Липополисахариды бактерий рода Francisella как иммунодоминантные антигены и их фазовые вариации в условиях in vivo

Антигены патогенных бактерий вызывают особый интерес исследователей в связи с их важной ролью в патогенезе и иммуногенезе инфекционного процесса. Изучение иммунодоминантных антигенов микробов, индуцирующих в организме хозяина наиболее выраженный специфический антительный ответ, имеет не только теоретическое, но и практическое значение, так как диагностика многих инфекционных заболеваний базируется на выявлении этих антигенов или антител к ним.

Возбудитель туляремии — Francisella tularensis — имеет длительную историю исследований, в процессе которых его основные специфические антигены идентифицированы, а их химическая структура расшифрована.

36, 73, 171, 175, 184). Вместе с тем, как отмечено в последнем аналитическом обзоре литературы по проблеме «туляремия» (98), наши представления о факторах патогенности и иммуногенности туляремийного микроба и механизмах их реализации в условиях in vivo весьма ограничены. Еще в большей степени это относится к новым франциселлам — F. tularensis subsp. novicida (-like) и F. philomiragia, основные антигенные детерминанты которых изучены крайне недостаточно. Например, показано, что антигенная структура франциселл представлена специфическими эпитопами липополисахарида (ЛПС) (27), а также антигенами белковой природы различной специфичности (48). При этом остается невыясненным, является ли ЛПС иммунодоминантным антигеном этих бактерий и какова его диагностическая ценность для методов их детекции, которые на сегодняшний день практически отсутствуют. В то же время возможная этиологическая роль франциселл в инфекционной патологии человека (32, 119, 188) требует углубленного изучения их биологических особенностей.

В отличие от малоизученных новых франциселл, антигенная структура туляремийного микроба известна. Так, установлено, что ЛПС F. tularensis, представляемый в условиях in vivo живыми бактериями, является иммунодоминантным антигеном, вызывая выраженный специфический антительный ответ макроорганизма (98, 187). В противоположность этому, препараты ЛПС, выделенные из клеток, биологически инертны и вызывают слабый гуморальный ответ хозяина (103, 123, 157). Последнее свидетельствует в пользу того, что данные, полученные при изучении свойств антигенов in vitro, не всегда соответствуют тем процессам, которые имеют место in vivo. В этой связи остается открытым вопрос о том, с помощью каких механизмов инертный ЛПС туляремийного микроба реализует свой потенциал в организме хозяина. Одним из таких механизмов может быть способность этого бактериального биополимера к обратимым модификациям (фазовым вариациям). Согласно современным представлениям, термин «фазовые вариации» обозначает обратимые изменения (модификацию) поверхностных структур бактерий, которые наиболее часто сопровождаются изменением антигенной специфичности микроорганизма (антигенные фазовые вариации) (44, 128, 152, 170).

В настоящее время, очевидно, что динамика и исход инфекционного процесса во многом зависят от способности патогена к адаптации в ответ на изменения условий обитания, в частности, при попадании из внешней среды или от переносчика в организм чувствительного хозяина (7, 128, 170). Более того, существенное значение для взаимоотношений паразит-хозяин имеют также видовые особенности макроорганизма, которые, в свою очередь, могут определять стратегию возбудителя.

Туляремийный микроб в этом отношении является наиболее сложной моделью для изучения, так как имеет очень широкий круг хозяев, отличающихся по своей чувствительности к инфекции (36). В то лее время возможность фазовых вариаций поверхностных структур F. tularensis и влияние на этот процесс видовой принадлежности хозяина не исследованы. Имеется лишь одно сообщение, демонстрирующее в модельных экспериментах на макрофагах крыс изменение антигенных эпитопов ЛПС мутантного вакцинного штамма F. tularensis (92). Однако, насколько этот феномен характерен для других хозяев, и, в частности, человека, и имеет ли он вообще место при туляремийной инфекции или вакцинальном процессе остается неизвестным.

