Повышение разрешающей способности и информативности хромосомного анализа растений

Цитогенетика — наука, изучающая связь структуры хромосом с функционированием генома, зародилась в конце 19-го начале 20-веков. Началом цитогенетики стало соотнесение описаний митоза с наследованием фенотипических признаков и повторное открытие законов Менделя. С момента осознания того, что хромосомы являются теми структурами, в которых сохраняется наследственная информация, интерес изучения хромосом в первую очередь связан именно с поиском отражения наблюдаемых генетических явлений на клеточном уровне.

Как и в большинстве отраслей науки, развитие цитогенетики тесно связано с методическими достижениями. Развитие хромосомного анализа шло по нескольких направлениям. Изначально, доступными для изучения были только наиболее крупные хромосомы: политенные, типа ламповых щеток, мийотические. С развитием микроскопии стали доступны для анализа митотические хромосомысначала наиболее крупные растительные, потом хромосомы человека, как наиболее важного объекта. Увеличение видового состава объектов, чьи хромосомы могут изучаться, улучшение визуального качества хромосомных препаратов было лишь первым этапом. Далее наступил этап целенаправленных воздействий на хромосомные препараты с целью визуализации возможно большего количества структурных и функциональных различий. Вначале это были эмпирические воздействия, приводящие к выявлению на хромосомах некоего рисунка, позволяющего повысить разрешение метода (дифференциальные окраски). Впоследствии возникли методы гибридизации in situ, впрямую связавшие хромосомный анализ и молекулярную биологию. Сила хромосомного анализа ярко проявилась в том, что он позволил составлять генетические карты, связанные с конкретными хромосомами еще до открытия того, в какой именно химической форме заключена генетическая информация.

Развитие молекулярных методов в конце 20 века не привело к исчезновению цитогенетики, напротив, с внесением методов молекулярной биологии она приобрела новое значение. Поскольку с одной стороны повысилась разрешающая способность методов, с другой стороны пришло осознание того, что для понимания функционирования генов в клетке необходимо знание не только нуклеотидной последовательности конкретного гена, но и функциональной структуры клеточного ядра в целом.

Общий объём научных работ выполненных на хромосомах животных значительно превышает число работ по изучению хромосом растений. В первую очередь это связано с приоритетным изучением хромосом человека, кроме того, существенным является наличие многих методических трудностей работы с хромосомами растений. Препараты хромосом растений труднее приготовить, так как растительные клетки защищены прочной клеточной стенкой. Препараты хромосом растений труднее изучать, так как значительное число растений, в том числе и такие хозяйственно важные как рис и лён, имеют хромосомы относительно небольшого размера, и методы дифференциальной окраски, пригодные для изучения крупных хромосом злаков, не дают достаточно информации даже для идентификации хромосом. Методы физического картирования хромосом на основе флуоресцентной гибридизации in situ в случае изучения хромосом растений работают плохо, в связи с обилием в растительном геноме разнообразных ДНК повторов.

Однако интерес к молекулярной биологии растений последнее время неуклонно возрастает. Человечество вынуждено ускорять методы селекции сельскохозяйственных растений, поскольку именно с этим связана возможность дальнейшего развития цивилизации в условиях увеличивающегося населения земли, ухудшающейся экологии и ограничения площадей, пригодных для посева. Возрастает потребность в цитогенетическом анализе растений, который стал неотъемлемой частью генетики и молекулярной биологии. С этим связано непрекращающееся совершенствование методов хромосомного анализа. Особый интерес представляет попытка расширения возможностей хромосомного анализа за счёт разработки методов анализа мелких хромосом. Очевидным путем решения этой проблемы является увеличение физического размера хромосом на препарате и применение новых методов компьютеризованного видеоанализа. Было решено попробовать уменьшить степень спирализации хромосом с помощью различных интеркаляторов, которые зарекомендовали себя в работах на хромосомах человека. Для увеличения числа видимых деталей решили повысить контрастность изображения, применяя монохроматическое освещение с помощью интерференционных светофильтров и новых сверхярких светодиодов. Помимо этого представлялось важным сделать наблюдения и исследования хромосом по возможности более объективными за счет применения цифровой техники и новых методов видеоанализа.

Большое значение флуоресцентных методов дифференциального окрашивания хромосом в современных технологиях хромосомного анализа побудило на поиски среди новых димерных бис-бензимидазолов ДНК специфичных красителей дающих более контрастный, по сравнению с красителями использующимися в настоящее время, рисунок дифференциального окрашивания.

