абшо-гексоза (аскарилоза)
Настоящая работа посвящена изучению строения О-антигенных полисахаридов кишечной палочки, отличающихся необычным составом за счет содержания в них высших нонулозоновых кислот и других редко встречающихся моносахаридов, а также неуглеводных компонентов. Кишечная палочка {Escherichia coli) относится к грамотридательным бактериям семейства Enterobacteriaceae. Она была открыта в 1885 году, и с тех пор интерес к ее исследованию не ослабевает. На сегодняшний день она является одной из наиболее изученных бактерий. Е. coli обычно встречается в нижней части кишечника теплокровных животных. Большинство штаммов не только являются безвредными, но и приносят пользу организму хозяина, предотвращая развитие патогенных микроорганизмов в кишечнике. В то же время известны вирулентные штаммы этих бактерий, которые могут вызывать гастроэнтериты, воспаления мочеполовой системы и менингит у новорожденных. Наиболее опасны энтерогеморрагические штаммы, вызывающие геморрагические колиты и гемолитический уремический синдром. К ним относятся штаммы серогрупп Е. coli 0157 и 0104, а также исследованный в настоящей работе штамм серогруппы 0145.
Важным компонентом грамотрицательных бактерий является липополисахарид (ЛПС), расположенный на внешней мембране клеточной оболочки. Полисахаридная цепь ЛПС определяет специфичность иммунного ответа на инфекцию и, соответственно, она называется О-специфическим полисахаридом (ОПС) или О-антигеном. Серологически отличимые типы микроорганизмов продуцируют ОПС со своей уникальной структурой, что позволяет использовать О-антигены для серотипирования штаммов бактерий и серодиагностики. Интерес к О-антигенам обусловлен также их ролью в патогенезе инфекционных заболеваний, вызываемых патогенными и условно-патогенными бактериями.
Исследования структуры, биосинтеза и функционирования ЛПС, в том числе О-антигенов, являются актуальной задачей современной биоорганической химии и гликобиологии. Они позволяет решать целый ряд фундаментальных проблем микробиологии и иммунологии, как то: выяснять взаимосвязь между строением и функцией структурных компонентов бактериальной клеточной стенки, устанавливать механизмы иммунного ответа, прослеживать эволюционные пути формирования у микроорганизмов разнообразных антигенных структур. Знание строения О-антигенов имеет большое практическое значение для классификации бактерий, разработки новых диагностических препаратов и искусственных вакцин. Функциональный анализ генов биосинтеза О-антигенов, расположенных в хромосомных генных кластерах, позволяет выявлять уникальные для данного О-серотипа гены, на основе которых создаются современные методы молекулярной диагностики и которые могут служить мишенями для целевой терапии инфекционных заболеваний.
Кишечная палочка отличается большим разнообразием О-антигенных форм, которое сформировалось под постоянным воздействием окружающей среды, включая другие биологические системы, и которое, как предполагают, способствует адаптации бактерий в различных экологических нишах. Штаммы Е. coli объединяются в 186 О-серогрупп, основанных на сероспецифичности О-антигенов, и некоторые из серогрупп разделены на подгруппы. Хотя О-антигены Е. coli были одними из первых объектов структурного исследования среди бактериальных полисахаридов и их строение продолжало интенсивно изучаться на протяжении последних пятидесяти лет, к началу нашей работы были установлены структуры лишь немногим более половины всех известных О-антигенных форм.
Целью данной работы было установление строения ОПС десяти ранее неисследованных О-серогрупп кишечной палочки (Е. coli 029, 049, 0108, 0109, 0118, 0130, 0145, 0150, 0151 и 0161). В ходе исследования было обнаружено, что ранее структуры ОПС двух других серогрупп (Е. coli 0119 и 0123) были определены с ошибками, и эти структуры были уточнены в настоящей работе. Кроме того, было найдено, что О-антигены некоторых изученных нами серогрупп (Е. coli 0118, 0123, 0145, 0151) структурно близкородственны О-антигенам других важных энтеробактерий — возбудителей сальмонеллёза (Salmonella enterica), было установлено строение одного из них (S. enterica 058) и уточнена структура другого (S. enterica 048).
Объекты данного исследования были выбраны на основании предварительного генетического исследования, которое позволило предположить наличие редких компонентов в составе ОПС вышеперечисленных серогрупп. Сделанное предположение подтвердилось в ходе дальнейшего структурного анализа выбранных ОПСв частности, в составе трех из них были обнаружены и идентифицированы производные редко встречающихся в бактериальных углеводах высших Сахаров, относящихся к классу нонулозоновых кислот. Это определило выбор темы литературного обзора настоящей диссертации. В других ОПС были обнаружены такие компоненты, как простой эфир моносахарида с молочной кислотой — гликолактиловая кислота, 6-дезоксиаминосахара с необычными N-ацнльными заместителями, 6-дезоксидиаминосахар, фосфаты глицерина и рибита.