Таким образом, анализ данных литературы позволил выявить круг вопросов, нуждающихся в проведении специальных исследований, и сформулировать цель настоящей работы.

Цель исследования:

Исследование специфических иммунодоминантных антигенов липополисахаридной природы у бактерий рода Francisella и изучение возможности их фазовых вариаций в условиях in vivo.

Задачи исследования.

1. Получение коллекции иммунных сывороток людей и кроликов против различных представителей рода Francisella — F. tularensis (включая штаммы F. tularensis subsp. novicida и F. tularensis subsp. novicida-like) и F.philomiragia.

2. Выявление и изучение специфичности иммунодоминантных антигенов франциселл, определяющих антительный ответ кроликов на введение им живых и убитых бактерий.

3. Изучение возможности фазовых вариаций ЛПС F. tularensis при инфекционном и вакцинальном процессах у лабораторных животных.

4. Изучение феномена фазовых вариаций ЛПС F. tularensis при туляремийной инфекции и иммунизации человека живой туляремийной вакциной.

5. Использование препаратов ЛПС бактерий рода Francisella в дот-иммуноанализе для детекции специфических антител в сыворотках различных хозяев.

Научная новизна и теоретическая ценность работы.

В результате проведенных исследований получены новые данные об иммунодоминантных антигенах франциселл. Для всех изученных представителей рода Francisella — F. tularensis, включая F. tularensis subsp. поу! с1с1а (-11ке), и ?.рЫ1отга^т — специфичными иммунодоминантными антигенами являются ЛПС, тогда как большинство антигенов белковой природы имеют перекрестные общеродовые детерминанты. Обнаружено, что только живые бактерии индуцируют в организме хозяина — человека или кролика — выраженный антительный ответ против специфических эпитопов ЛПС. В противоположность этому, при иммунизации кроликов убитыми бактериями, ЛПС вызывает более слабый иммунный ответ. Впервые выявлено, что специфические иммунодоминантные антигены нового представителя рода РгапаяеНа — Р. рЫ1отн^1а — представлены двумя иммунологически различными формами липоолигосахарида (ЛОС) и низкомолекулярным антигеном с белковым компонентом.

Впервые установлено, что в сыворотках больных туляремией людей содержатся два самостоятельных типа антител с различной специфичностьюпротив антигенных эпитопов ЛПС Р. ййагегшз и против эпитопов ЛПС Р. жтшс1а. Доказано, что данные антитела не являются перекрестнореагирующими, а появление в процессе туляремийной инфекции человека «противоновицидных» иммуноглобулинов обусловлено модификацией эпитопов ЛПС возбудителя туляремии (антигенные фазовые вариации). В то же время при иммунизации человека живой туляремийной вакциной феномен антигенных вариаций ЛПС Р. й^агегшБ, как правило, не регистрируется. Однако, в исключительных случаях, при наличии у человека выраженных поствакцинальных реакций, ЛПС вакцинного штамма Р. Шкгех^Б может подвергаться модификации.

Практическая ценность работы.

Получена коллекция иммунных сывороток человека и кролика против различных представителей рода РгагкпБеПа, которая может быть в дальнейшем использована при изучении антигенной структуры разных видов франциселл. Предложено использование в качестве антигенных образцов очищенных препаратов ЛПС различных франциселл в дот-иммуноанализе, что позволяет повысить специфичность метода по сравнению с применением бактериальных препаратов. Рассмотрены Ученым Советом РостНИПЧИ и утверждены директором института методические рекомендации по использованию препаратов ЛПС РЛикгегшБ для выявления специфических противотуляремийных антител методом дот-блота (протокол № 11 от 30.11.2000 г.). Полученные в процессе выполнения исследования данные используются при чтении лекций на курсах специализации врачей-бактериологов в РостНИПЧИ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Для представителей вида Р. ш1аге1Ш8, включая РЛикгег^Б БиЬзр. гктс1с1а (-Ике), ЛПС является иммунодоминантным антигеном, на О полисахариде которого локализованы высокоспецифичные эпитопы. Большинство иммунореактивных белков франциселл характеризуются наличием перекрестнореагирующих общеродовых антигенных детерминант.

