Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Ферментативные свойства нативного и модифицированного субтилизина 72 в среде органических растворителей

Диссертация: Ферментативные свойства нативного и модифицированного субтилизина 72 в среде органических растворителей
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Комплекс невалентных взаимодействий, поддерживающих трехмерную структуру белков, в значительной степени определяется свойствами среды, окружающей макромолекулы. При изменении полярности и гидрофильности окружения молекулы фермента, например, в органических растворителях, баланс взаимодействий, среди которых основными являются гидрофобные и электростатические, нарушается. В результате этого… Читать ещё >

Содержание

  • СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
  • 1. БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОВАЛЕНТНО ИММОБИЛИЗОВАННЫХ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
    • 1. 1. Характеристика ферментов, иммобилизованных на носителях с использованием диалъдегидов
    • 1. 2. Свойства сериновых протеиназ, иммобилизованных на эпокси-содержащих носителях
    • 1. 3. Иммобилизация сериновых протеиназ с использованием карбодиимидов и свойства полученных биокатализаторов
    • 1. 4. Иммобилизация сериновых протеиназ на носителях, активированных другими методами
    • 1. 5. Сравнительная характеристика свойств сериновых протеиназ, иммобилизованных различными способами
    • 1. 6. Сайт-специфическая иммобилизация сериновых протеиназ
    • 1. 7. Получение и свойства биокомпозитов
    • 1. 8. Поведение иммобилизованных ферментов средах, содержащих органические растворители

Ферментативные свойства нативного и модифицированного субтилизина 72 в среде органических растворителей (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

В последние годы, наряду с химическими, интенсивно развиваются ферментативные методы синтеза соединений пептидной природы под действием протеиназ, в частности субтилизинов. Распространенность, доступность, широкая субстратная специфичность делают субтилизины весьма привлекательными для катализа реакций пептидообразования. Особый интерес представляет проведение реакций ферментативного синтеза в нетрадиционных для функционирования ферментов средах. В органической среде уменьшается риск протекания побочных процессов гидролиза, а также снимаются ограничения, связанные с низкой растворимостью гидрофобных субстратов. С этой точки зрения использование протеиназ в органической среде для синтеза различных пептидов представляется весьма перспективным.

Исследование функциональных особенностей поведения протеиназ в системах органических растворителей с низким содержанием воды является необходимым элементом изучения «неводного» биокатализа. Традиционный подход контроля ферментативной активности протеолитических ферментов, основанный на измерении скорости гидролиза специфических субстратов, в безводных средах практически невозможен. Одним из способов адекватной оценки состояния протеиназ может быть изучение их «сингетазной» активности в реакциях пептидообразования. В связи с этим актуальной задачей является изучение каталитической эффективности ферментов в системах с высоким содержанием органических растворителей с целью разработки подходов для использования и адаптации биокатализаторов к условиям функционирования в таких средах.

Пслыо работы являлось изучение биокаталитических свойств нативного и модифицированного субтилизина 72 в среде органических растворителей. Задачи исследования включали:

Сравнительное изучение гидролитической активности и стабильности нативного субтилизина, его нековалентного комплекса с полиакриловой кислотой и фермента, ковалентно иммобилизованного на криогеле поливинилового спирта, в средах различного состава.

Изучение синтетазной активности нативного и модифицированных субтилизинов в смесях полярных органических растворителей.

Разработку ферментативных методов получения пептидов, содержащих полифункциональные аминокислотные остатки, без защиты боковых ионогенных групп в органических растворителях.

выводы.

1. Получены и охарактеризованы нековалентный полиэлектролитный комплекс субтилизина с полиакриловой кислотой и препарат субтилизина 72, ковалентно иммобилизованного на криогеле поливинилового спирта.

2. Установлено, что нативный и модифицированный субтилизины сохраняют активность в смесях, содержащих 30−70% ДМФ/ацетонитрил. При увеличении концентрации ДМФ до 90% наибольшей стабильностью обладает иммобилизованный субтилизин.

3. Изучена каталитическая эффективность нативного и модифицированных субтилизинов в реакции ферментативной пептидной конденсации в смесях органических растворителей с низким содержанием воды в зависимости от состава среды, времени реакции и концентрации биокатализатора. Установлено, что в смесях органических растворителей, содержащих более 80% ДМФ, синтетическая активность модифицированных субтилизинов выше, чем у нативного фермента.

4. Показана возможность многократного применения одного и того же образца иммобилизованного субтилизина в средах полярных органических растворителей, содержащих от 60 до 95% ДМФ, как с промежуточной промывкой препарата буфером, так и без регидратации биокатализатора в течение нескольких циклов.