Установление строения ОПС необычного состава вызывает особый интерес, в частности, в связи с существенным вкладом редких моносахаридов в иммуноспецифичность бактерий, что важно для создания их серологических классификационных схем. Однако оно является трудной задачей, для решения которой потребовалось применение как классических методов структурной химии углеводов, таких как мягкий кислотный гидролиз ЛПС, полный кислотный гидролиз ОПС, ГЖХ-анализ летучих производных моносахаридов, распад по Смиту, так и нетрадиционные химические подходы (сольволиз ОПС, мягкий щелочной гидролиз ЛПС), а также новейшие методы, основанные на различных методиках двумерной спектроскопии ЯМР.
Еще одной целыо работы было определение функций генов биосинтеза изученных О-антигенов путем анализа секвенированных генных кластеров с учетом полученных структурных данных. Исследование генных кластеров О-антигенов, содержащих необычные моносахаридные и неуглеводные компоненты, позволило сделать предположения о происхождении сходных антигенных структур в различных группах бактерий и тем самым пролить свет на их эволюционную историю. Эта часть работы была выполнена совместно с китайскими партнерами — генетиками из лаборатории функциональной геномики микробов Колледжа ТЕДА Нанкайского университета (г. Тянь-дзинь, КНР).
Результаты, полученные в ходе выполнения настоящего исследования, имеют практическое значение. Данные о структуре О-антигенов представляют собой молекулярную основу серологической классификации штаммов кишечной палочки, необходимой для серодиагностики и эпидемиологического мониторинга. Данные функционального анализа генов биосинтеза О-антигенов могут быть использованы для разработки методов молекулярного типирования природных и клинических изолятов Е. coli, а также диагностики и целевой терапии вызываемых ими инфекций.
Результаты диссертационной работы опубликованы в 12 статьях, включая один обзор, в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК [1−12]. Они были представлены на двух российских и четырех международных конференциях: I Молодежная конференция ИОХ РАН, Москва, 2005 г.- 18th International Symposium on Glycoconjugates, Florence, Italy, 2005; 13th European Carbohydrate Symposium, Bratislava, Slovakia, 2005; 4th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, Hyytiala, Finland, 2010; IV Всероссийская школа-конференция «Химия и биохимия углеводов», Саратов, 2011 г.- FASEB Summer Research Conference Microbial Polysaccharides of Medical, Agriculiural and Industriell Importance, Carefree, Arizona, USA, 2011.
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания результатов, их обсуждения, экспериментальной части и выводов, а также включает список сокращений и список литературы. Литературный обзор посвящен высшим моносахаридам — компонентам ЛПС. В нем также дается общая характеристика ЛПС грамотрицательных бактерий. В главах «Результаты» и «Обсуждение результатов» описано установление строения ОПС кишечной палочки и использование полученных данных для функционального анализа генных кластеров О-антигенов, обсуждаются особенности состава изученных полисахаридов, фундаментальное и практическое значение выполненной работы. В главе «Экспериментальная часть» собраны методики выделения полисахаридов, их химического анализа, модификации и избирательного расщепления, проведения ЯМР-спектроскопнческих и масс-спектрометрических экспериментов.
выводы.
1. Установлены новые структуры О-специфических полисахаридов (О-антигенов) десяти серогрупп кишечной палочки (Esherichia coli) и одной серогруппы сальмонелл {Salmonella enterica) и уточнены ранее предложенные структуры полисахаридов двух серогрупп Е. coli и одной серогруппы S. enterica. Эти данные вносят существенный вклад в создание химической основы для классификации штаммов энтеробактерий по О-антигенам, необходимой для серодиагностики и эпидемиологического мониторинга.
2. В составе изученных полисахаридов обнаружены редко встречающиеся у бактерий моносахариды, такие как нонулозоновые кислоты (нейраминовая, легионаминовая и 8-эпилегионаминовая), гликолактиловая кислота — простой эфир N-ацетилглюкозамина с (5)-молочной кислотой, необычные N-ацильные производные 6-дезоксиаминосахаров и диаминосахар 2,3-диамино-2,3-дидезокси-Ь-рамноза. Впервые производное 8-эпилегионаминовой кислоты выделено в свободном виде и идентифицировано сравнением с заведомым синтетическим образцом.
3. С использованием данных о строении полисахаридов определены предположительные функции генов, кодирующих ферменты пути биосинтеза исследованных О-антигенов, включая пути синтеза предшественников нонулозоновых кислот. Выявлена генетическая основа родства О-антигенов Е. coli и S. enterica и формирования наблюдающегося разнообразия их структур. Полученные данные могут быть использованы для разработки метода молекулярного типирования клинических и природных изолятов кишечной палочки, а также ПЦР-диагностики и целевой терапии инфекций, вызываемых патогенными штаммами этой бактерии.