биоматериалы [156, 192].

Благодаря созданию микрозонда и совмещению его со стандартными эндоскопами, доступными для ОКТ стали слизистые оболочки дыхательных путей (ОКТ-ларингоскопия, ОКТ-бронхоскопия) [84, 266], желудочно-кишечного тракта (ОКТ-фиброгастродуоденоскопия) [196, 263, 265, 271, 321], мочевыводящих путей (ОКТ-цистоскопия) [68, 157, 268], внутренних половых органов женщин (ОКТ-кольпоскопия, ОКТ-гистероскопия) [38, 157, 268], а так же некоторые органы брюшной полости, висцеральная и париетальная брюшина (ОКТ-лапароскопия) [157].

Методом ОКТ могут быть оценены структурные изменения эпителия и подлежащих слоев слизистых оболочек человека, что свидетельствует о перспективности его применения: для получения прижизненной информации о структурных изменениях органа, сопоставимой с данными эксцизионной биопсии, и уже сегодня дает повод некоторым авторам называть метод ОКТ «оптической биопсией» [125, 127−129, 168].

Результаты ОКТ-исследований интактных и патологически измененных тканей показали, что найден новыйморфологический способ анализа" и разработаны способы его применения для решения диагностических задач. В данной работе впервые дана морфологическаяоценка изображенийполученных с помощью нового метода неинвазивного исследования эпителия*и субэпителиальных структура слизистых оболочках человека!

Любой вид диагностики основан, на изучениипараметров * обследуемого объекта и сравнении: их с существующим эталономРаботыпо идентификацииОКТ-изображений были начаты исследователями ¿-различных групп с момента рождения метода [185]- и, соответственно' уровню" разрешающей способности метода — 15 мкм, «золотымстандартом» при интерпретации ОКТ-изображений являетсягистологический анализ. Работы по сравнению ОКТ-изображений с гистологической структурой тканей относятся в подавляющем большинстве к исследованиям, проведенным с, помощью ротационного сканера, получившего наибольшее распространение у зарубежных научных групп и устроенного аналогично зондам высокочастотного ультразвука. [142, 250- 308]. Кроме того, исследования касались единичных объектов, вних не предпринималось, попыток обобщения признаков, непроводилось сравнений ОКТ-изображенийразличных тканей и органов [105, 139, 181, 196, 237]. В литературе отсутствуют работы по морфологическому обоснованию метода ОК’Г в, исследовании слизистых оболочек с помощью торцевого зонда, в которых были бы применены методы идентификации слоев, проанализированы принципы формирования ОКТ-изображений в зависимости от строения слизистых оболочек, проведено сравнение ОКТ-изображений слизистых оболочек различной локализации в норме, определены общие для всех слизистых оболочек признаки патологических процессов.

Цель работы: разработатьновый принцип морфологического анализа биологических тканей для оценки структурных изменений в слизистых оболочках человека, основанный на методе оптической когерентной томографии.

Задачи:

1. С помощью сравнительного анализа нового метода неинвазивной визуализации — оптической когерентной томографии — и традиционных способов гистологического изучения тканей найти морфологические эквиваленты на оптических изображениях тканей и органов, позволяющие оценить их структуру без взятия биопсии.

2. Определить морфологические признаки оптических изображений тканей слизистых оболочек, полученных методом оптической когерентной томографии и выявить общие закономерности формирования оптических изображений интактных слизистых оболочек различной локализации. Обосновать возможности оптической когерентной томографии отражать особенности морфологического строения слизистых оболочек.

3. Дать характеристику оптических признаков патологических процессов на основе сравнительной оценки морфологических изменений" слизистых оболочек и прижизненной оценки их структуры с помощью оптической когерентной томографии и разработать сравнительно-морфологические критерии оценки с помощью оптической когерентной томографии структуры слизистых оболочек при патологических отклонениях.

4. При злокачественных процессах в слизистых оболочках дать характеристику их оптических признаков в зависимости от выраженности процесса и выявить общие закономерности визуализации неоплазии.

5. Оценить с помощью статистических методов исследования* диагностическую эффективность метода оптической когерентной томографии. Научная новизна.

Разработан новый фундаментальный принцип изучения организации эпителиев, и подэпителиальных структур с помощью высокоразрешающего метода визуализации — оптической когерентной томографии.

Гистологическая — структура интактных слизистых оболочек имеет эквиваленты на оптических изображениях, полученных методом оптической когерентной томографии, за счет различий в рассеянии света структурными1 компонентами тканей и органов. На оптических изображениях интактных. слизистых оболочек идентифицируются слои, отражающие их упорядоченную горизонтальную архитектуру.