5. Обнаружено, что при ферментативном синтезе, катализируемом иммобилизованным субтилизином в среде полярных органических растворителей, возможно использование в качестве ацилирующего компонента N-ацилпептидов со свободной карбоксильной группой. В присутствии иммобилизованного фермента с выходами 70 — 98% в среде ДМФ-ацетонитрил без активации карбоксильного компонента и защиты боковых ионогенных групп полифункциональных аминокислот получена серия п-нитроанилидов тетрапептидов, содержащих основные и кислые аминокислотные остатки.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор искренне признателен руководителям работы И. Ю. Филипповой и E.H. Лысогорской за постоянное внимание, огромную моральную поддержку, помощь в планировании и проведении экспериментов, в обсуждении результатов, и особенно в написании данной работы. Автор выражает глубокую благодарность В. И. Лозинскому за ценные идеи, послужившие основой экспериментов с иммобилизованным субтилизином, критическое обсуждение проводимых исследований и содействие в написании работы. Автор чрезвычайно признателен А. К. Гладилину за неоценимую помощь, интересные предложения и практические советы, а также научные дискуссии при проведении кинетических экспериментов и при подготовке работы. Автор особенно благодарен Е. С. Оксенойт за синтез исходных пептидов. Огромную помощь в изучении полученных соединений оказали сотрудники отдела хроматографии Л. А. Баратова, Н. Федорова и А. Л. Ксенофонтов. Автор хотел бы выразить отдельную благодарность О. В. Байбак и Ф. М. Плиевой за получение препаратов иммобилизованных ферментов, И. В. Гетун за помощь в поиске литературы и масс-спектрометрическом анализе, A.B. Беляевой за проведение некоторых экспериментов, а также всем сотрудникам лаборатории за внимание и полезные советы.

1.9.

Заключение

.

Таким образом, из литературных данных следует, что иммобилизация является широко используемым методом стабилизации сериновых протеиназ по отношению к различным инактивирующим воздействиям. Ферментативная активность иммобилизованных протеиназ в большинстве случаев ниже, чем у нативных ферментов [134]. Это связано как с ограничением доступности активного центра, так и инактивации во время самого процесса образования ковалентных связей биокатализаторов с матрицей. На каталитические свойства иммобилизованных ферментов большое влияние оказывают свойства и природа носителя. Весьма важны такие параметры матрицы, как возможность образования многоточечных контактов, заряд поверхности, гидрофильность и пористость. Самыми удачными с точки зрения сохранения ферментативной активности иммобилизованных протеиназ являются гидрофильные макропористые подло лжи.

В подавляющем большинстве работ приводятся данные по свойствам иммобилизованных биокатализаторов в водных средах. Круг исследований, посвященных изучению поведения иммобилизованных ферментов в присутствии органических растворителей, очень незначителен. Установлено, что иммобилизованные сериновые протеиназы обладают достаточно высокой активностью и стабильностью в смесях с низким содержанием воды. Синтетазная активность иммобилизованных протеиназ в таких средах исследована на ограниченном числе реакций этерификации (переэтерификации) производных аминокислот и синтеза модельных дии трипептидов. Данные по синтезу гидрофобных протяженных пептидов в литературе отсутствуют.

2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Комплекс невалентных взаимодействий, поддерживающих трехмерную структуру белков, в значительной степени определяется свойствами среды, окружающей макромолекулы. При изменении полярности и гидрофильности окружения молекулы фермента, например, в органических растворителях, баланс взаимодействий, среди которых основными являются гидрофобные и электростатические, нарушается. В результате этого гидрофобные взаимодействия в структуре фермента ослабевают, электростатические усиливаются, что может приводить к разворачиванию белковой глобулы. Результатом увеличения силы межмолекулярных взаимодействий может быть агрегация, а в случае протеолитических ферментов — ускорение реакции автолиза [135−137]. При умеренном содержании большинства полярных органических растворителей образуются гомогенные истинные растворы ферментов, а каталитическая активность остается неизменной вплоть до некоторой критической концентрации растворителя [134]. Инактивация при дальнейшем увеличении доли органической компоненты в системе носит пороговый характер. Однако при низком содержании воды в смеси белок существует уже не в виде раствора, а в виде суспензии [138, 139]. В последние годы показано, что многие ферменты могут использоваться как катализаторы в средах с низким содержанием воды. Низкая активность ферментов в водно-органических средах с высоким содержанием органической компоненты по сравнению с безводной обусловлена именно присутствием воды, которая действует как молекулярная «смазка», усиливая конформационную подвижность белковой глобулы и облегчая денатурацию [140]. Для адаптации ферментов к условиям функционирования в среде органических растворителей и повышения их стабильности используются различные методы: химическая модификация [141, 142], сайт-направленный мутагенез для гидрофобизации и стабилизации белковой глобулы [143−147], получение сшитых кристаллов [148, 149], варьирование состава и рН буфера, из которого лиофилизуют фермент [150, 151], получение нековалентных комплексов ферментов с детергентами или полиэлектролитами [152−155], ковалентная и нековалентная иммобилизация на различных сорбентах [156−158]. Исследования стабильности и активности ферментов проводились чаще всего на примерах катализа реакций гидролиза специфических пептидных субстратов [143−147, 159−161].

Целью данной работы являлось изучение биокаталитических свойств нативного и модифицированного субтилизина 72 в среде органических растворителей.