ВЫВОДЫ.

1. На хромосомных препаратах, полученных с применением 9-аминоакридина, количество метафазных пластинок с длинными хромосомами значительно увеличивается, и на хромосомах выявляется существенно больше дифференциально окрашиваемых районов. Только использование 9-аминоакридина позволило идентифицировать очень мелкие хромосомы льна.

2. При окрашивании ацетоорсеином хромосом растений, обработанных 9-аминоакридином, выявляется высокоразрешающий рисунок, сходный с G-окраской хромосом животных. Получаемый рисунок воспроизводим и специфичен для индивидуальных хромосом. В отличие от С-окраски, наиболее часто используемой для дифференциальной окраски хромосом растений, эта методика является более щадящей для ДНК, что открывает потенциальные возможности её применения совместно с микродиссекцией хромосом и последующим анализом полученных фрагментов ДНК.

3. Рисунки С-окрашенных хромосом растений, полученные с использованием 9-аминоакридина, достаточно воспроизводимы как для идентификации хромосом, так и для сравнительных внутривидовых и межвидовых исследований.

4. Использование 9-аминоакридина позволило провести цитогенетические исследования: а) изучение внутригеномного полиморфизма по рисункам Си G-подобной окрасок трёх сортов ромашки Matricaria chamomilla L. б) сравнение по рисункам С-окраски геномов двух родственных видов льна австрийского Linum austriacum L. (2п=18) и льна крупноцветкового L. grandiflorum Desf. (2n=16). в) изучение внутригеномного полиморфизма по рисункам С-окраски трёх образцов льна обыкновенного Linum usitatissimum L. (2п=30): льна обыкновенного дикорастущиего, льна долгунца L. usitatissimum var. usitatissimum К-603 и льна масличного L. usitatissimum var. humile (Mill) K-594. г) сравнение геномов по рисункам С-окраски трёх близкородственных видов льнов: льна обыкновенного L. usitatissimum L. сорт льна-долгунца Оршанский 2 (2п=30), льна узколистного Linum angustifolium (Huds.) (2п=30) и льна двулетнего Linum bienne Mill. (2n=30), а также межвидовых гибридов: L. usitatissimum сорт Оршанский 2×1 bienne Mill. L. usitatissimum сорт Оршанский 2 x L. angustifolium (Huds.). д) кариотипирование Zingeria biebersteiniana (Claus) P. Smirnov по рисункам Си G-подобной окрасок.

5. Предложена схема светодиодного осветителя микроскопа, позволяющая в режиме реального времени изменять спектр освещения препарата для получения максимального контраста изображения.

6. Для флуоресцентной дифференциальной окраски хромосом человека и растений предложены два новых ДНК-специфичных флуоресцентных соединения — димерные бис-бензимидазолы DB (8) и DB (17). При окрашивании данными красителями хромосом человека контраст рисунка дифференциального окрашивания выше, чем при использовании DAPI и Hoechst 33 258. Эти красители могут быть использованы вместо DAPI и Hoechst 33 258 в стандартных методиках флуоресцентной микроскопии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Развитие методов молекулярной биологии существенно расширило комплекс методических походов и инструментарий для анализа хромосом. С помощью флуоресцентной гибридизации in situ можно изучать распределение на хромосомах индивидуальных последовательностей ДНК, уникальных или повторяющихся, или сравнивать распределение большого числа последовательностей, составляющих геномы. Однако применение методов FISH для анализа видов растений с мелкими хромосомами требует решения трудностей, связанных именно с малыми размерами хромосом.

Малый размер хромосом (менее 5 мкм) и особенно малый размер сегментов рисунка дифференциальной окраски побуждает к возможно полному использованию возможностей микроскопа, ПЗС камеры и усовершенствованию методов приготовления хромосомных препаратов. Затрудняет анализ мелких хромосом и тот факт, что рисунок их С-окраски, одного из самых распространенных методов идентификации хромосом растений, состоит из очень малого числа деталей.

