Состояние свободнорадикальных процессов и содержание веществ низкой и средней молекулярной массы у крупного рогатого скота в постнатальном онтогенезе

Актуальность исследования.

Высокоинформативная характеристика метаболического статуса сельскохозяйственных животных и раннее выявление развивающихся нарушений обмена веществ с помощью современных биохимических и физиологических методов исследования способствует своевременному принятию профилактических мер. В последние годы большое внимание уделяется изучению свободнорадикального метаболизма, главным образом, пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и состояния антиоксидантной системы (АОС), так как разобщение этих процессов существенно снижает резистентность организма к воздействию неблагоприятных факторов и является причиной многих патологических состояний [Halliwell, 1992; Fridovich, 1994; Ito et al., 1994; Libby, 1995; H. Morihiko, 1995; Ю. В. Абакумова и совт. 1996; B.T. Величковский, 2000; В. В. Абрамченко, 2001; Н. К. Зенков и соавт., 2001; Р. Х. Кармалиев, 2002]. Для коррекции патологических состояний широко применяются антиоксиданты, в то же время их применение может быть оправдано, если имеются достоверные сведения о состоянии системы ПОЛ/АОС в организме. В медицине все шире используются методы интегральной оценки интенсивности ПОЛ и состояния АОС основанные на регистрации спонтанной, либо активированной хемилюминесценции тест-объекта. [Ю. А Владимиров и соавт., 1990, P.P. Фархутдинов и соавт., 2000; Т. Д. Журавлева и соавт., 2003]. Однако в ветеринарии использование этого метода ограничено, практически не имеется данных о состоянии ПОЛ и АОС в организме сельскохозяйственных животных, в частности крупного рогатого скота (КРС). Также отсутствуют сведения о сопряжении свободнорадикальных процессов с содержанием веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) крови, уровень которых рекомендуется использовать в качестве «критерия здоровья» [М.Я. Малахова, 1993]. Представляет практический интерес и является актуальным выявление взаимосвязи между показателями ПОЛ, АОС и ВНСММ у КРС для разработки патогенетически обоснованных методов коррекции нарушений метаболизма. Учитывая, что одной из возможных причин сдвигов в обмене веществ является потребление кормов и биодобавок, р содержащих ацетальдегид [L. Feiman, С, Lieber, 1999], интересно было проследить взаимосвязь между процессами ПОЛ, АОС и содержанием ВНСММ в эксперименте на лабораторных животных при развитии интоксикации уксусным альдегидом.

Цель исследования. Выявление особенностей протекания свободнорадикальных процессов пероксидации липидов, состояния антиоксидантной системы и взаимосвязи их с уровнем ВНСММ у крупного рогатого скота в постнатальном онтогенезе и при разных физиологических состояниях для совершенствования оценки их метаболического статуса, ц Задачи исследования:

1. Изучить интенсивность процессов пероксидного окисления липидов и состояние антиоксидантной системы в организме крупного рогатого скота клинически здорового и с признаками нарушенного обмена веществ.

2. Определить степень сбалансированности процессов пероксидного окисления липидов с состоянием антиоксидантной системы и уровнем веществ низкой и средней молекулярной массы у крупного рогатого скота в норме и с клиническими признаками метаболических нарушений.

3. Выявить взаимосвязь между показателями пероксидного окисления липидов, антиоксидантной системы и веществ низкой и средней молекулярной массы крови при острой химической интоксикации в эксперименте.

Научная новизна работы. Установлены возрастные особенности деятельности прооксидантной и антиоксидантной систем у крупного рогатого скота в физиологических условиях. Показано, что с 2-х месячного возраста интенсивность процессов пероксидации липидов у клинически здорового крупного рогатого скота находится на постоянном уровне, аполноценная функциональная антиоксидантная система окончательно формируется к 6-ти месячному возрасту. Выявлены ф особенности свободнорадикальных процессов и состояния АОС у коров в ходе репродуктивного цикла. Интенсивность свободнорадикального окисления липидов поддерживается у здоровых коров на постоянном уровне независимо от физиологического состояния. При метаболических нарушениях неспецифического характера отмечается активизация пероксидного окисления липидов и истощение системы антиоксидантной защиты. Впервые рассчитан коэффициент сбалансированности, представляющий собой отношение показателей состояния АОС и интенсивности ПОЛ. Установлена корреляция показателей интенсивности ПОЛ и состояния АОС с уровнем ВНСММ в крови коров и телок в норме и при метаболических нарушениях. Усиление свободнорадикального окисления способствует накоплению ВНСММ в крови животных. Получены новые сведения об интенсивности процессов ПОЛ, состояния АОС и сопряжения этих процессов с накоплением ВНСММ в плазме крови и эритроцитах в норме и при интоксикации уксусным альдегидом Показано, что усиление интенсивности пероксидных процессов приводит к повышению содержания ВНСММ в плазме крови и эритроцитах.

Практическая значимость работы. Результаты исследований позволяют рекомендовать определение интенсивности ПОЛ, АОС и концентрации ВНСММ для контроля над над состоянием здоровья животного и для своевременного выявления отклонений в обмене веществ. Рассчитанный коэффициент сбалансированности, представляющий собой отношение показателей состояния АОС и интенсивности ПОЛ является критерием оценки уровня свободнорадикального метаболизма и может быть использован для раннего выявления метаболических сдвигов. Полученные сведения о состоянии свободнорадикальных процессов необходимо использовать при составлении рационов кормления крупного рогатого скота. КРС. Результаты исследований отражены в учебном пособии «Биохимия печени и почек», рекомендованном Учебно-методическим объединением вузов РФ по образованию в области зоотехнии и ветеринарии для студентов вузов по специальности «Ветеринария».

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: IV Съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2001) — научно-практической конференции, посвященной 40-летию Алтайского государственного аграрного университета (Барнаул, 2002) — научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов Омского государственного аграрного университета (2001, 2002, 2003, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 144 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, иллюстрирована 14 таблицами, 33 рисунками. Библиографический список включает 217 источников, в том числе 87 — зарубежных авторов.

Выводы.