2. Иммунодоминантные специфические антигены Р. рЫ1о1гш^1а значительно отличаются от РЛикгег^Б и представлены двумя иммунохимически различными липоолигосахаридами и низкомолекулярным протеинсодержащим антигеном.

3. При туляремийной инфекции у человека, обусловленной природными вирулентными штаммами, происходит модификация ЛПС возбудителя туляремии с формированием антигенных детерминант, присущих ЛПС РЛи1агепз18 эиЬзр. гктс1с1а. В то же время при иммунизации человека и кролика живой туляремийной вакциной феномен антигенных вариаций ЛПС Р. Шкгепиэ, как правило, не регистрируется.

4. Применение ЛПС в качестве антигенного образца по сравнению с бактериальными препаратами позволяет повысить специфичность метода дот-иммуноанализа и использовать его при детекции специфических антител против франциселл в сыворотках человека и животных.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на научных конференциях РостНИПЧИ и конкурсах молодых ученых РостНИПЧИ (1998, 1999, 2000, 2001, 2003), а также были представлены на III и IV международных конференциях по туляремии (Швеция, 2000; Великобритания, 2003), на научных конференциях «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария.» (Киров, 1998), «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария.» (Екатеринбург, 1999), на VIII съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), на IV межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения.» (Омск, 2003), а также на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология — 21 век» (Саратов, 2004).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 4 работы в центральной печати и 4 — в зарубежных изданиях.

Ученым советом РостНИПЧИ утверждены методические рекомендации по использованию препаратов ЛПС Francisella tularensis для выявления специфических противотуляремийных антител методом дот-блота (Протокол № 11 от 30.11.2000).

Структура диссертации.

Работа изложена на 112 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 193 источника, в том числе 79 отечественных. Диссертация иллюстрирована 14 рисунками и 5 таблицами.

ВЫВОДЫ.

1. Для представителей вида F. tularensis, включая F. tularensis subsp. novicida (-like), ЛПС является иммунодоминантным антигеном, на О-полисахариде которого локализованы высокоспецифичные эпитопы. Большинство иммунореактивных белков франциселл характеризуются наличием перекрестнореагирующих общеродовых антигенных детерминант.

2. Иммунодоминантные специфические антигены F. philomiragia значительно отличаются от F. tularensis и представлены двумя иммунохимически различными липоолигосахаридами и низкомолекулярным протеинсодержащим антигеном.

3. Сыворотки больных туляремией людей содержат два самостоятельных типа антител с различной специфичностью — против антигенных эпитопов ЛПС туляремийного микроба и против эпитопов ЛПС F. tularensis subsp. novicida.

4. При туляремийной инфекции у человека, обусловленной природными вирулентными штаммами, происходит модификация ЛПС возбудителя туляремии с формированием антигенных детерминант, присущих ЛПС F. tularensis subsp. novicida. Эти эпитопы не являются перекрестнореагирующими и первоначально не присутствуют в ЛПС туляремийного микроба.

5. При иммунизации человека и кролика живой туляремийной вакциной феномен антигенных вариаций ЛПС F. tularensis, как правило, не регистрируется. Однако, в исключительных случаях, при наличии у человека выраженных поствакцинальных реакций, ЛПС вакцинного штамма F. tularensis может подвергаться модификации.

6. Применение ЛПС в качестве антигенного образца по сравнению с бактериальными препаратами позволяет повысить специфичность метода дот-иммуноанализа и использовать его при детекции специфических антител против франциселл в сыворотках человека и животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Одной из стратегий бактерий, направленных на их выживание в условиях макроорганизма, являются антигенные (фазовые) вариации, которые позволяют микробам либо мимикрировать под антигены организма хозяина, либо уклоняться от факторов неспецифической или специфической (иммунной) защиты (128, 152, 170). Такая удивительная пластичность как патогена, так и хозяина определяют, по-мнению О. В. Бухарина (2000)(8), динамику развития взаимоотношений паразит-хозяин и исход инфекционного процесса. При этом помимо гибели макроорганизма или его санации от возбудителя, адаптационные модификации поверхностных структур бактериальной клетки, особенно ее основных специфических антигенов, могут обусловливать также длительную персистенцию патогенных микробов in vivo (7, 152, 170).