В первой части работы был получен комплекс субтилизина с полиакриловой кислотой и изучены его характеристики, в том числе стабильность в водных средах, а также охарактеризованы препараты субтилизина, ковалентно иммобилизованного на криогеле поливинилового спирта.

Во второй части работы исследовалось поведение нативного и модифицированного субтилизина в смесях органических растворителей с низким содержанием воды в реакциях пептидного синтеза.

Субтилизин 72 — внутриклеточная щелочная сериновая протеиназа [1−6, 148, 162], продуцируемая микроорганизмом Bacillus subtilis, штамм 72. Фермент впервые был получен в высокоочищенном состоянии в 1979 г. в нашей стране. N-концевая последовательность субтилизина 72 (до 35 шага) оказалась схожей, за исключением двух позиций, с N-концевым фрагментом субтилизина Карлсберг, продуцируемого Bacillus licheniformis. Высокая степень гомологии позволяет сделать предположение, что субтилизин 72 очень близок, хотя и не идентичен по свойствам субтилизину Карлсберг [163]. Субтилизин — распространенный, доступный фермент, обладающий широкой субстратной специфичностью и катализирующий разнообразные реакции образования пептидной связи и этерификации [157, 164−170].

2.1. Получение и характеристики комплекса ПАК-субтшизин.

Ранее в нашей лаборатории был получен нековалентный комплекс субтилизина с додецилсульфатом натрия (SDS-субтилизин). Фермент в составе такого комплекса обладал высокой стабильностью и активностью в средах полярных органических растворителей с низким содержанием воды [154, 155]. В данной работе мы исследовали другой способ нековалентной модификации субтилизина для адаптации его к функционированию в органических растворителях — образование комплекса фермента с полиэлектролитами [152, 171−174]. Белок-полиэлектролитные комплексы образуются в водных растворах за счет электростатических взаимодействий между противоположно заряженными группами белка и полиэлектролита (рис. 21). Согласно литературным данным [175−179], такие комплексы обладают высокой прочностью в водных растворах за счет многоточечного кооперативного взаимодействия. Состав и свойства белок-полиэлектролитных комплексов зависят от таких параметров как pH, ионная сила, количество и плотность заряда поверхности белка, а также цепи заряженного полимера и степени полимеризации полиэлектролита [175, 177, 180−183].

Ферменты, связанные в комплекс с полиэлектролитом, приобретают высокую стабильность в водном растворе во всем диапазоне рН, в котором существует комплекс [184]. Возможным объяснением этого эффекта является то, что фермент является высокомолекулярным соединением, а наличие оболочки из одноименных зарядов на молекулах фермента препятствует взаимодействию частиц образующегося комплекса между собой в результате электростатического отталкивания.

Комплексы белок-полиэлектролит устойчивы и в различных смесях органических растворителей. Это связано с тем, что в органической среде, диэлектрическая проницаемость которой ниже, чем водной, электростатические взаимодействия между полиионом и белком усиливаются. Ферменты в составе полиэлектролитного комплекса в водно-органических смесях характеризуются большей стабильностью по сравнению с нативными по двум причинам: Во-первых, за счет многоточечного взаимодействия происходит фиксация нативной конформации ферментаВо-вторых, заряженные звенья полииона препятствуют взаимодействию белковых молекул друг с другом и защищают от агрегации.

Нами было исследовано образование комплекса субтилизина 72 с полианиономполиакриловой кислотой (ПАК) (рис. 22) в условиях, описанных для аналогичного комплекса с а-химотрипсином [173].

CH2-CH соон.

М.М =240 ООО г/моль п.

Рис. 22. Полиакриловая кислота.

Комплекс образовывался сразу после сливания водных растворов фермента и полиакриловой кислоты при комнатной температуре. Соотношение ПАК/субтилизин составляло 0.14 моль/моль, что примерно соответствовало 10-кратному превышению числа отрицательных зарядов полиакриловой кислоты по отношению к количеству аминогрупп субтилизина (в состав молекулы субтилизина 72 входит 9 Lys, и 4 Argостатков основных аминокислот, с которыми возможно взаимодействие). Необходимо отметить, что, поскольку ПАК — кислота, то при ее растворении в 0.05М Трис-НС1 буфере значение pH снижалось с 8.4 до 5.25.

УФ-спектр полученного комплекса ПАК-субтилизин в водном буфере (рис.23) аналогичен спектру нативного субтилизина (на рисунке не показан).

250 зса 350 il I I ' l t I ! I I ! I I.

——— ь. .—.

-!-!—" — - ~ -, г: — -: V г -1- -f——r Г". -1 p= ——— ———— — - ——————- ——.

42 -40 38, 30, 34 j M ' 30 28.

Рис. 23. УФ-спектр раствора комплекса ПАК-субтилизин в 0.05 M Трис-HCl буфере, рН 8.2.

Нами были определены кинетические константы нативного субтилизина и комплекса ПАК-субтилизин по гидролизу 01р-А1а-А1а-Ьеи-рКА в 0.05 М Трис-НС1 буфере, рН 8.2, содержащем 1.5 мМ СаСЬ (табл. 9).