1. Интенсивность процессов пероксидного окисления липидов у клинически здорового крупного рогатого скота стабилизируется к 2 месячному возрастуантиоксидантная система окончательно формируется к 6 месячному возрасту.

2. У клинически здоровых коров в ходе репродуктивного цикла процессы пероксидного окисления липидов протекают на постоянном уровне, а антиоксидантная система достоверно усиливает свое действие у коров при наиболее напряженных для них физиологических состояниях.

3. У клинически здорового крупного рогатого скота независимо от возраста и физиологического состояния существует сопряжение свободнорадикальных реакций пероксидации липидов с состоянием антиоксидантной системы. У животных с клиническими признаками нарушения обмена веществ наблюдается усиление пероксидного окисления липидов (в среднем на 60%) и снижение емкости антиоксидантной системы (в среднем на 15%).

4. Коэффициент сбалансированности, который представляет собой отношение показателя состояния антиоксидантной системы к показателю пероксидного окисления липидов, позволяет выявить нарушения метаболизма на ранних стадиях. Значения коэффициента сбалансированности клинически здоровых животных достоверно не различается между собой, что указывает на сбалансированность действия прооксидантной и антиоксидантной систем. У крупного рогатого скота с клиническими признаками нарушения обмена веществ числовые значения коэффициента сбалансированности достоверно отличаются в среднем на 50%, от аналогичного показателя здоровых животных, что указывает на состояние окислительного стресса.

5. Уровень содержания ВНСММ в крови крупного рогатого скота стабилизируется к 6 месячному возрасту. При наиболее напряженных физиологических состояниях концентрация ВНСММ достоверно снижается. У коров и телок с явно выраженными клиническими признаками нарушений в обмене веществ имеется корреляция между активацией процессов пероксидного окисления липидов, образованием ВНСММ в плазме и сорбцией этих веществ эритроцитами крови.

6. Интоксикация уксусным альдегидом в дозе Уг LD50 способствует усилению процессов пероксидного окисления липидов, активации антиоксидантной системы и повышению уровня ВНСММ в плазме и сорбции этих веществ эритроцитами крови лабораторных крыс.

3.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Успешное развитие животноводства невозможно без изучения особенностей метаболизма сельскохозяйственных животных с помощью современных методов исследований. Выявление отклонений в метаболизме позволит своевременно принимать меры, направленные на ускорение развития адаптационных механизмов, что в конечном счете ведет к увеличению продуктивности животных. По данным многочисленных исследований последних десятилетий в основе многих патологий на субклеточном уровне лежат однотипные механизмы, особую роль среди которых играют процессы пероксидного окисления липидов клеточных мембран [Bablock et al., 1992; Ерохин А. С. и соавт., 1995; Абакумова Ю. В., 1996; Исмагилова Э. Р., 1999; Silert et al., 1999; Цехмистренко С. И., Кононский А. И., 2000; Мурзагулов К. К. и соавт., 2002; Кармолиев Р. Х., 2002 и др.]. Усиленная активация свободнорадикального окисления жирных кислот липидов приводит к изменению состава и структуры клеточных мембран. Нарушается их проницаемость и свойства, вплоть до необратимых повреждений. В литературе имеются данные о целесообразности терапии антиоксидантами, воздействующими на самые ранние стадии нарушения метаболизма, одной из которых является стадия образования свободных радикалов [Мкртумян A.M., 1993; Дунин И. М., Лебенгарц Я. З., 1997; Подколзин А. А. и соавт, 2003; Попова Е., Сокирко Т., 1997; Радионова Т. Н., Панфилова М. Н., 2003]. В связи с этим проблема раннего обнаружения повышенного уровня ПОЛ остается актуальной, так как, отслеживая уровень пероксидации липидов и его корреляцию с состоянием АОС можно корректировать нарушения СРО еще на начальном этапе. Также имеются данные о том, что нарушение обмена веществ характеризуется увеличением содержания в крови ВНСММ. На ранних стадиях нарушений повышение уровня ВНСММ является компенсаторной реакцией организма, при более глубоких нарушениях образуются токсические вещества, в особенности олигопептиды. В то же время, сведения об исследованиях свободнорадикального метаболизма сельскохозяйственных животных малочисленны, отсутствуют данные о состоянии процессов ПОЛ и АОС у КРС в возрастном аспекте и при разных физиологических состояниях, не имеется сведений о сопряжении свободнорадикальных процессов с уровнем ВНСММ в крови. Недостаточная изученность свободнорадикальных процессов и вместе с тем важная их роль в жизнедеятельности организма, определили цель нашей научной работы: выявить особенности процессов ПОЛ и состояния АОС у КРС в постнатальном онтогенезе и при разных физиологических состояниях и их корреляцию с содержанием ВНСММ для совершенствования оценки метаболического статуса животных.

Метод биохемилюминесценции применяется в клинической биохимии для выявления нарушений липидного обмена, воспалительных, инфекционных и онкологических заболевании, также для выявления начальных стадий различных патологий при скрининговых профилактических обследованиях. Этот метод, являясь неспецифическим, не учитывает этиологические и нозологические особенности болезни. Повышение показателя ХЛ сыворотки крови относительно среднестатистического уровня ХЛ здорового организма с учетом возраста на 30−40% свидетельствует о повышении перекисного окисления липидов (ПОЛ), которое может быть связано как с нарушением липидного обмена в организме, так и с воспалительным процессом.

В то же время имеются немногочисленные данные о применении этого метода в ветеринарной медицине.

На первом этапе нашей работы методом биохемилюминесценции был определен интегральный показатель ПОЛ клинически здоровых телок разного возраста и 12-ти месячных телок с признаками нарушенного обмена веществ, а также клинически здоровых коров при разных физиологических состояниях и коров в период раздоя со слабо и явно выраженными признаками нарушенного обмена веществ.