Возможность фазовых вариаций основных антигенов туляремийного микроба и последствия этих событий для различных хозяев практически не исследованы. Вместе с тем, склонность туляремийной инфекции к позднему рецидивированию (иногда через 2−12 лет после перенесенного первичного заболевания) общеизвестна (4, 58). Очевидно, что только длительное сохранение жизнеспособных, потенциально патогенных бактерий F. tularensis в макроорганизме может обеспечить возникновение рецидивов. Следует отметить также, что пожизненный постинфекционный или поствакцинальный иммунитет связан, по убеждению Б. Я. Эльберта и H.A. Гайского (1941) (76), с нестерильным характером противотуляремийного иммунитета, т. е. длительной персистенцией возбудителя in vivo. В пользу этого свидетельствуют многочисленные данные об изоляции культур туляремийного микроба от различных хозяев через значительные промежутки времени после заражения (25, 61, 75). Механизмы, с помощью которых вирулентные бактерии выживают в иммунном организме и «ускользают» от защитных систем хозяина, до настоящего времени не расшифрованы. Выяснению этих вопросов могут способствовать исследования антигенных вариаций F. tularensis в организме различных хозяев, что и определило одну из задач настоящей работы. Кроме того, анализ данных литературы показал, что наши знания об иммунодоминантных антигенах других франциселл — F. tularensis subsp. novicida (-like) и F. philomiragia — имеют весьма ограниченных характер (27, 32, 49). В тоже время возможная этиологическая роль этих микробов в инфекционной патологии человека обосновывает актуальность их углубленного изучения и необходимость разработки методов детекции и идентификации новых франциселл (99, 101, 188, 189).

Вышеперечисленное и определило цель и задачи нашего исследования.

В качестве инструмента для изучения иммунодоминантных антигенов бактерий рода Francisella была получена коллекция противотуляремийных сывороток от больных туляремией и иммунизированных живой туляремийной вакциной людей, а также экспериментальные сыворотки кроликов, инфицированных живыми и убитыми культурами франциселл. Все сыворотки были изучены в системе реакций РПГА-РТПГА с помощью антигенных эритроцитарных диагностикумов на основе ЛПС бактерий рода Francisella.

Как установлено, живые микробы F. tularensis — F. tularensis и F. novicida (-like) вызывают в организме кроликов выраженный специфический антительный ответ, направленный против антигенных эпитопов ЛПС. В то же время убитые бактерии индуцировали in vivo образование анти-ЛПС-иммуноглобулинов в значительно меньших титрах (8−16 раз).

Исследование бактериальных лизатов и очищенных препаратов ЛПС методом иммуноблоттинга с гетерологичными иммунными сыворотками кроликов подтвердило, что именно ЛПС является специфическим иммунодоминантным антигеном этих франциселл. Следует особо подчеркнуть, что антигенная специфичность ЛПС возбудителя туляремии (F.tularensis) отличается от ЛПС представителей четвертого подвида — F. novicida и F. novicida-like. Более того, результаты иммуноблоттинга четко показали, что в пределах четвертого подвида липополисахариды изученных представителейF. novicida и F. novicida-like — отличаются по своей специфичности и вступают в реакцию только с иммуноглобулинами гомологичных сывороток. В отличие от ЛПС, большинство выявленных иммунореактивных белков исследованных бактерий вступали в реакцию с гетерологичными сыворотками, т. е. имели общевидовые перекрестные эпитопы.