Основной целью нашей работы была попытка разработки такой методики приготовления препаратов хромосом, которая бы позволила получать удлиненные, по сравнению с приготовленными по стандартной методике, хромосомы. Длина хромосом на препарате зависит от стадии митоза, на которой были фиксированы клетки, из которых готовятся препараты. Чаще для получения удлинённых хромосом с низкой конденсацией добиваются синхронизации клеток, блокируя прохождение клеточного цикла в S-фазе. Снятие блока и фиксация клеток в момент прохождения ими поздней профазы и ранней метафазы позволяет получить препараты с профазными или митотическими хромосомами. Ограничением на использование данного подхода является необходимость точного знания продолжительности клеточного цикла, без чего требуется фиксировать значительное число образцов клеток через разные интервалы времени. В нашей работе мы развивали второй подход синхронизации клеток, основанный на частичном блокировании прохождения митоза. Традиционно для задержки прохождения митоза используются агенты, блокирующие образования веретена деления, однако таким образом удается получить сильно компактизованные хромосомы, что не приемлемо для мелких хромосом. Использование интеркаляторов ДНК позволяет задержать процесс компактизации хромосомы. Мы получили значительно удлинённые хромосомы на препаратах, приготовленных из клеток обработанных этидием и 9-аминоакридином. Предложенный нами 9-аминоакридин показал большую, в сравнении с этидием, эффективность в приготовлении удлинённых хромосом. Он действовал в меньших концентрациях, и после обработки им удавалось получать более контрастные, чем при действии этидия, рисунки С-окраски. Наряду с тем, что удалось контролируемо получать препараты удлиненных хромосом, обнаружилось, что на хромосомах, удлиненных под действием интеркаляторов ДНК при их окрашивании адетоорсеином, выявляется рисунок поперечной исчерченности сходный с рисунком G-окраски животных. Рисунок такой окраски содержит значительно больше деталей по сравнению с рисунком С-окраски, что открывает дополнительные возможности для идентификации гомологичных хромосом и их районов.

Однако действие интеркаляторов ДНК не приурочено к какой либо конкретной стадии митоза, как в случае ингибиторов образования веретена деления, это приводит к вариабельности длин хромосом. В связи с широким диапазоном длин хромосом возникли опасения, что использование данного метода для сравнительного анализа С-дифференциально окрашенных хромосом окажется не возможно. Для решения вопроса о границах и условиях применимости анализа хромосом удлиненных действием интеркалятора ДНК было проведена оценка связи вариабельности рисунка С-окраски с изменением длины хромосом. Традиционно вариабельность С-окраски считается очень низкой, поскольку выявляемые этим методом сегменты гетерохроматина остаются конденсированными на протяжении большей части клеточного цикла. Малые изменения степени конденсации гетерохроматина и естественная выравненность по длине метафазных хромосом объясняют высокую стабильность рисунка С-окраски. В нашей работе мы столкнулись со значительно большими различиями в размерах наблюдаемых хромосом (более чем пятикратное отличие гомологичных хромосом разной степени компактизации). Как показало исследование, даже при таком большом разбросе длины хромосом, рисунок С-окраски хорошо воспроизводится. При этом сохраняется и возможность количественного сравнения величины С-сегментов хромосом. Но поскольку на самых длинных и самых коротких хромосомах рисунок С-окраски имел заметные отличия от наблюдаемого на хромосомах средней степени компактизации следует внимательно подходить к отбору метафазных пластинок для анализа.

Можно рекомендовать во время предварительного визуального анализа, основываясь на морфологии и рисунке окраски хромосом, выбрать ту стадию конденсации хромосом, которая наиболее соответствуют конкретной задаче. Далее отбирать для анализа хромосомные пластинки соответствующие выбранной степени конденсации. Так, например, часто хромосомы из пластинок с наименьшей компактизацей не имеют видимых концов, и, в большинстве случаев, такие пластинки не стоит использовать в анализе, поскольку трудно определить фактическую длину хромосомы.

Однако в случае если интерес представляют прителомерные области, а анализ проводится с использованием методов FISH, наименее компактизованные хромосомы могут представлять больший интерес, чем среднекомпактизованные.

Корреляция содержания гетерохроматина, выявляемого С-окраской, измеряемого в препаратах интерфазных ядер и метафазных хромосомах позволяет использовать измерение площади гетерохроматина в С-окрашенных ядрах как метод экспресс оценки геномов растений. Особенно видов содержащих много мелких хромосом, анализ хромосом которых особенно труден.