В первые дни жизни животных происходит адаптация организма к кардинальному изменению кислородного режима, что оказывает влияние на уровень свободнорадикальных процессов. При анализе данных показателя ПОЛ в постнатальном онтогенезе установлено, что у клинически здоровых телок от 2−15 суточного до одномесячного возраста интенсивность процессов пероксидации липидов достоверно ниже, чем у животных старших возрастных групп. У 2-х месячных телок отмечено достоверное увеличение показателя интенсивности ПОЛ относительно показателя животных контрольной группы. У телок в возрасте 6−24-х месяцев значения показателя ПОЛ достоверно выше показателя одномесячных телок и между собой достоверно не отличаются. По данным М. И. Рецкого и соавт. (2001) в этот период в крови нарастает уровень свободных жирных кислот, как субстратов энергетического обмена, следовательно, усиливаются и процессы пероксидации. Начиная с 2-х месяцев, как видно из данных значений интегрального показателя ПОЛ свободнорадикальные процессы пероксидации липидов у клинически здорового КРС протекают практически на постоянном уровне. Данные об аналогичных исследованиях в доступной нам литературе отсутствуют, поэтому полученные значения интегрального показателя ПОЛ у телок 624-х месяцев (14,46 16,02 ед/30 с) приняты за норму. Более высокие значения интегрального показателя ПОЛ сыворотки крови телок 2-х месячного возраста и старше по сравнению со значением этого показателя у одномесячных телок по всей вероятности свидетельствует о высокой готовности клеток организма к генерации свободных радикалов. Эти активные формы кислорода выполняют при физиологических концентрациях важные для организма функции (стабилизация липидного состава и структуры мембран клеток, синтез биологически активных веществ, бактерицидные функции клеток). Установленные нами относительно невысокие показатели интенсивности процессов ПОЛ у клинически здоровых телок находится в соответствии с общепринятым суждением о том, что ПОЛ — естественный метаболический процесс, поэтому интенсивность свободнорадикального окисления липидов в норме низкая. При физиологическом уровне пероксидации жирных кислот липидов клеточных мембран активизируются механизмы адаптации к условиям окружающей среды, инициируются биоэнергетические процессы, активируется ряд ферментов [Бурлакова Е.Б. 1980; Sies, 1986 McCord, 1993; Величковский Б. Т., 2001; Абрамченко В. В., 2002].

Интегральный показатель интенсивности ПОЛ в группе клинически здоровых коров в период производства молока колеблется в пределах 15,82+17,48 ед./ЗО с. Достоверного отличия в средних значениях показателя интенсивности пероксидации липидов между коровами контрольной группы и группами начального и заключительного этапов сухостойности и новотельности не выявлено. Полученные результаты свидетельствуют о том, что свободнорадикальные реакции окисления липидов в организме клинически здоровых коров при разных физиологических состояниях протекают практически на постоянном уровне, являются защитным механизмом от воздействия свободных радикалов, а также выполняют функцию регуляторов физико-химических свойств клеточных мембран, неспецифических регуляторов фагоцитоза. [Ignarro, 1972; Н. П. Лысенко, Н. А. Фомичева, 1999; В. Т. Величковский (2001), В. П. Скулачев, 1998 и др.]. Отмеченная нами тенденция к снижению интенсивности процессов ПОЛ у коров при состояниях сухостойности и новотельности, очевидно, может быть объяснена деятельностью адаптационно-компенсаторных механизмов, направленных на подавление процессов пероксидации при этих наиболее напряженных для организма состояниях.

Значения показателя ПОЛ у 12-ти месячных телок с клиническими признаками нарушенного обмена веществ достоверно превышают таковые у клинически здоровых животных аналогичного возраста на 60%. Также значительно увеличивается по сравнению с контролем интегральный показатель интенсивности ПОЛ у коров с нарушенным обменом веществ по сравнению с клинически здоровыми, у коров со слабовыраженными признаками и с явно выраженными признаками нарушенного обмена веществ на 60% и 70% соответственно.

Эти результаты соответствуют данным литературы (Новиков Ю.Х., 1999) о том, что чрезмерная активация процессов ПОЛ является патогенетическим фактором при ряде заболеваний, причем интенсивность свободнорадикальных процессов прямо пропорциональна выраженности патологического процесса. Избыточная продукция свободных радикалов, как показано многочисленными исследованиями отечественных и зарубежных ученых, является общим патогенетическим звеном в механизме воздействия на организм факторов среды и условий жизнедеятельности (ксенобиотики, инфекции, ионизирующее излучение, ультрафиолетовая радиация, гипоксия, физиологическое перенапряжение, стресс, информационная перегрузка и др.). Полученные нами методом биохемилюминесценции данные увеличения интегрального показателя интенсивности ПОЛ у КРС при нарушениях обмена веществ, совпадают с результатами исследования И. З. Севрюк и соавт. (1998), которые установили усиление пероксидации липидов по увеличению содержания МДА у коров с начальной стадией остеомаляции.

Из данных литературы известно, что показатели ПОЛ не всегда объективно отражают свободнорадикальный статус организма [Janero, 1990; Т. Ю. Реброва, 2001; Ю. А. Владимиров 1998; P.P. Фархутдинов, 2000; Е. Е. Дубинина, 2001]. Токсическое действие АФК и их избыточная генерация, приводящая к деструкции липидов мембран, предупреждается за счет функционирования антирадикальных и антипероксидных механизмов, объединенных в универсальную биологическую системуАОС. Эта система представлена ферментативным и неферментативным звеньями, совместным действием которых поддерживается физиологический уровень свободнорадикальных процессов, обеспечивающих неспецифическую резистентность организма. АОС обеспечивает устойчивость организма ко многим факторам, провоцирующим избыточное образование АФК. [Goto et al., 1992; Harris, 1992; Л. А. Тиунов, 1995; T.A. Лисицина и соавт., 1996 Б. Т. Величковский, 2001].

Поскольку избыточная пероксидация липидов мембран предотвращается действием соединений, образующих систему антирадикальной защиты, вторым этапом нашей работы было определение интегрального показателя состояния АОС у КРС в постнатальном онтогенезе и при разных физиологических состояниях. Согласно полученным данным пределы колебаний значения показателя АОС в контрольной группе телок составили 0,155 + 0,199 отн. ед. Значения показателя АОС у телок разного возраста свидетельствует о том, что новорожденные телята имеют самый низкий уровень антиоксидантной защиты. У телят этой возрастной группы показатель АОС колеблется в пределах 0,14К 0,159 отн. ед., что достоверно ниже, чем у одномесячных животных. Полученные данные согласуются с суждением о том, что у новорожденных животных функционирует только ферментативное звено АОС, так как в организме существует дефицит токоферола, ретинола, каротинов и аскорбиновой кислоты. У телят в 2 и 3-х месячном возрасте показатель состояния АОС остается практически на одном уровне и принимает значения 0,21+ 0,22 отн. ед. С 6-и месячного возраста значения показателя АОС достоверно увеличиваются по сравнению с контролем, а между собой достоверно не различаются. Таким образом, система антирадикальной защиты у КРС, как и другие показатели гомеостаза окончательно формируется только к 6-и месяцам, по мере адаптации животного к новым условиям существования.