Таким образом, живые бактерии, относящиеся к виду F. tularensis, вызывают в организме хозяина (кролик) наиболее выраженный антительный ответ против специфических антигенных эпитопов ЛПС, локализованных на О-полисахариде. В пользу последнего свидетельствует отсутствие взаимодействия противотуляремийных антител с R-ЛПС мутантного штамма F. tularensis 543 cap", лишенного О-полисахаридной цепи (липид А+кор).

В настоящее время вопрос о правомочности включения F. philomiragia в род Francisella представляется спорным (32, 38). Поэтому дополнительные данные о свойствах этого микроба могут способствовать уточнению таксономического статуса F.philomiragia. Кроме того, знание иммунодоминантных специфических антигенов F. philomiragia необходимо при конструировании высококачественных диагностических препаратов, которые в настоящее время в лабораторной практике отсутствуют.

В результате проведенного исследования впервые показано, что F. philomiragia обладает, по меньшей мере, тремя специфическими иммунодоминантными компонентами — двумя иммунологически различными липоолигосахаридами и низкомолекулярным протеинсодержащим антигеном. В пользу наличия двух различных форм ЛОС у этого вида микробов свидетельствует следующее. Известно, что в ПААГ электрофорезе с окраской гелей ионами серебра ЛОС F. philomiragia представлен двумя фракциями, отличающимися по молекулярной массе (27). В то же время в наших экспериментах эти две фракции визуализировались только при обработке блотов гомологичными сыворотками к живым бактериям, тогда как иммуноглобулины против убитых бактерий позволяли выявить лишь одну антиген-активную зону, соответствующую JIOC с меньшей молекулярной массой. Следовательно, антитела, взаимодействующие с двумя фракциями JIOC F. philomiragia, имеют различную специфичность, а фракции JIOC являются двумя иммунологически различными формами. Низкомолекулярный антиген с белковой составляющей, которая разрушалась под действием проназы, также характеризовался видоспецифичностью, так как не вступал во взаимодействие с гетерологичными сыворотками. В противоположность этому, большинство других белковых антигенов F. philomiragia имели общеродовые перекрестные детерминанты. Полученные данные согласуются с результатами И. В. Родионовой с соавт. (1997) о наличии у бактерий рода Francisella большого количества перекрестных антигенов белковой природы (49).

Таким образом, установлено, что липополисахариды являются иммунодоминантными специфичными антигенами для всех изученных нами представителей рода Francisella (F.tularensis, включая F. novicida (-like), и F. philomiragia). Более того, полученные нами результаты о том, что антигенные эпитопы ЛПС F. tularensis и F. novicida, при всей близости этих микроорганизмов, имеют различную антигенную специфичность, нашли подтверждение в недавно опубликованной работе Е. Vinogradov et al (2004) (186). В частности, расшифровка химической структуры О-цепи ЛПС F. novicida продемонстрировала ее значительное сходство с О-полисахаридом F.tularensis. Однако при сравнительном исследовании этих О-полисахаридов с помощью поликлональных мышиных сывороток авторам не удалось зарегистрировать р между ними перекрестных реакций (186). ~~ 1 0ч 1, Ол i1- г.

Следующий этап работы включал изучение возможности фазовых (антигенных) вариаций основного иммунодоминантного антигена F. tularensis — ЛПС в организме различных хозяев. При этом, учитывая экспериментальные данные S.C. Cowley et al (1996) (92) о возможности появления у мутантных штаммов F. tularensis эпитопов, присущих F. novicida, и их способности к изменению после пребывания микробов в макрофагах крыс, мы исследовали влияние организма белых мышей, морских свинок и крыс на структуру ЛПС у ЛПС-дефектных мутантов. Однако эти опыты успеха не имели. Мутанты стабильно сохраняли авирулентный фенотип и дефектную структуру ЛПС после пребывания в условиях in vivo. Кроме того, нам не удалось зарегистрировать взаимодействие исходных мутантов или культур, выделенных от животных, с антителами против F. novicida (РНАт с соответствующим антигенным диагностикумом и иммуноблоттинг). Неудачными оказались и эксперименты по изучению возможности фазовых вариаций у высоковирулентных штаммов возбудителя туляремии в условиях хронической инфекции (длительной персистенции in vivo) у чувствительных (белые мыши) и малочувствительных (белые крысы) животных. Все культуры, выделенные в этих экспериментах от выживших в течение 30 дней животных, стабильно сохраняли свои первоначальные свойства: вирулентность и антигенную структуру.