Показать весь текст

Список литературы

  1. В. М. Структура и функции белков. // Молекулярная биология. Под ред. А. С. Спирина. Москва. Высшая школа. 1996. с. 220−233.
  2. В. К. Химия протеолиза. // Москва. Наука. 1983. С. 135−147.
  3. Kraut J. Serine proteases: strucrure and mehanism of catalysis. // Ann. Rev. Biochem. 1977. V.46 P. 331−338.
  4. Г. Н. Новые подсемейства субтилизинов. // Биоорг. химия. 1994. Т.20 С. 475−484.
  5. Voet D. Voet J. G. Biochemistry. П. New York. Wiley. 2nd ed. 1995. p. 397−399.
  6. Siezen R. J., Leunissen J. A. M. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like serine proteases. // Protein Science. 1997. V.6 P. 501−523.
  7. W. W. 15N NMR Spectroscopy of hydrogen-bonding interaction in the active site of serine proteases: evidence for a moving histidine mechanism. // Biochemistry. 1986. V.25 P. 7751−7759.
  8. И. В., Клесов А. А., Швядас В. К., Угарова Н. Н., Варфоломеев С. Д., Ярополов А. И., Казанская Н. Ф., Егоров А. М. Биотехнология. // Инженерная энзимология. Москва. Высшая школа. 1987.
  9. Adlercreutz P., Clapes P. Mattiasson В. Enzymatic peptide synthesis in organic media. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1990. V.613 P. 517−520.
  10. Adlercreutz P., Mattiasson В., Otamiri M. Synthetic polymers as solubilizing vehicles for enzymes in water-poor media. // Bioorg Med Chem. 1994. V.2 P. 529−533.
  11. И. В. Мартинек К. М. Химическая энзимология. // Москва. Издательство Московского Университета. 1983.
  12. И. В., Мартинек К. М., Антонов В. К. Иммобилизованные ферменты. // Москва. Издательство Московского Университета. 1976. Т. 1.
  13. И. В., Клячко Н. Л., Левашов А. В., Мартинек К. М., Можаев В. В., Хмельницкий Ю. Л. Иммобилизованные ферменты. // Биотехнология. Москва. Высшая школа. 1987.
  14. F. Н., Williams R. J., Niven G. W., Andrews A. T. Enzyme immobilization on nylon-optimization and the steps used to prevent enzyme leakage from the support. // Enzyme Microb. Technol. 2001. V.28 P. 225−232.
  15. Kise H., Hayakawa A. Immobilization of proteases to porous chitosan beads and their catalysis for ester and peptide synthesis in organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1991. V.13 P. 584−588.
  16. Chae H. J., In M. J., Kim E. Y. Optimization of protease immobilization by covalent binding using glutaraldehyde. //Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. V.73 P. 195−204.
  17. Bachinski N., Panek A. D. Paiva C. L. Nylon-6 cylinders and a sponge-like derivative as supports for immobilizing trypsin. // Braz J Med Biol Res. 1994. V.27 P. 1507−16.
  18. В. И. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта. // Успехи Химии. 1998. Т.67 с. 641 -655.
  19. V. I., Plieva F. М. Poly (vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments. // Enz. Microb. Technol. 1998. V.23 P. 227−242.
  20. Trzmiel Т., Galas E., Fortak M. Investigations of subtilisin (Novo type) immobilization on cellulose by means of various methods of support activation. // Acta Biotechnol. 1994. V.14P. 205−209.
  21. Trzmiel Т., Fortak M., Galas E. The properties of subtilisin, Novo type, immobilized on porous glass. // Acta Biotechnol. 1995. V.15 P. 123−129.
  22. Krogh T. N., Berg Т., Hojrup P. Protein analysis using enzymes immobilized to paramagnetic beads. //Analytical Biochemistry. 1999. V.274 P. 153−162.
  23. Parrado J. Bautista J. Immobilization-Stabilization of Kerase, a Serine Protease from Streptomyces fradiae, by Covalent Attachment to Porous Glass. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. V.59 P. 906−907.
  24. Wang P., Dai S., Waezsada S. D., Tsao A. Y., Davison В. H. Enzyme stabilization by covalent binding in nanoporous sol-gel glass for nonaqueous biocatalysis. // Biotechnol Bioeng. 2001. V.74 P.249−255.
  25. Puleo D. A. Biochemical surface modification of Co-Cr-Mo. // Biomaterials. 1996. V.17 P.217−222.
  26. Mikulec L. J., Puleo D. A. Use of p-nitrophenyl chloroformate chemistry to immobilize protein on orthopedic biomaterials. // J Biomed Mater Res. 1996. V.32 P. 203−208.
  27. Holt L. J., Puleo D. A. Stability of trypsin immobilized on inorganic orthopedic biomaterials. //Art if Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 1996. V.24 P. 613−620.