Интегральный показатель состояния АОС в группе коров в период производства молока колеблется в диапазоне 0,19 + 0,23 отн. ед. В отличие от процессов ПОЛ наблюдается достоверное усиление антиоксидантной защиты у коров при наиболее напряженных для организма состояниях (заключительного этапа сухостойности и новотельности) по сравнению с контрольной группой животных.

В группе 12-ти месячных телок с клиническими признаками нарушенного обмена веществ значение показателя состояния АОС достоверно ниже, чем у клинически здоровых животных аналогичного возраста, в то же время в этой группе животных усиливаются процессы пероксидации липидов. Полученные данные согласуются с гипотезой Е. Н. Кухтина и Н. Н. Глущенко (1996) о регуляции процессов свободнорадикального окисления антиоксидантной системой, согласно которой интенсивность пероксидации липидов контролируется по принципу замкнутого контура с отрицательной обратной связью, что способствует поддержанию ПОЛ на физиологическом уровне.

У коров периода раздоя со слабо выраженными признаками нарушенного обмена веществ показатель состояния АОС проявляет тенденцию к снижению, а у коров с явно выраженными признаками достоверно снижается по сравнению с контролем.

Таким образом, у КРС с признаками нарушенного обмена веществ происходит изменение состояния системы антиоксидантной защиты по сравнению с клинически здоровыми животными. Одновременно, как было указано выше, у животных этих групп показатель пероксидации жирных кислот достоверно увеличивается по сравнению с контролем.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что у животных с нарушенным обменом веществ существует дефицит компонентов системы антирадикальной защиты. Степень выраженности клинических проявлений метаболических нарушений пропорциональна уровню истощения компонентов АОС, роль которых сводится к защите биосубстратов от воздействия активных форм кислорода, и в первую очередь жирных кислот липидов клеточных мембран, от свободнорадикальной деструкции. По мнению многих исследователей, понижение буферной емкости АОС определяет уменьшение адаптивной возможности организма при воздействии токсических и микробных агентов [Е.Б. Бурлакова 1980; В.В., Абрамченко, 2002 и другие]. Данные литературы указывают, что в отличие от других физиологических систем (например, свертывания крови или гормональной) даже непродолжительный сбой в деятельности антиоксидантной системы не происходит безразлично для организма. Истощение системы антирадикальной защиты у животных приводит к более высокой чувствительности организма к окислительному стрессу, по сравнению с клинически здоровыми животными. Возможно, компенсаторно-повышенная активность системы АОС в начальной стадии нарушения обмена веществ в последующем угнетается.

Многочисленными исследованиями доказан неоднозначный характер свободнорадикального окисления в организме [Д.И. Кузьменко, Б. И. Лаптев, 1999; Е. Е. Дубинина, 2001 и другие]. Как показали исследования свободнорадикального метаболизма для разграничения физиологического и патологического СРО могут быть использованы разнообразные показатели уровня активности прооксидантной и антиоксидантной систем. Умеренная интенсивность ПОЛ является условием активации АОС, тем самым уменьшается вероятность развития функциональных расстройств или патологических изменений, тогда как дальнейшая интенсификация ПОЛ приводит к значительному снижению буферной емкости АОС. Дальнейшее нарушение состава и структуры биополимеров приводит к повреждению мембран, изменению состава цитоплазмы и ее структурной организации. В физиологических условиях в организме поддерживается баланс между интенсивностью свободнорадикальных реакций пероксидации биосубстратов и деятельностью антиооксидантной системы, тем самым предотвращается чрезмерная активация ПОЛ и накопление его продуктов — свободных радикалов, пероксидов жирных кислот, липопероксидов, альдегидов, кетонов, оксикислот.

При анализе полученных данных установлено, что у клинически здоровых животных протекание процессов ПОЛ и состояние АОС имеют общие закономерности, поэтому следующим этапом наших исследований стало выявление степени взаимосвязи интенсивности процессов ПОЛ и состояния АОС в организме КРС в постнатальном онтогенезе и при разных физиологических состояниях с помощью статистической обработки результатов. Установлено, что у клинически здоровых телок в возрасте от 2−15 суток до 6 месяцев, а также в 18 месяцев существует достоверная сильная линейная взаимосвязь между интенсивностью процессов ПОЛ и состоянием АОС. В группах животных в возрасте 9, 12, 24 месяцев наблюдается условно-вероятная положительная линейная корреляция между процессами ПОЛ и состоянием АОС, что указывает на высокую сбалансированность процессов пероксидации липидов и антирадикальной защиты у клинически здоровых животных в постнатальном онтогенезе. В то же время у 12-и месячных телок с признаками нарушенного обмена веществ значения показателей ПОЛ и АОС достоверно превышают аналогичные значения клинически здоровых животных того же возраста, коэффициент линейной корреляции Пирсона равен -0,203 (р=0,74). Что свидетельствует о дисбалансе между интенсивностью процессов ПОЛ и состоянием системы антирадикальной защиты.

Следовательно, биохемилюминесцентные интегральные показатели ПОЛ и АОС, отражающие интенсивность свободнорадикальных реакций окисления липидов и состояние антирадикальной защиты, доказывают существование прямой связи между усилением пероксидации липидов и снижением антирадикальной защиты и позволяют своевременно выявлять изменения в соотношении прооксидантной и антиоксидантной систем у животных в любой возрастной группе.