Впервые установлены, оптические признаки измененияструктуры слизистых оболочек. На оптических изображениях эпителия, полученных методом оптической когерентной" томографии, визуализируются гиперплазия, атрофия, гиперкератоз, акантоз, метаплазияопределяемые по размерам, верхнего слояинтенсивности оптического сигнала, структурности и характеру границы с подлежащим слоем. На. оптических изображениях соединительной ткани, визуализируются отек и клеточная инфильтрация, определяемые по интенсивности и неоднородности оптического сигнала. Изменения свойств оптического сигнала на изображениях, полученных методом оптической когерентной томографииобусловлены количеством клеток, их формой, накоплениемкератогиалина и кератина или интерстициальной жидкости, неровностью базальной мембраны. Выявленные оптические феномены универсальны. Длявсех слизистых оболочек показано, что достоверным оптическим признаком доброкачественного характера патологического процесса в слизистых оболочках является слоистая структура оптических изображений, полученных методом оптической когерентной томографии.

Выявлено, что патологические процессы в слизистых оболочках, морфологически характеризующиеся присутствием нескольких состояний, таких как гиперплазия эпителия с гиперкератозом и акантозом, папилломатоз и клеточная инфильтрация соединительной ткани, уменьшают контраст между слоями на оптическом изображении, полученном методом оптической когерентной томографии, и при прогрессировании структурных нарушений приводят к исчезновению горизонтальной упорядоченности элементов изображения.

Установлены закономерности формирования оптических изображений, полученных методом оптической когерентной томографии, гистологически верифицированных неопластических процессов в слизистых оболочках различной локализации в зависимости от тяжести процесса — от легкой степени дисплазии доинвазивного рака. Оптические изображения легкой степени дисплазии эпителия не обладают специфичностью, в целом остаются структурными и отражают такие признаки, как ороговение, гиперплазия многослойного плоского эпителия, акантоз. При тяжелой дисплазии и раке in situ теряется контраст между эпителием и стромой, что выражается в полной или почти полной потере структурности оптических изображений, полученных методом оптической когерентной томографии. При исследовании инвазивных форм рака независимо от вида слизистой оболочки метод демонстрирует бесструктурные оптические изображения и быстрое затухание оптического сигнала по глубине. Доказано, что специфичность оптического сигнала на изображениях, полученных методом оптической когерентной томографии при неоплазии, обусловлена увеличением количества клеточных элементов, изменением размеров и формы клеток, ядерным полиморфизмом, увеличением ядерно-цитоплазматического отношения, нарушением взаимоотношений между клетками, а также между клетками и базальной мембраной.

Впервые применены количественные методы определения контраста в системе «эпителий — субэпителиальный слой» на оптических изображениях, полученных методом оптической когерентной томографии интактных и патологически измененных слизистых оболочек. Показано, что количественные характеристики контраста позволяют более точно определить степень патоморфологических нарушений, что способствует повышению эффективности метода.

Научная новизна исследования подтверждена патентами.

• «Способ диагностики in vivo патологической зоны в слоистой системе биологического органа эпителий — подлежащая соединительная ткань». Гладкова Н. Д., Загайнов В. Е., Загайнова Е. В., Кузнецова И. А., Петрова Г. А., Снопова Л. Б., Терентьева А. Б., Чумаков Ю. П., Шахов A.B., Шахова Н. М., Геликонов В. М., Геликонов Г. В., Иксанов P.P., Куранов Р. В., Сергеев A.M., Фельдштейн Ф. И. Патент РФ № 2 169 525. — 2000. — Бюл. № 18. — С. 93−94.

• «Способ дооперационного определения дистальной границы резекции прямой кишки при раке». Абелевич А. И., Снопова Л. Б. Патент РФ № 2 290 070. — 2006. — Бюл. № 36. — С. 182−183. Научно-практическая значимость.

Разработанный новый фундаментальный принцип изучения структурной организации тканей и органов с помощью высокоразрешающего неинвазивного быстродействующего прижизненного метода получения изображений — оптической когерентной томографии — позволяет отличать интактную ткань от патологически измененной, давая информацию о морфологических изменениях эпителиев и подэпителиальных слоев слизистых оболочек. Установленные закономерности в отображении слоистого строения интактных слизистых оболочек человека и в обнаружении патологических процессов, изменяющих оптические свойства тканей, позволяют:

1) применить метод оптической когерентной томографии для дифференциальной диагностики патологических процессов в слизистых оболочках человека;

2) определить линейные границы распространенности патологического процесса;

3) в реальном времени выбрать оптимальный для прицельной биопсии участок с потерей характерной для интактной слизистой оболочки структурой оптических изображений и наличием оптических критериев неоплазии, избежав проведения необоснованных вмешательств. Оптимизация прицельной биопсии с помощью оптической когерентной томографии позволяет снизить число и повысить информативность биопсий при динамическом исследовании;