  28. Chellapandian M. Preparation and characterization of alkaline protease immobilized on vermiculite. // Process Biochem. 1998. V.33 P. 169−173.
  29. Tanksale A., Chandra P. M., Rao M., Deshpande V. Immobilization of alkaline protease from Conidiobolus macrosporus for reuse and improved thermal stability. // Biotechnol. Lett. 2001. V.23P. 51−54.
  30. Ohmori T., Yang R. Y. Self-sustained pH oscillations in immobilized proteolytic enzyme systems. // Biophys Chem. 1996. V.59 P. 87−94.
  31. Abdel-Naby M. A. Ismail A.-M. S., Ahmed S. A., Abdel F., Ahmed F. Production and immobilization of alkaline protease from Bacillus mycoides. // Bioresour. Technol. 1998. V.64P. 205−210.
  32. Ge S.-J., Bai H., Zhang L.-X. Trypsin immobilization on shrimp chitin with formaldehyde and its application to continuous hydrolysis of casein. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1996. V.24 P. 1−5.
  33. Shmanai V. V., Bylina G. S. Protein immobilization on formylated polystyrene supports. // React. Funct. Polym. 2000. V.43 P. 243−251.
  34. Guisan J. M., Bastida A., Cuesta C., Fernandez-Lafuente R., Rosell C. M. Immobilization-stabilization of a-chymotrypsin by covalent attachment to aldehyde-agarose gels.//Biotechnol. Bioeng. 1991. V.38P. 1144−1152.
  35. Bryjak J. Kolarz B. N. Immobilization of trypsin on acrylic copolymers. // Process Biochem. 1998. V.33 P. 409−417.
  36. Compagnone D., O’sullivan D., Guilbault G. G. Amperometric bienzymic sensor for aspartame. // Analyst. 1997. V. 122 P. 487−90.
  37. Pyun J. C., Park J. S. Effective termination method for proteolytic reaction using trypsin immobilized on a PEI-cellulose TLC strip. // Biotechniques. 1995. V.19 P. 728−30.
  38. Mateo C., Abian O., Fernandez-Lafuente R, .Guisan J. M. Increase in conformational stability of enzymes immobilized on epoxy-activated supports by favoring additional multipoint covalent attachment. // Enzyme Microb. Technol. 2000. V.26 P. 509−515.
  39. Yiu H. H. P., Wright P. A., Botting N. P. Enzyme immobilization using SBA-15 mesoporous molecular sieves with functionalized surfaces. // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 2001.V.15 P. 81−92.
  40. Xiu G.-H., Jiang L., Li P. Mass-transfer limitations for immobilized enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemate in a batch reactor. // Ind. Eng. Chem. Res. 2000. V.39 P. 4054−4062.
  41. Silva M. A. D., Gill M. H., Guiomar A. J., Martins C., Guthrie J. T. Immobilization of chymotrypsin onto hydrolyzed poly (ethylene)-g-co-hydroxyethyl methacrylate. // J. Appl. Polym. Sci. 1990. V.41 P. 1629−1639.
  42. Bahar T., Tuncel A. Immobilization of trypsin onto newly produced poly (hydroxypropyl metharylate-co-metharylic acid) hydrogel beads. // Reactive and Functional Polymers. 2000. V.44 P. 71−78.
  43. Malmsten M., Larsson A. Immobilization of trypsin on porous glycidyl methacrylate beads: effects of polymer hydrophilization. // Colloids Surf B Biointerfaces. 2000. V.18 P. 277−284.
  44. Zacharieva E. I., Konstantinov C. I. Coated macroporous carriers with oxirane groups and their reactivity. // Biomaterials. 1993. V. l4 P. 953−7.
  45. Lorenzen P. C., Schlimme E. Characterization of trypsin immobilized on oxirane-acrylic beads for obtaining phosphopeptides from casein. // Z Ernahrungswiss. 1995. V.34 P. 118−30.
  46. Blanco R. M., Bastida A., Cuesta C., Alvaro G., Fernandez-Lafuente R., Rosell C. M., Guisan J. M. Immobilization-stabilization of proteases as a tool to improve the industrial design of peptide synthesis. // Biomed Biochim Acta. 1991. V.50 P. SI 10−3.
  47. Hailing P. J. Biocatalysis in low-water media: understanding effects of reaction conditions. // Curr Opin Chem Biol. 2000. V.4 P. 74−80.
  48. Kang E. T., Tan K. L., Kato K., Uyama Y., Ikada Y. Surface Modification and Functionalization of Polytetrafluoroethylene Films. // Macromolecules. 1996. V.29 P. 6872−6879.
  49. Kang E. T., Neoh K. G., Tan K. L., Senn B. C., Pigram P. J., Liesegang J. Surface modification and functionalization of poly (tetrafluoroethylene) films via graft copolymerization. // Polym. Adv. Technol. 1997. V.8 P. 683−692.
  50. Loh F. C., Tan K. L., Kang E. T., Kato K., Uyama Y., Ikada Y. XPS characterization of surface functionalized electroactive polymers.// Surf. Interface Anal. 1996. V.24 P.597−604.