При анализе коэффициента корреляции показателей ПОЛ и АОС клинически здоровых коров установлено, что в группе коров в период раздоя имеется достоверная положительная линейная корреляция между интенсивностью ПОЛ и состоянием системы антирадикальной защиты. У коров при состоянии начального, заключительного этапов сухостойности и новотельности выявлена условно-вероятная положительная взаимосвязь между показателями ПОЛ и АОС. Следовательно, наблюдается высокая степень сбалансированности процессов пероксидации липидов и антирадикальной защиты у клинически здоровых животных независимо от физиологического состояния.

Линейная взаимосвязь между значениями показателей ПОЛ и АОС у коров со слабовыраженными и явно выраженными признаками нарушения обмена веществ практически отсутствует. Эти данные указывают на резкое усиление свободнорадикальных процессов на фоне снижения буферной емкости антиоксидантной системы, а также на разобщение процессов ПОЛ и деятельности АОС. Эти данные могут служить подтверждением состояния оксидативного стресса, при котором происходят нарушения в метаболизме белков, жиров, нуклеиновых кислот, углеводов и в водно-электролитном обмене. Несостоятельность компонентов системы АОС на фоне усиления свободнорадикального окисления липидов является, по мнению акад. Ю. А. Владимирова одной из возможных причин усиления клинических признаков нарушенного обмена веществ. При патологических состояниях образуется так называемый порочный круг: интенсификация процессов ПОЛ на фоне снижения активности антирадикальной защиты приводит к усиленной генерации активных форм кислорода. Следствием этого является нарушение обменных процессов и изменение важнейших физиологических функций организма.

Таким образом, установлена достоверная сильная линейная взаимосвязь между интенсивностью ПОЛ и состоянием АОС у здоровых телок в возрасте от 2−15 суток до 6 месяцев и коров периода раздоя, а также условно-вероятная положительная линейная корреляция этих процессов у телок в возрасте 9, 12, 24 месяцев и коров начального и заключительного этапов сухостойности и новотельности.

Так как нами была обнаружена высокая степень взаимосвязи между показателями пероксидации липидов и состоянием системы антиоксидантной защиты у клинически здоровых телок и коров, было целесообразно рассчитать коэффициент сбалансированности процессов АОС и ПОЛ, который представляет собой отношение интегрального показателя АОС к показателю ПОЛ. Данные исследования показывают, что самые низкие по сравнению с другими возрастными группами, значения КБ у новорожденных телок. У клинически здоровых телок в возрастных группах от 1-го до 3-х месяцев численные значения коэффициента сбалансированности между собой достоверно не различаются. Начиная с 6-ти месяцев, численные значения КБ увеличены по сравнению с контролем. Таким образом, коэффициент сбалансированности АОС/ПОЛ показывает, что по мере адаптации животного к условиям существования дисбаланс между действием факторов, усиливающих свободнорадикальное окисление биосубстратов и деятельностью системы антирадикальной защиты сглаживается. К 6-ти месяцам организм КРС характеризуется достаточно высокой стабильностью исследуемых показателей свободнорадикального метаболизма, вероятно, за счет включения дополнительных адаптационных механизмов, в частности вступает в действие наряду с ферментативным и неферментативное звено АОС, что позволяет поддерживать интенсивность процессов ПОЛ на физиологическом уровне. До 6-месячного возраста коррекцию интенсивности свободнорадикального окисления можно проводить при помощи введения в кормовой рацион веществ, обладающих свойставми антиоксидантов, таких как токоферолы, аскорбиновая кислота, полифенолы растительного происхождения.

У клинически здоровых коров при состояниях раздоя и новотельности значения КБ находятся в диапазоне 1,21 + 1,54 усл. ед. и достоверно не различаются между собой. При состоянии начального и заключительного этапов сухостойности значения КБ достоверно отличаются от КБ коров контрольной группы, что, возможно, связано с тенденцией к снижению интенсивности процессов пероксидации и усилению деятельности АОС при рассматриваемых состояниях. Однако, численные значения КБ у коров при разных физиологических состояниях находится в диапазоне 1,21+ 1,83 усл.ед., что свидетельствует о высокой степени сбалансированности пероксидных процессов и деятельности всех звеньев системы антирадикальной защиты, у клинически здоровых коров независимо от физиологического состояния.

В то же время у КРС с клиническими признаками нарушенного обмена веществ значения КБ достоверно отличается от аналогичного показателя здоровых животных. Так, у 12-ти месячных телок с клиническими признаками нарушенного метаболизма значение КБ составляет 55% от КБ клинически здоровых животных и колеблется в диапазоне 0,66, + 0,78усл. ед.

У коров со слабовыраженными и явно выраженными признаками нарушения обмена веществ КБ принимает значения достоверно ниже, чем КБ клинически здоровых коров на 39,7% и 48,4% соответственно (рис. 34).

Уменьшение величины КБ по сравнению с нормой свидетельствует о дисбалансе между процессами ПОЛ и антирадикальной защитой, то есть о возникновении состояния окислительного стресса у животных. Степень дисбаланса в системе ПОЛ-АОС выражена гораздо сильнее у животных с явно выраженными признаками нарушенного обмена. В условиях нарушенного обмена веществ значение КБ тем ниже, чем в большей степени активируются процессы пероксидации липидов и снижается активность компонентов антиоксидантной системы.

120 100 80 60 40 20 0 * т.

ПН 1 1.

Рис. 33. Коэффициент сбалансированности ПОЛ и АОС коров:

1 — клинически здоровые, 2- со слабо выраженными признаками, 3- с явно выраженными признаками нарушенного обмена веществ. Примечание:*- достоверность различий по сравнению с контролем (р<0,05).

Таким образом, интегральные показатели XJI, характеризующие интенсивность ПОЛ и состояние АОС и их корреляции с одной стороны позволяет прогнозировать возможную патологию, а, с другой — проводить своевременную профилактику антиоксид антами. Величина КБ дает достоверные представления о состоянии системы равновесия ПОЛ/АОС, позволяет выявить выраженность смещения баланса между действием прооксидантных и антиоксидантных факторов и может служить способом лабораторной диагностики отклонений в метаболизме у КРС.