Отрицательные результаты заставили нас искать другой подход для решения этой задачи — изучение возможности антигенной модификации ЛПС F. tularensis in vivo. Можно предположить, что если в процессе туляремийной инфекции имели место изменения антигенных эпитопов ЛПС, то в сыворотках зараженных хозяев будут присутствовать, помимо специфических противотуляремийных, антитела иной направленности. Эта гипотеза и определила направление дальнейшего исследования — изучение специфичности антител в сыворотках кроликов и человека, инфицированных вирулентными и вакцинным штаммами F.tularensis.

Как установлено с помощью иммуноблоттинга, в сыворотках кроликов, иммунизированных вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ, содержались только анти-ЛПС-антитела, направленные против специфических О-полисахаридных эпитопов ЛПС возбудителя туляремии. При этом выявляемые иммуноглобулины не взаимодействовали с антигенными эпитопами ЛПС других франциселл — Р. штЫс1а, Р. штслёа-Нке и Р. рЫ1огшга§ 1а. В то же время при заражении кролика вирулентным штаммом нам удалось зарегистрировать реакцию антител не только с ЛПС Р. Щкгегшэ, но и выявить слабое взаимодействие с ЛПС Р. поую1ёа. Эксперименты по перекрестному истощению данных сывороток препаратами ЛПС Р.1и1агепз18 и ЛПС Р. поую1с1а с последующей оценкой титров в РПГА с антигенными диагностикумами на основе ЛПС этих бактерий выявили, что в сыворотках присутствуют антитела не только к высокоспецифичным эпитопам ЛПС Р. йЛагегшз, но и антитела, перекрестные с ЛПС Р. гктс1(1а. В пользу этого свидетельствует тот факт, что препарат ЛПС Р. Щ1агепз18 полностью нейтрализовал гомологичные антитела и частично антитела, реагирующие с ЛПС Р. поуЫс1а. Подобные иммуноглобулины в сыворотке кроликов против вакцинного штамма не обнаруживаются. Учитывая идентичность иммунохимической структуры О-антигенов вирулентных и вакцинного штаммов (176), полученные результаты позволили предположить, что только при инфекционном процессе в организме кроликов происходит либо «деэкранизация» перекрестных эпитопов ЛПС, либо имеют место антигенные изменения (возможно, конформационные) специфических эпитопов ЛПС с формированием общих с ЛПС Р. гктс1с1а эпитопов.

Несмотря на то, что кролик и человек относятся к одной группе чувствительности к туляремии (И группа — малочувствительные, но восприимчивые), в литературе имеются сведения об особенностях течения туляремийной инфекции у этих хозяев (36, 69, 148). Последнее обусловило наш интерес к исследованию сывороток больных туляремией людей или иммунизированных живой туляремийной вакциной. Именно в данных экспериментах нами было получено первое подтверждение способности ЛПС Р. йЛагегшз к фазовым (антигенным) модификациям в процессе туляремийной инфекции.