4) получать информацию в момент обследования больного, что в сочетании с высокой разрешающей способностью и неинвазивностью является веским аргументом для использования оптической когерентной томографии в качестве метода контроля органосохраняющих операций в минимально инвазивной хирургии. Возможность метода оптической когерентной томографии более точно по сравнению с визуальной оценкой детектировать границы опухоли делает его перспективным для интраоперационного планирования линии резекции при органосохраняющих и реконструктивных операциях, что позволит выполнить адекватное удаление опухоли и снизить процент рецидивов;

5) проводить мониторинг качества выполнения щадящих хирургических вмешательств в процессе послеоперационного динамического наблюдения за состоянием слизистых оболочек, контролировать эффективность проводимой терапии;

6) использовать оптическую когерентную томографию как скрининговый метод выявления патологии слизистых оболочек при популяционном обследовании населения.

Апробация и внедрение результатов исследования.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены: на 7 ежегодных международных симпозиумах по биомедицинской оптике (BIOS'96 — 98- 2000; 2003;2005) в Австрии, Италии, СШАна 2 конференциях по лазерам и электронной оптике CLEO (Сан-Франциско, Калифорния, США, 1998; Балтимор, США, 1999) — на 17 международном конгрессе по раку, Рио де Жанейро, Бразилия, 1998; на международном конгрессе «Лазер и медицина-99», Москва, 1999; на Юбилейном симпозиуме, посвященном 10-летию Ассоциации фониатров и фонопедов «Заболевания голосового аппарата и верхних дыхательных путей», Москва-Владимир, 2001; на научно-практической конференции, посвященной 60-летию окружного военного клинического госпиталя «Актуальные проблемы современной практической медицины», Подольск, 2001; на 3 Конференции по диагностическому оптическому имиджингу Национального института здоровья, Бетезда, США, 2002; на конференции Средиземноморья, 2002; на восьмой Российской' гастроэнтерологической неделе, Москва, 2002 г.-. на Всероссийской конференции с международным участием «Проблема реабилитации в оториноларингологии», Самара, 2003; на конференции РАЕ «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», Греция, 2003; на 11 Центральноевропейском конгрессе по колопроктологии, Граз, Австрия, 2006; на III Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы урологии. Заболевания предстательной железы. Новые технологии в урологии», Уфа, 2007; на международном, симпозиуме- «Актуальные проблемы биофотоники», Нижний Новгород-Москва. 2007; на 3-ей Троицкой-конференции «Медицинская физика и инновации в медицине», Троицк, июнь 2008; г., на международном симпозиуме «Актуальные проблемы биофотоники», Нижний Новгород — Самара, 2009.

Материалы диссертации нашли отражение в научно-исследовательских работах, выполненных в институте прикладной физики РАН и Нижегородской государственной медицинской академии с участием автора, используются в циклах лекций и практических занятий на кафедрах гистологии с цитологией и эмбриологией, болезней уха, горла и носа НижГМЛ.

Для практических врачей с участием автора издано:

Учебное пособие для врачей:"Методы диагностики состояния слизистой: оболочки мочевого пузыря" // Стрельцова О. С. Загайнова Е. В, Крупин B.H., Гладкова? Н.Д., Снопова Л. Б., Власов В. В. — Нижний Новгород: — Издательство НГМА. — 2007. — 56 с. — ISBN 978−5-7032−0670−6.

Руководство по оптической когерентной томографии" // Иод редакцией? д.м.н. проф. Н. Д. Гладковой, д.м.н. Н. М. Шаховой, чл.-корр. РАН д.ф.-м.н. А. М. Сергеева: — Mi — ФИЗМАТ ЛИТ. — 2007. — 296 с. — ISBN, 978−5-92 210 820−1. Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 36 работ. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена? на 296 страницах: машинописного текста, содержит: 17 таблиц и 162 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора1 литературы, главыописывающей материалы и методы исследований, 5 глав, собственных: исследованийобсуждения? результатов,., заключения, выводовпрактических: рекомендацийуказателя литературы, включающего 89 отечественных и 233 иностранных источника.

ВЫВОДЫ.

1. Морфологический анализ эпителиев и подлежащих тканей, основанный на получении оптических изображений методом оптической когерентной томографии, отражает закономерности организации интактных слизистых оболочек человека. Структура оптических изображений формируется за счет контраста, обусловленного различной интенсивностью оптического сигнала от тканей, входящих в состав слизистых оболочек.

2. Оптические изображения интактных слизистых оболочек имеют в своей структуре горизонтально расположенные слои с контрастной, ровной и непрерывной границей между ними. Эпителиальному слою в интактных слизистых оболочках, выстланных многослойным эпителием, и слизистой оболочке в целом в желудочно-кишечном тракте, соответствует верхний слой со слабым или умеренным уровнем оптического сигнала. Второй слой с высоким уровнем сигнала формируется за счет большой светорассеивающей способности соединительной ткани. Мышечная ткань детектируется как слой с низким уровнем сигнала.