  51. Kang E. T., Neoh K. G., Tan K. L., Loh F. C. Surface modified and functionalized polyaniline and polypyrrole films. // Synth. Met. 1997. V.84 P. 59−60.
  52. E. A., Kato K., Ivanchenko M. 1., Ikada Y. Trypsin immobilization on to polymer surface through grafted layer and its reaction with inhibitors. // Biomaterials. 1993. V.10 P. 763−769.
  53. Shimomura M., Sugiyama N., Yamauchi T., Miyauchi S. Immobilization of enzymes on poly (acrylic acid)-attached magnetite particles. // Polym. J. (Tokyo). 1998. V.30 P. 350 351.
  54. Shimomura M., Ohta M., Sugiyama N., Oshima K., Yamauchi T., Miyauchi S. Properties of a-chymotrypsin covalently immobilized on poly (acrylic acid)-grafted magnetite particles. // Polym. J. (Tokyo). 1999. V.31 P. 274−278.
  55. Kumar A., Gupta M. N. Immobilization of trypsin on an enteric polymer Eudragit S-100 for the biocatalysis of macromolecular substrate. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 1998. V.5 P. 289−294.
  56. I. Y., Mattiasson B. 'Smart' polymers and what they could do in biotechnology and medicine. // Trends Biotechnol. 1999. V.17 P. 335−40.
  57. Oh Y., Shih I. I., Tzeng Y., Wang S. Protease produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab shell wastes. // Enzyme Microb Technol. 2000. V.27 P. 3−10.
  58. Arasaratnam V., Galaev I. Y., Mattiasson B. Reversibly soluble biocatalyst: optimization of trypsin coupling to Eudragit S-100 and biocatalyst activity in soluble and precipitated forms. // Enzyme Microb. Technol. 2000. V.27 P. 254−263.
  59. Kondo A., Fukuda H. Preparation of thermo-sensitive magnetic microspheres and their application to bioprocesses. // Colloids Surfaces A: Physiochemical and engineering Aspects. 1999. V. 153 P. 435−438.
  60. Shiroya T., Tamura N., Yasui M., Fujimoto K., Kawaguchi H. Enzyme immobilization on thermosensitive hydrogel microspheres. // Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 1995. V.4 P. 267−274.
  61. Sun Y., Jin X. H., Dong X. Y., Yu K., Zhou X. Z. Immobilized chymotrypsin on reversibly precipitable polymerized liposome. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1996. V.56 P. 331−339.
  62. Koneracka M., Kopcansky P., Antalik M., Timko M., Ramchand C. N., Lobo D., Mehta R. V., Upadhyay R. V. Immobilization of proteins and enzymes to fine magnetic particles. //J. Magn. Magn. Mater. 1999. V.201 P. 427−430.
  63. Dogruel D., Williams P., Nelson R. W. Rapid tryptic mapping using enzymatically active mass spectrometer probe tips. // Anal. Chem. 1995. V.67 P. 4343−4348.
  64. Chen J. P. R., Su D. Latex particles with thermo-flocculation and magnetic properties for immobilization of alpha-chymotrypsin. // Biotechnology Prog. 2001. V.17 P. 369−375.
  65. Chen J. P., Hsu M. S. Preparations and properties of temperature-sensitive poly (N-isopropylacrylamide)-chymotrypsin conjugates. // J. Mol. Catal. B: Enzym. 1997. V.2 P. 233−241.
  66. Chen J.-P. Immobilization of a-chymotrypsin to a temperature-responsive reversibly soluble-insoluble oligomer based on N-isopropylacrylamide. // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1998. V.73 P. 137−143.
  67. Xie S., Svec F., Frechet J. M. Design of reactive porous polymer supports for high throughput bioreactors: poly (2-vinyl-4,4-dimethylazlactone-co-acrylamide- co-ethylene dimethacrylate) monoliths. // Biotechnol Bioeng. 1999. V.62 P. 30−35.
  68. Ding L., Jiang Y., Huang L., Li Y., Huang J. New supports for enzyme immobilization based on copolymers of vinylene carbonate and acrylamide. // Appl Biochem Biotechnol. 2001. V.95P. 11−21.
  69. Sagar S. L., Zanapolidou H. A., Domach M. M. Protein speciation and potential effects on membrane transport and immobilization illustrated by alpha-chymotrypsin. // Bioseparation. 1994. V.4 P. 175−82.
  70. Goldstein L., Niv A. Isonitrile derivatives of polyacrylamide as supports for the immobilization of biomoiecules. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1993. V.42 P. 19−35.
  71. Willner 1., Rubin S. Reversible photoregulation of the activities of proteins. // React. Polym. 1993. V.21 P. 177−186.
  72. Willner I., Rubin S., Shatzmiller R., Zor T. Reversible light-stimulated activation and deactivation of a-chymotrypsin by its immobilization in photoisomerizable copolymers. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. l 15 P. 8690−8694.