Проведённые исследования ряда модельных видов подтверждают эффективность обработки 9-аминоакридином для кариологических исследований растений. Использования 9-аминоакридина впервые позволило провести кариологический анализ на основе С-окраски видов и сортов льна. Даже для видов с относительно крупными хромосомами (ромашка) использование 9-аминоакридина увеличивает информативность анализа С-окраски хромосом.

Рисунок выявляемый ацетоорсеином на хромосомах обработанных 9-аминоакридином содержит значительно больше деталей, в сравнении с рисунком С-окраски. Это позволит увеличить точность локализации нуклеотидный последовательностей методами гибридизации in situ.

Следующим направлением оптимизации анализа мелких хромосом растений является использование компьютеризированной системы регистрации и анализа хромосом. Если на этапе регистрации изображений не учтены факторы, относящиеся к выбору ПЗС камеры, её установке на микроскопе и установкам микроскопа, то получаемые изображения могут оказаться не пригодными для анализа.

Существуют возможности установки на микроскопы потребительских видеокамер и цифровых фотоаппаратов. Но для регистрации изображений мелких объектов, размеры которых находятся на пределе разрешения оптического микроскопа, рекомендуется устанавливать камеры, разработанные специально для использования в составе микроскопической установки. При разработке таких камер учитываются параметры оптической схемы микроскопа. При изготовлении используются ПЗС матрицы с лучшими электронно-оптическими характеристиками и высококачественные аналогово-цифровые преобразователи. Кроме того, потребительская видеои фототехника рассчитана на получение цветного изображения. В большинстве случаев цветное изображение получается одной монохромной ПЗС матрицей на поверхность, которой нанесена матрица светофильтров. Над каждым светочувствительным элементов ПЗС матрицы размещён один из трёх светофильтров: красный, зелёный или синий. Значение яркости недостающих цветов в каждой точке изображения получается аппроксимацией значений в соседних элементах. Таким образом, наблюдается снижение светочувствительности камеры, поскольку через светофильтр до светочувствительного элемента доходит только часть света, и снижение оптического разрешения, поскольку реальные измерения яркости каждого цвета производятся элементами разделёнными элементами дополняющих цветов. Рекомендовать такой метод получения цветных изображений можно только для ярких объектов с относительно крупными деталями, в качестве примера такого объекта можно привести гистологические препараты, окрашенные иммунохимическими или химическими методами.

Для регистрации изображений мелких деталей изображения и объектов низкой яркости рекомендуется использовать монохромные ПЗС камеры. Для полного использования разрешающей способности микроскопа, при установке ПЗС камеры на микроскоп необходимо согласовать размер светочувствительно элемента ПЗС матрицы и оптическое увеличение микроскопа. Оптическое разрешение микроскопа в поле объекта по критерию Релея описывается формулой d=0,61*X/NA, где d минимальное разрешаемое расстояние, X длина волны света формирующего изображение, NA числовая апертура микроскопического объектива. Для того чтобы были разрешены два точечных объекта, между изображениями этих объектов на ПЗС матрице должен быть по крайней мере один светочувствительный элемент. Таким образом для того чтобы регистрировать с помощью ПЗС камеры изображения с максимально возможным пространственным разрешением микроскопа нужно, чтобы было реализовано равенство.

0,61 *X/NA. 61) *Увеличение=2*размерсветочувствительногоэлемента.

Для случая формирования изображения зелёным светом с длиной волны 550 нм, использования объектива с численной апертурой 1,4 и использования ПЗС камеры с размером светочувствительного элемента 4,65 мкм оптимальным было бы примерно 40 кратное увеличение. Использование нами объективов 63Х и 100Х объясняется двумя факторами. Поскольку разрешение микроскопа определяется в первую очередь апертурой объектива, то использовались объективы с максимальной апертурой. Максимальная апертура реализуется в планапохроматических объективах двух увеличений 63Х и 100Х. Второе обстоятельство заключается в том, что, несмотря на то, что детали меньше указанного выше предела не могут быть разрешены, расстояние между такими деталями может бьггь измерено с большей точностью. Эта возможность реализуется, если дифракционная картина от источника проецируется не на единичный элемент ПЗС матрицы, а на некоторую совокупность элементов. Положение максимума дифракционной картины в этом случае устанавливается с большей точностью. Таким образом, увеличение оптической системы избыточное, с точки зрения оптического разрешения, позволяет точнее проводить измерения расстояний на препарате.