Как оказалось, во всех изученных сыворотках больных туляремией людей (14−28 день заболевания) присутствуют антитела, четко взаимодействующие в иммуноблоттинге с препаратами ЛПС F. tularensis и F.novicida. При этом не обнаружено антител, реагирующих с ЛПС штаммов F. novicida-like или F.philomiragia. Отсутствие видимого взаимодействия антител с R-ЛПС мутантного штамма F. tularensis 543 cap" (липид, А + кор) предполагает, что антигенные эпитопы, реагирующие с антителами противотуляремийных сывороток больных людей, локализованы на О-полисахаридах ЛПС. В отличие от изученных противотуляремийных сывороток кроликов, перекрестное истощение сывороток больных туляремией людей препаратами ЛПС F. tularensis и F. novicida показало, что каждый препарат нейтрализовал только гомологичные антитела, не затрагивая титра гетерологичных. Например, препарат ЛПС F. tularensis истощал сыворотку только по противотуляремийным иммуноглобулинам и не изменял титр «противоновицидных» антител, выявляемый в РПГА с помощью соответствующего диагностикума на основе ЛПС F.novicida.

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы. Во-первых, отсутствие перекрестного истощения в сыворотках больных туляремией свидетельствует в пользу наличия в них двух самостоятельных видов иммуноглобулинов различной специфичности — против О-полисахарида ЛПС F. tularensis и против О-полисахарида ЛПС F.novicida. Во-вторых, препарат ЛПС туляремийного микроба, выделенный из вирулентного штамма, первоначально не содержит специфические антигенные эпитопы, присущие ЛПС F. novicida, так как не истощает сыворотку по «противоновицидным» антителам. И, наконец, тот факт, что все 5 изученных сывороток больных туляремией, полученные в разные периоды времени, дали аналогичные результаты, минимизирует вероятность инфицирования людей двумя микробами одновременно. Следовательно, наличие в сыворотках больных людей антител против специфических антигенных эпитопов ЛПС F. novicida доказывает, что в процессе туляремийной инфекции человека, обусловленной природными вирулентными штаммами, происходит модификация антигенных эпитопов ЛПС F.tularensis.

Биологическая целесообразность выявленного феномена заключается, по-видимому, в том, что, изменяя антигенную специфичность в направлении более слабого патогена (F.novicida), туляремийный микроб может резко снижать ответную реакцию хозяина и адаптироваться к условиям in vivo (персистенция). Подобные фазовые вариации обратимы, и в случае ослабления защитных механизмов макроорганизма F. tularensis выходит из-под их контроля, восстанавливают свою первоначальную антигенную структуру и реализует свой патогенный потенциал. В пользу последнего могут свидетельствовать данные S.C. Cowley et al. (1996) (92) о восстановлении специфических туляремийных антигенных эпитопов у мутантного штамма F. tularensis LVS, имеющего первоначально детерминанты, характерные для F. novicida, после внутриклеточного пребывания микробов в макрофагах крыс. Нельзя исключить, что такой сценарий является одним из событий, приводящих к возникновению рецидивов туляремии. С другой стороны, длительная персистенция туляремийного микроба в организме хозяина без проявления его патогенных свойств может, возможно, обеспечивать длительный (пожизненный) постинфекционный иммунитет против туляремии. Все эти предположения нуждаются в дальнейшем исследовании. Вместе с тем возникает вопрос, насколько феномен фазовых вариаций ЛПС F. tularensis характерен для инфекционного процесса, или же он участвует и в формировании поствакцинального иммунитета.