  73. Gonchar A. M., Auslender V. L. Immobilization of bacterial proteases on water-solved polymer by means of electron beam. // Radiat. Phys. Chem. 1996. V.48 P. 795−797.
  74. Huckel M., Wirth H. J. Hearn M. T. Porous zirconia: a new support material for enzyme immobilization. // J Biochem Biophys Methods. 1996. V.31 P. 165−79.
  75. Marshall J. J., Rabinowitz M. L. Enzyme stabilization by covalent attachment of carbohydrate. // Arch Biochem Biophys. 1975. V.167 P. 777−9.
  76. Fermi P., Biffi R., Conti V., Ramoni R., Grolli S., Accornero P., Bignetti E. Single turnover mechanism of a trypsin-reactor with high enzyme concentration. // J Biotechnol. 1998. V.60P. 81−95.
  77. Martin M. T., Sinisterra J. V., Heras A. Influence of the modification procedure of support materials on the microenvironment of immobilized a-chymotrypsin. // J. Mol. Catal. 1993. V.80 P. 127−136.
  78. Mohapatra S. C., Hsu J. T. Immobilization of a-chymotrypsin for use in batch and continuous reactors. // J. Chem. Technol. Biotechnol. 2000. V.75 P. 519−525.
  79. Huang X. L., Catignani G. L., Swaisgood H. E. Comparison of the properties of trypsin immobilized on 2 Celite derivatives. // J Biotechnol. 1997. V.53 P. 21−7.
  80. Val G. D., Swaisgood H. E., Horton H. R. Preparation and characterization of thionyl chloride-activated succinamidopropyl-glass as a covalent immobilization matrix. // J. Appl. Biochem. 1984. V.6 P. 240−250.
  81. Janolino V. G., Swaisgood H. E. Analysis and optimization of methods using water-soluble carbodiimide for immobilization of biochemicals to porous glass. // Biotechnol. Bioeng. 1982. V.24P. 1069−1080.
  82. Bonde M., Pontoppidan H., Pepper D. S. Direct dye binding—a quantitative assay for solid-phase immobilized protein. // Anal Biochem. 1992. V.200 P. 195−198.
  83. Ford J. M., Chambers R. P., Cohen W. An active-site titration method for immobilized trypsin.//Biochem. Biophys. Acta. 1973. V.309 P. 175−180.
  84. Clark D. S. Can immobilization be exploited to modify enzyme activity? // Trends Biotechnol. 1994. V.12 P. 439−43.
  85. Turner D. C., Testoff M. A., Conrad D. W., Gaber B. P. Enzymatic Hydrolysis of a Chemisorbed Peptide Film Using Beads Activated with Covalently Bound Chymotrypsin. // Langmuir. 1997. V.13 P. 4855−4860.
  86. Ganapathy R., Sarmadi M., Denes F. Immobilization of alpha-chymotrypsin on oxygen-RF-plasma functionalized PET and PP surfaces. // J Biomater Sci Polym Ed. 1998. V.9 P. 389−404.
  87. Ganapathy R., Manolache S., Sarmadi M., Simonsick W. J. J., Denes F. Immobilization of active a-chymotrypsin on RF-plasma-functionalized polymer surfaces. // J. Appl. Polym. Sci. 2000. V.78 P. 1783−1796.
  88. Martinez A. J., Manolache S., Gonzalez V., Young R. A., Denes F. Immobilized biomolecules on plasma functionalized cellophane. I. Covalently attached alpha-chymotrypsin. // J Biomater Sci Polym Ed. 2000. V. l 1 P. 415−438.
  89. Tao G., Furusaki S. Synthesis of porous polymer carrier and immobilization of a-chymotrypsin. // Polym. J. (Tokyo). 1995. V.27 P. 111−121.
  90. Leemputten E., Horisberger M. Immobilization of trypsin on partially oxidized cellulose. //Biotechnol. Bioeng. 1974. V.16 P. 997−1003.
  91. Chen L., Tsao G. T. Chemical procedures for enzyme immobilization on porous cellulose beads. // Biotechnol. Bioeng. 1974. V. l9 P. 1463−1473.
  92. Kay G., Lilly M. D. The chemical attachment of chymotrypsin to water-insoluble polymers using 2-amino-4,6-dichloro-s-triazine. // Biochem. Biophys. Acta. 1978. V. l98 P. 276−285.
  93. Habeeb A. F. Preparation of enzymatically active, water insoluble derivates of trypsin. // Arch. Biochem. Biophys. 1967. V. l 19 P. 264−268.
  94. Hailing P. J., Duhnil P. Magnetic supports for immobilized enzyme and bioaffinity adsorbents. // Enz. Microb. Technol. 1980. V.2 P. 2−10.
  95. Bode W., Papamolcos E., Musil J. The high-resolution X-ray crystal structure of the complex formed between subtilisin Carlsberg and eglin c, an elastase inhibitor from the leech Hirudo medicinalis. // Eur. J. Biochem. 1987. V. 166 P. 673−692.
  96. Bryan P. N. Protein engineering of subtilisin. // Biochim Biophys Acta. 2000. V.1543 P. 203−222.
  97. И. В., Мартинек К. М., Антонов В. К. Иммобилизованные ферменты. // Москва. Изд-во Московского Университета. 1976. Т. 2.