Не менее важно обеспечить правильное освещение препарата. Человеческий глаз обладает чрезвычайно широким диапазоном адаптации к различным факторам маскирующим сигнал. Человеческий глаз отличается от ПЗС камеры значительно большим динамическим диапазоном (способностью одновременно регистрировать сигналы сильно отличающиеся по яркости), возможностями коррекции неоднородности освещения и изменения восприятия цвета связанного с изменением цветовой температуры освещения. Это приводит к тому, что в случае визуального наблюдения небольшое отклонение юстировки и фокусировки микроскопа от оптимальных не значительно сказывается на качестве изображения оцениваемого визуально. Те же отклонения изменения юстировки и фокусировки способны сильно ухудшить качество изображений регистрируемых ПЗС камерой. Погрешность настройки освещения приводит к ухудшению изображения как за счёт снижения эффективной апертуры, которая определяется как среднее апертур объектива и конденсора, так и за счёт рассеянного света, снижающего контраст регистрируемого изображения.

Одно из свойств физиологии зрения таково, что визуальная оценка контраста зависит от углового размера оцениваемых деталей. Применительно к задаче определения границ сегментов дифференциально окрашенных хромосом, указываемые положение границ сегментов, определяемое визуально, будет зависеть от увеличения изображения хромосом. Исследование хромосом должно проводиться при одном и том же увеличении изображения на экране компьютера.

При выборе спектрального состава освещения препарата нужно учитывать два фактора. Для человека более комфортно наблюдение цветных изображений, без доминирования какого-либо цвета. Анализ цветных изображений не только меньше утомляет человека, но проводится человеком с большей скоростью. Регистрация изображений монохромной камерой требует использования монохроматического освещения, длина волны которого соответствует максимуму поглощения, используемого для окраски препаратов, красителя. Противоположные требования могут быть удовлетворены за счёт использования белого освещения для визуальной оценки метафазной пластинки, непосредственно через окуляры микроскопа, и монохроматического для регистрации изображений монохромной ПЗС камерой. Нами предложена и опробована схема на основе светоизлучающих диодов реализующая такое освещение без дополнительных механических узлов.

Компьютерная система анализа изображения даёт преимущества не только в оперативности простейших манипуляций с изображением (вырезание, перемещение частей изображения, изменение контраста изображения и маркирование интересующих деталей), но и возможностью значительного повышения качества изображения методами восстановления изображения. Под качеством изображения понимается снижение искажений и шумов, маскирующих объекты, повышение разрешающей способности регистрирующей системы. Наибольший интерес представляют методы восстановления изображения объединяемые под названием деконволюции. Реальный микроскоп отображает изображение точечного источника в виде размытого пятна, что является следствием дифракции и различных оптических аберраций. Функция, описывающая распределение освещенности в плоскости изображения, когда объектом является светящаяся точка, находящаяся в фокусе, называется функцией рассеяния точки (ФРТ) оптической системы. ФРТ полностью характеризует способность оптического инструмента воспроизводить изображения объектов. В случае отсутствия переменной составляющей изображения, вносимой шумами, имея изображения интересующих нас объектов и ФРТ микроскопа можно было бы достаточно просто восстановить истинное положение и форму объектов. Математическое описание этой процедуры называется деконволюцией. Деконволюция является обращением того процесса который происходит при формировании изображений объектов. Однако в реальности в регистрируемом изображении всегда присутствуют шумы, вносимые как квантовой природой света, так и свойствами регистрирующих систем. Это приводит к необходимости применения сложного математического аппарата для моделирования процессов формирования изображения и оценки качества восстанавливаемого изображения. Программные реализации алгоритмов деконволюции изображения, как правило, требуют значительных вычислительных ресурсов. Современные методы деконволюции позволяют эффективно устранять размытие изображения (вследствие дифракции, аберраций и шумов регистрирующей системы) используя только математическую модель ФРТ. В результате применения методов деконволюции микроскопических изображений разрешение в плоскости препарата может быть улучшено до 100 нм, а разрешение в направлении оптической оси микроскопа 250 нм. Без деконволюции разрешение микроскопа составляет порядка 200 нм в плоскости препарата и около 800 нм в направлении оптической оси микроскопа. Методы деконволюции могут быть применены к изображениям полученным на светлопольном или флуоресцентном микроскопах (Monier и др., 1996). Однако следует проявлять большую осторожность при применении методов деконволюции к изображениям, полученным на светлопольном микроскопе, в отличие от обработки флуоресценто-микроскопических изображений.