В последние годы в клинической биохимии для оценки тяжести интоксикации предложен ряд методов, основанных на определении содержания в биологических средах ВНСММ. В то же время ряд исследователей полагают, что чрезмерная пероксидация ненасыщенных жирных кислот липидов мембран клеток при низкой активности системы антиоксидантной защиты способствует увеличению уровня ВНСММ в крови. [З.А. Туликова, 1983; В. И. Гудим, Н. К. Габриэлян, 1985]. Для установления возможной взаимосвязи между интенсивностью ПОЛ, активностью АОС и содержанием ВНСММ в крови нами был изучен ряд корреляционных взаимоотношений между показателями состояния ПОЛ, АОС и ВНСММ в сыворотке и плазме крови КРС.

Нами установлено, что уровень ВНСММ в плазме крови телок в возрасте 2−15 суток достоверно отличается от контроля. Начиная с 2-х месяцев, уровень ВНСММ в плазме не различается по сравнению с контролем.

Уровень этих соединений в эритроцитах достоверно выше у новорожденных телок по сравнению с контролем. У телок в возрасте от 1-го до 3-х месяцев содержание ВНСММ в эритроцитах практически не изменяется. Начиная с 6-ти месячного возраста, содержание ВНСММ достоверно повышается по отношению к контролю и находится на стационарном, характерном для взрослых животных уровне у телок 9-ти, 12-ти и 24-хмесяцев. В целом, при анализе данных о содержании ВНСММ в плазме и эритроцитах крови телок в разные возрастные периоды выявлено, что концентрация этих соединений и в плазме и в эритроцитах крови стабилизируется к 6-ти месячному возрасту.

В то же время у 12-и месячных телок с клиническими признаками нарушенного обмена веществ содержание ВНСММ и в плазме крови и в эритроцитах достоверно повышается по сравнению с уровнем ВНСММ клинически здоровых животных аналогичного возраста. Выявлена взаимосвязь между интенсивностью процессов ПОЛ, состоянием АОС и содержанием ВНСММ в плазме и эритроцитах крови телок с клиническими признаками нарушенного обмена веществ. Установлено, что существует вероятная положительная линейная корреляция между показателем содержания ВНСММ плазмы и показателем процессов ПОЛ, а также между показателем содержания ВНСММ плазмы и показателем состояния АОС, в то же время между показателем ВНСММ эритроцитов и ПОЛ и показателем ВНСММ эритроцитов и АОС обнаруживается условно-вероятная положительная линейная корреляция. Эти данные позволили предположить, что с помощью интегрального метода определения уровня ВНСММ и интенсивности процессов ПОЛ и АОС, можно своевременно выявлять состояние интоксикации и оксидативного стресса с целью их коррекции.

Содержание ВНСММ в плазме крови клинически здоровых коров л периода раздоя колеблется в диапазоне 4,9 + 5,3 усл.ед.. У животных начального этапа сухостойности уровень ВНСММ практически не изменяется, а у коров заключительного этапа сухостойности достоверно снижается. При состоянии новотельности происходит увеличение содержания ВНСММ, но не достигает величин у животных периода раздоя. Содержание ВНСММ в эритроцитах крови коров периода раздоя находится в диапазоне 14,9 ^ 15,3 усл.ед.2. Так же как и в плазме при состоянии начального этапа сухостойности уровень ВНСММ практически не изменяется по сравнению с контролем. На заключительном этапе сухостойности содержание ВНСММ в эритроцитах достоверно снижается. Для периода новотельности характерна тенденция к увеличению содержания ВНСММ, у коров этой группы содержание ВНСММ достоверно отличается от контроля.

В группе коров со слабо выраженными признаками нарушенного обмена веществ содержание ВНСММ в плазме достоверно снижается, а в эритроцитах повышается по сравнению с контролем. В группе коров с ярко выраженными отклонениями в обмене веществ уровень ВНСММ достоверно повышается и в плазме, и в эритроцитах крови по отношению к контролю. Следовательно, уровень ВНСММ, и в плазме и эритроцитах крови в периоды раздоя и начального этапа сухостойности практически не изменяется, в то же время достоверно снижается в периоды заключительного этапа сухостойности и новотельности. Полученные данные согласуются с ранее установленными результатами [И.П. Степанова и соавт., 2001, 2003]. Возможно, уменьшение содержания.

ВНСММ вызвано повышенной потребностью организма в изучаемые периоды в таких важнейших соединениях как окисленные и восстановленные пиридиновые коферменты дегидрогеназ (НАД НАДФ-Н), нуклеозид-5-фосфаты, глутатион, необходимых для анаболических процессов и процессов детоксикации. По данным М. Я. Малаховой (1995) вышеуказанные вещества поглощают ультрафиолетовые лучи в исследуемом диапазоне длин волн.

У коров с клиническими признаками нарушенного обмена веществ установлена взаимосвязь между интенсификацией свободнорадикальных реакций и содержанием ВНСММ в крови. У коров со слабовыраженными признаками нарушенного обмена веществ установлена условно-вероятная положительная корреляция уровня ВНСММ в эритроцитах и активации процессов пероксидации липидов. У коров с явно выраженными признаками существует вероятная положительная корреляция уровня ВНСММ с активацией свободнорадикальных процессов, как в плазме, так и в эритроцитах крови. В то же время у коров этих групп отсутствует линейная взаимосвязь между содержанием ВНСММ в крови и показателем состояния АОС. Полученные данные указывают на то, что в организме коров с клиническими признаками нарушений в обмене веществ существует взаимосвязь между усиленным синтезом ВНСММ в плазме и активацией процессов ПОЛ, но одновременно наблюдается дисбаланс в деятельности прооксидантной и антиоксидантной систем. Это согласуется с данными литературы, о том, что увеличение содержания ВНСММ сопровождается изменением проницаемости клеточных мембран, нарушением тканевого дыхания. Чрезмерная пероксидация липидов и истощение АОС предшествует нарушению катаболизма пуриновых, пиримидиновых оснований и белков. Выявленный дисбаланс в состоянии ПОЛ/АОС у КРС с признаками нарушенного метаболизма и корреляция усиления процессов пероксидации липидов с содержанием ВНСММ в крови обуславливает необходимость применения данных показателей в качестве возможного критерия оценки степени выраженности нарушений.