При изучении сывороток от людей, первично вакцинированных или ревакцинированных живой туляремийной вакциной, выявить антигенные модификации ЛПС F. tularensis нам не удалось. Так, 15 из 16 исследованных сывороток вакцинированных людей содержали только иммуноглобулины, направленные против специфических эпитопов ЛПС F. tularensis и не вступали в реакции с ЛПС Р. гкмслёа, Р. псшслс1а-Нке или Р. рЫ1опнга§ 1а. В то же время сыворотка одного вакцинированного человека, отличающегося от других иммунизированных людей наличием выраженных поствакцинальных реакций (лимфаденит, кратковременная лихорадка), показала присутствие антител, четко взаимодействующих с эпитопами ЛПС Р.поушёа. Более того, в этом случае визуальная картина взаимодействия антиген-антитело на иммуноблотах была очень близка к наблюдаемой нами при работе с сыворотками больных туляремией людей. Однако, в отличие от сывороток больных, сыворотка этого индивидуума давала частичное перекрестное истощение препаратами ЛПС Р. ш1агепз18 и Р. поугас1а в РПГА. Следовательно, при иммунизации человека живой туляремийной вакциной, в исключительных случаях, когда иммунизация протекает с выраженными поствакцинальными манифестациями, ЛПС туляремийного микроба может модифицироваться с формированием перекрестных с Р. поу1с1с1а эпитопов. Можно предположить, что антигенные вариации ЛПС туляремийного микроба в организме человека идут по пути от высокоспецифичных туляремийных эпитопов через образование переходных форм (перекрестные с ЛПС Р. штЫёа) до формирования эпитопов, строго специфичных в отношении ЛПС Р. поую1с1а. Отсутствие «противоновицидных» антител у 15 вакцинированных людей и их наличие лишь у одного иммунизированного индивидуума еще раз подтверждает, что первоначально ЛПС F. tularensis не содержит подобных антигенных эпитопов. Таким образом, на примере исключения мы еще раз получили доказательство возможности фазовых вариаций ЛПС Р. Шкгег^з в организме человека.

В процессе выполнения настоящей работы, помимо иммуноблоттинга, мы неоднократно использовали более простой метод — точечный твердофазный иммуноферментный анализ (дот-иммуноанализ или дот-блот). Согласно данным литературы, этот информативный, простой и удобный вариант иммуноанализа широко применяется при диагностике многих инфекционных заболеваний (23, 35). В то же время в лабораторной практике исследования возбудителя туляремии его использование весьма ограничено. Более того, в качестве антигенных препаратов для детекции противотуляремийных антител были предложены бактериальные лизаты (78), которые, как показали результаты нашего исследования, содержат большое количество общеродовых перекрестных антигенов белковой природы. При этом известно, что в традиционном иммуноферментном анализе (ИФА) применение ЛПС F. tularensis в качестве антигенного препарата существенно повышает специфичность метода (31). Еще одним достоинством применения очищенных препаратов ЛПС является тот факт, что они биологически безопасны и способны к длительному хранению без изменения своих основных параметров (антигенной специфичности). В этой связи, имея в своем распоряжении коллекцию противотуляремийных сывороток человека и кролика, представлялось целесообразным изучение диагностической ценности дот-иммуноанализа с использованием ЛПС при диагностике туляремии. Кроме того, полученные в ходе исследования данные о том, что ЛПС является специфическим антигеном и для других франциселл — F. novicida, F. novicida-like и F. philomiragiaопределили перспективность изучения их применения в дот-блоте при детекции специфических антител против этих бактерий. В настоящее время методы иммунологической (серологической) диагностики инфекций, вызванных данными патогенами, не разработаны.

При сравнительном изучении бактериальных взвесей и очищенных препаратов ЛПС в дот-иммуноанализе установлено, что высокая специфичность дот-блота наблюдается только при использовании препаратов ЛПС. В этом случае мы не регистрировали перекрестного взаимодействия антигена не только с антителами против таксономически далеких бактерийВ. abortus, V. cholerae, Y. enterocolitica, но и с иммуноглобулинами против близкородственных микробов рода Francisella. Показана также достаточно высокая чувствительность дот-блота, позволяющая, по нашим данным, обнаруживать в исследуемых сыворотках специфические антитела, соответствующие титрам в РПГА 1:160.

Таким образом, в результате проведенного исследования продемонстрирована возможность применения метода дот-иммуноанализа с использованием в качестве антигенных препаратов ЛПС бактерий рода РгагклэеПа для выявления специфических антител в сыворотках человека и животных. Данный метод, характеризующийся высокой специфичностью, достаточной чувствительностью и простотой выполнения, может дополнить схему лабораторной диагностики туляремии. Кроме того, при отсутствии коммерческих диагностических препаратов для детекции других франциселл, дот-блот может быть использован для обнаружения антител против этих микроорганизмов в исследуемых сыворотках.