3. Ороговение эпителия, морфологические особенности соединения эпителия и подэпителиального слоя соединительной ткани, ориентация и плотность расположения соединительнотканных волокон, а также структура подлежащих тканей, влияют на оптические признаки интактных слизистых оболочек и формируют характерную структуру оптических образов конкретных локализаций. Это выражается в особенностях визуализации эпителия и наличии разного количества слоев на оптических изображениях, полученных методом оптической когерентной томографии.

4. Патологические процессы в слизистых оболочках меняют взаимоотношения в динамической системе «эпителий — подэпителиальные структуры», что отражается на характере оптических изображений, полученных методом оптической когерентной томографии, в виде изменения контраста между слоями, интенсивности и глубины оптического сигнала.

5. Гиперплазия, атрофия, гиперкератоз эпителия, а также отек и клеточная инфильтрация соединительной ткани имеют универсальные оптические образы независимо от типа слизистых оболочек. Оптические изображения, полученные методом оптической когерентной томографии, достоверно отражают процессы метаплазии в эпителии слизистых оболочек. Универсальной закономерностью в структурной организации оптических изображений указанных процессов в слизистых оболочках является сохранение слоев. Этот признак стереотипен для всех изученных тканей и органов.

6. Выраженные нарушения структуры слизистых оболочек при сочетании пролиферативных и воспалительных процессов меняют оптические свойства тканей и вносят значительные изменения в оптические изображения, полученные методом оптической когерентной томографии. Гиперплазия эпителия с гиперкератозом и акантозом, папилломатоз и клеточная инфильтрация соединительной ткани уменьшают контраст между слоями на оптическом изображении, границы между ними теряют четкость, а при нарастании структурных изменений приводят к нарушению горизонтальной упорядоченности элементов изображения.

7. Неопластические изменения в слизистых оболочках имеют общие признаки и закономерности формирования оптических изображений, полученных методом оптической когерентной томографии, в зависимости от тяжести неоплазии. Легкая степень дисплазии эпителия не имеет характерных оптических признаков на изображении, полученном методом оптической когерентной томографии. Тяжелая степень дисплазии и рак in situ изменяют оптические свойства как эпителия, так и подлежащей соединительной ткани, в результате чего теряется контраст между этими слоями и происходит почти полная потеря структурности оптических изображений, полученных методом оптической когерентной томографии.

При инвазивном раке в слизистых оболочках независимо от их локализации нарушаются слоистость и структурность, что приводит не только к полной потере контраста между эпителием и подлежащей соединительной тканью, но и к уменьшению глубины изображения.

8. Выявленные с помощью оптической когерентной томографии закономерности изменения оптических свойств тканей слизистых оболочек человека отражают патологические пространственные изменения и степень нарушения морфологической упорядоченности в зависимости от тяжести патологического процесса и могут служить основой прижизненной диагностики. Оптическая когерентная томография демонстрирует высокую чувствительность (82 — 98%) и специфичность (71— 98%) в распознавании неоплазии слизистых оболочек полости рта, гортани, шейки матки, мочевого пузыря. Количественная оценка контраста оптических изображений, полученных методом оптической когерентной томографии, позволяет провести дифференциальную диагностику патологических процессов в слизистых оболочках и повысить диагностическую точность метода.

9. Оптическая когерентная томография, являясь высокоразрешающим неинвазивным быстродействующим прижизненным методом изучения структурной организации тканей и органов, способна дать достоверную информацию о морфологических изменениях эпителиев и подэпителиальных слоев слизистых оболочек, что может быть использовано при скрининговых обследованиях населения для выявления патологии слизистых оболочек в различных областях клинической медицины, а также при мониторинге динамики развития патологического процесса и эффективности проводимого лечения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Результаты проведенного исследования показали, что оптическая когерентная томография, являясь высокоразрешающим неинвазивным быстродействующим прижизненным методом визуализации, представляет собой новый способ изучения структурной организации тканей и органов.

Новый принцип анализа пространственной организации слизистых оболочек позволяет признать его пригодность для проведения клинических исследований в выявлении патологических изменений в органах и тканях человека и предложить практическому здравоохранению следующие рекомендации по использованию оптической когерентной томографии:

1. В диагностике злокачественных новообразований и для выявления очагов малигнизации в слизистых оболочках с целью определения фокуса патологии.

2. Для дифференциальной диагностики патологических процессов со сходными клиническими проявлениями.

3. Для оптимизации проведения прицельной биопсии.

4. Для определения линейных границ распространенности патологического процесса, уточнения стадии заболевания и определения линии адекватной резекции при выполнении щадящих операций.

5. Для мониторинга эффективности проведения терапии, процессов репарации и раннего выявления рецидивов при наблюдении за отдаленными результатами лечения.