Таким образом, при современном уровне технологии ведения животноводства, для повышения резистентности необходимо изыскание биологических резервов организма. Этому может способствовать оптимизация процесса обследования животных с помощью хемилюминесцентного метода определения интенсивности ПОЛ и состояния АОС и интегрального метода определения содержания ВНСММ. Выявленные закономерности рекомендуется использовать на практике. Так, при обнаруженных метаболических нарушениях у коров при помощи интегрального метода, основанного на определении содержания ВНСММ, необходимо дополнительно оценить интенсивность процессов ПОЛ и состояние антирадикальной защиты для выбора патогенетически обоснованных методов коррекции сдвигов в обмене веществ животных.

В литературе имеются данные о том, что одной из возможных причин нарушения баланса между интенсивностью ПОЛ и состоянием АОС является избыточная концентрация ацетальдегида (Corrazzi et al., 1980; Mantle et al. 1999; Feihman et al., 1999), который является естественным метаболитом. До настоящего времени роль эндогенного ацетальдегида в метаболизме окончательно не установлена. Существует гипотеза, что свободные радикалы могут образовываться при метаболизме ацетальдегида, а это приводит к накоплению в организме продуктов ПОЛ и развитию эндогенной интоксикации [Takahashi et al., 1994]. L. Feihman et al. (1999) считают, что ацетальдегид нарушает механизмы антиоксидантной защиты. В связи с вышеизложенным, представлялось интересным изучить влияние экзогенного ацетальдегида на показатели интенсивности ПОЛ и АОС, а также на систему детоксикации, состояние которой определяется содержанием ВНСММ в крови.

В эксперименте на белых крысах показано, что уже через полчаса после введения ацетальдегида наблюдается достоверное повышение содержания ВНСММ в эритроцитах крови, которое сохраняется в течение 4-х часов после введения токсического агента. Через 6 часов после интоксикации ацетальдегидом содержание ВНСММ в эритроцитах крови белых крыс возвращается к норме.

Статистическая обработка результатов выявила наличие положительной линейной корреляции в динамике между содержанием ВНСММ в плазме и эритроцитах. В первые 6 часов после интрагастрального введения ацетальдегида у крыс активируются процессы накопления ВНСММ в плазме и сорбции этих соединений эритроцитами крови. К 12 часам после токсического воздействия ацетальдегида метаболические процессы в крови животных нормализуются. Поскольку повышение содержания ВНСММ в крови белых крыс после введения ацетальдегида является кратковременным, этот процесс, следует рассматривать как проявление общего адаптационного синдрома.

Изучение состояния процессов ПОЛ при ацетальдегидной интоксикации выявило, что у интактной группы крыс показатель ПОЛ в сыворотке крови колеблется в диапазоне 10,35 + 11,53 ед./ 30 сек. После ингастрального введения крысам ацетальдегида в дозе lA LD50 наблюдается активизация свободнорадикальных процессов пероксидации липидов в первые шесть часов, причем достоверное изменение показателя ПОЛ наблюдается уже через 0,5 часа. Через 12 часов после воздействия токсического агента интенсивность пероксидации липидов начинает снижаться, но остается достоверно высокой по сравнению с контролем. Через 24 часа после ацетальдегидной интоксикации практически происходит нормализация процессов ПОЛ.

У контрольной группы белых крыс среднее значение показателя состояния АОС колеблется в диапазоне 0,12 + 0,16 отн. ед. Мобилизация компонентов антирадикальной защиты обнаруживается только через 1 час после того, как крысам ввели ацетальдегид. Через 4 часа отмечается достоверное усиление антирадикальной защиты, которое сохраняется еще 2 часа. К 12 часам после воздействия токсическим агентом наблюдается нормализация антиоксидантной активности сыворотки крови белых крыс, которая сохраняется до конца эксперимента.

В целом результаты эксперимента показывают, что в первые 6 часов после интоксикации ацетальдегидом усиливаются процессы свободно-радикальной пероксидации ненасыщенных жирных кислот и активируется антиоксидантная система, причем максимальные изменения приходятся на 4 и 6 часов, а в последующем свободнорадикальные процессы нормализуются и их интенсивность не изменяется до конца эксперимента.

Изучение линейных взаимосвязей между процессами ПОЛ и состоянием АОС крыс после интоксикации уксусным альдегидом выявило, что характер изменений является аналогичным. Также обнаружена линейная взаимосвязь между показателем, характеризующим ПОЛ, и содержанием ВНСММ плазмы и эритроцитов. Обнаружена линейная корреляция между показателем антиоксидантной активности сыворотки крови и содержанием соединений низкой и средней молекулярной массы плазмы и эритроцитов крови. Обнаруженный дисбаланс в действии прои антиоксидантных факторов и их взаимосвязь с усиленной наработкой ВНСММ в первые часы после воздействия на организм крыс ацетальдегида свидетельствует о раннем вовлечении свободнорадикальных процессов в патогенетические механизмы интоксикации. Результаты проведенного эксперимента согласуются с данными литературы о том, что при воздействии эндогенных факторов организм мобилизует «программы адаптивного поведения», конечная цель которых — повысить резистентность организма к раздражителям. Такое приспособление связано с развитием комплекса защитных биохимических реакций, с участием многих ферментов, в том числе протеаз и ферментов системы антиоксидантной защиты [Кузьмина Л.П., Тарасова Л. А., 2000].

Полученные результаты указывают на то, что с помощью метода биохемилюминесценции возможно оценить интенсивность ПОЛ и состояние АОС и своевременно выявить дисбаланс между активацией процессов свободнорадикального окисления и мобилизацией антиоксидантной защиты в организме животных. В результате эксперимента на белых крысах выявлено, что при ацетальдегидной интоксикации в организме этих животных имеется взаимосвязь между активацией процессов ПОЛ, состоянием АОС, усиленным образованием ВНСММ в плазме и сорбцией этих веществ эритроцитами крови. Эти данные могут иметь значение для дальнейшей расшифровки механизмов развития эндогенной интоксикации.

Подводя итог вышесказанному следует отметить, что контроль над состоянием здоровья и продуктивностью животных необходимо осуществлять путем диспансеризации с обязательным проведением лабораторной диагностики наиболее распространенных болезней животных, связанных с нарушением обмена веществ. Наиболее обоснованными на наш взгляд при биохимическом мониторинге являются показатели состяния ПОЛ, АОС и уровень ВНСММ.

Изначально этиологический фактор независимо от своей природы и происхождения вызывает в организме повышенное образование активных форм кислорода, что приводит к интенсификации процессов ПОЛ. В результате длительной пероксидации липидов возникают структурно-функциональные изменения в клетках, в первую очередь, интенсивно функционирующих и повреждаемых этиологическим фактором тканей, органов, физиологических систем. Возможные нарушения предотвращаются за счет функционирования АОС, которая рассматривается как универсальная биологическая система естественной детоксикации. Разобщение в организме процессов пероксидации липидов и антирадикальной защиты приводит к состоянию оксидативного стресса.

Повышение значений показателей ПОЛ и АОС от 30+40 до 200+300% относительно референтных величин (с учетом возраста и физиологического состояния) свидетельствует об активации свободнорадикальных реакций липидов, которая может быть связана как с нарушением липидного обмена (гипо-, гипер-, дислипопротеинемия) в организме, так и с воспалительным процессом или инфекционным заболеванием. Поэтому при выявленном дисбалансе интенсивности свободнорадикальных реакций липидов и состояния АОС необходимо определить содержание общих липидов сыворотки крови для исключения липидных нарушений. При нормолипопротеинемии рекомендуется провести общий анализ крови для подтверждения наличия воспалительного процесса. С целью выявления конкретного воспалительного процесса следует провести, например, ряд определений ферментов, активность которых меняется более дифференцированно. Так, активность щелочной фосфатазы изменяется при заболеваниях печени и костной патологии, а-амилазы или липазы — при панкреатите и т. д.

Понижение значений показателей ПОЛ и АОС более чем в 2 раза относительно референтных величин (с учетом возраста и физиологического состояния) свидетельствует либо об анемии, либо о наличии злокачественного образования.

Эффективность хемилюминесцентных показателей ПОЛ и АОС определяется высокой чувствительностью на наличие предпатологического состояния. Если значения показателя находятся в диапазоне значений нормы, можно однозначно говорить об отсутствии в организме патологии и/или предпатологического состояния, что невозможно на одном анализе ни при каких других формах обследования.

Уровень соединений низкой и средней молекулярной массы в крови в норме невелик и строго контролируется организмом. Интенсификация процессов ПОЛ приводит к повышению содержания ВНСММ, являющихся продуктами протеолиза.

Понижение показателя ВНСММ свидетельствует об использовании организмом не только питательных компонентов корма, но и запасов собственных тканей, в частности, таких важнейших соединений низкой и средней молекулярной массы как пиридиновые коферменты, пентозо-5-фосфаты, глутатион и ряд других пептидов, необходимых для процессов синтеза и детоксикации.

Эффективность показателей уровня ВНСММ, состояния ПОЛ и АОС определяется тем, что он позволяет объективно в целом оценить метаболический статус КРС, главным образом белковый и свободнорадикальный, без привлечения общепринятых показателей белкового и липидного обмена.

Одним из звеньев профилактики болезней является введение в соответствующие технологии животноводства, в качестве обязательного, наиболее полного обеспечения потребности животных в антиоксидантах, биологически активных веществ, обладающих антиоксидантными свойствами (витамины Е, С, А, -каротин, медь, цинк, селен и другие микроэлементы, серосодержащие аминокислоты, обеспечивающих наиболее оптимальные условия для синтеза глутатиона). Дозы антиоксидантов должны быть более высокими в рационах молодняка до 6 месяцев, поскольку, согласно нашим исследованиям, антирадикальная защита окончательно формируется у КРС только к этому возрасту. Коровы при наиболее напряженных физиологических состояниях (сухостойности и новотельности) также нуждаются в повышенных концентрациях антиоксидантов, так как в этот период мобилизуется система АОС.

При выявленном дисбалансе в функционировании прои антиоксидантной систем в организме КРС независимо от этиологических и нозологических особенностей болезни следует использовать фармакологические антиоксиданты.

Активация свободнорадикального окисления вызывает перестройку нейроэндокринного звена. Формируется стресс-реакция со своими негативными последствиями, поэтому желательным представляется использование фармакологических адаптогенов — стресс-корректоров.

Одним из отрицательных последствий оксидативного стресса и стрессовой нейрогормональной перестройки является накопление в организме токсических продуктов пероксидации липидов, токсических олигопептидов, аутоантигенов, мобилизация и повышенный расход факторов неспецифической резистентности клеточного и гуморального звеньев. В результате еще до возникновения нозологически дифференцируемой патологии возникает иммунодефицитное состояние. Поэтому одним из звеньев профилактики болезней животных в условиях повышенной стрессовой нагрузки является введение в технологии применение фармакологических иммуномодуляторов. Звеном профилактики болезней является введение в рацион коров в периоды сухостойности и новотельности биологически активных веществ низкой и средней молекулярной массы, таких как рибозо-5-фосфат, синтетические олигопептиды, так как у животных при этих состояниях выявлено пониженное содержание ВНСММ.

Активация пероксидации липидов приводит к повышенному содержанию соединений низкой и средней молекулярной массы, в том числе токсичных олигопептидов. В связи с отсутствием их иммуногенности, механизм детоксикации гидрофобных олигопептидов представляет собой сорбцию токсинов альбуминами и липопротеинами низкой плотности. Поэтому при повышенном содержании ВНСММ и снижении связывающей способности альбуминов одним из звеньев профилактики является использование энтеросорбентов.

Таким образом, интегральные показатели ПОЛ и АОС целесообразно использовать для своевременного выявления преди патологического состояния у КРС, связанного с нарушением свободнорадикального метаболизма, и для решения вопроса о включении в комплексную терапию фармакологических антиоксидантов, стресс-корректоров и иммуномодуляторов. Затем с помощью интегрального показателя ВНСММ следует выявить наличие в организме токсичных веществ, в том числе, олигопептидов. При наличии патологии интегральные показатели должны использоваться с показателями, дифференцированно отражающие определенную патологию.