  98. Mansfeld J., Ulbrich-Hofmann R. Site-specific and random immobilization of thermolysin-like proteases reflected in the thermal inactivation kinetics. // Biotechnol. Appl. Biochem. 2000. V.32 P. 189−195.
  99. Huang W., Wang J., Bhattacharyya D., Bachas L. G. Improving the activity of immobilized subtilisin by site-specific attachment to surfaces. // Anal Chem. 1997. V.69 P. 4601−4607.
  100. Vishwanath S., Bhattacharyya D., Huang W., Bachas L. G. Site-directed and random immobilization on functionalized membranes: kinetic studies and models. // J.Membr. Sci. 1995. V.108 P. 1−13.
  101. Vishwanath S., Watson C. R., Huang W., Bachas L. G., Bhattacharyya D. Kinetic studies of site-specific and randomly immobilized alkaline phosphatase on functionalized membranes. // J.Chem.Technol.Biotechnol. 1997. V.68 P. 294−302.
  102. Wang J., Bhattacharyya D., Bachas L. G. Improving the activity of immobilized subtilisin by site-directed attachment through a genetically engineered affinity tag. // Fresenius J Anal Chem. 2001. V.369 P. 280−285.
  103. Turkova J. Oriented immobilization of biologically active proteins as a tool for revealing protein interactions and function. // J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 1999. V.722 P. 1131.
  104. Gill I., Ballesteros A. Bioencapsulation within synthetic polymers (Part 1): sol-gel encapsulated biologicals. // Trends Biotechnol. 2000. V.18 P. 282−96.
  105. Tischer W., Kasche V. Immobilized enzymes: crystals or carriers? // Trends Biotechnol. 1999. V. 17 P. 326−35.
  106. Hinze W. L., Uemasu I., Dai F., Braun J. M. Analytical and related applications of organogels. // Current Opinion in Colloid & Interface Science. 1996. V. l P. 502−513.
  107. Topchieva I. N., Efremova N. V. Conjugates of proteins with block co-polymers of ethylene and propylene oxides. // Biotechnol Genet Eng Rev. 1994. V.12 P. 357−82.
  108. Wang P., Sergeeva M. V., Lim L., Dordick J. S. Biocatalytic plastics as active and stable materials for biotransformations. //Nat Biotechnol. 1997. V.15 P. 789−93.
  109. Michels P. C., Khmelnitsky Y. L., Dordick J. S., Clark D. S. Combinatorial biocatalysis: a natural approach to drug discovery. // Trends Biotechnol. 1998. V.16 P. 210−215.
  110. Dordick J. S., Khmelnitsky Y. L., Sergeeva M. V. The evolution of biotransformation technologies.//CurrOpin Microbiol. 1998. V. l P. 311−8.
  111. Novick S. J., Dordick J. S. Preparation of active and stable biocatalytic hydrogels for use in selective transformations. // Chem. Mater. 1998. V.10 P. 955−958.
  112. Novick S. J., Dordick J. S. Investigating the effects of polymer chemistry on activity of biocatalytic plastic materials. // Biotechnol. Bioeng. 2000. V.68 P. 665−671.
  113. Yang Z., Mesiano A. J. Venkatasubramanian S., Gross S. H., Harris J. M., Russell A. J. Activity and Stability of Enzymes Incorporated into Acrylic Polymers. // J. Amer .Chem. Soc. 1995. V. l 17 P. 4843−4850.
  114. Brummer W., Hennrich N., Klockow M., Lang H., Orth H. D. Preparation and properties of carrier-bound enzymes. // Eur J Biochem. 1972. V.25 P. 129−35.
  115. Van Unen D. J., Engbersen J. F., Reinhoudt D. N. Sol-gel immobilization of serine proteases for application in organic solvents. // Biotechnol Bioeng. 2001. V.75 P. 154−8.
  116. Gill I., Ballesteros A. Bioencapsulation within synthetic polymers (Part 2): non-sol-gel protein-polymer biocomposites. // Trends Biotechnol. 2000. V.18 P. 469−79.
  117. Kim Y., Dordick J., Clark D. Siloxane-based biocatalytic films and paints for use as reactive coatings. // Biotechnol Bioeng. 2001. V.72 P. 475−82.
  118. Reslow M., Adlercreutz P., Mattiasson B. On the importance of support material for bioorganic synthesis. // Eur. J. Biochem. 1988. V.172 P. 573−578.
  119. Blanco R. M., Guisan J. M., Hailing P. J. Agarose-chymotrypsin as a catalyst for peptide and amino acid ester synthesis in organic media. // Biotechnol. Lett. 1989. V. ll P. 811 816.
  120. Narayan V. S., Klibanov A. M. Are water-immiscibility and apolarity of the solvent relevant to enzyme efficiency? // Biotechnol. Bioeng. 1993. V.41 P. 390−393.
  121. Lozano P., Diego T. D., Belleville M. P., Rios G. M., Iborra J. L. A dynamic membrane reactor with immobilized chymotrypsin for continuous kyotorphin synthesis in organic media. // Biotechnology Letters. 2000. V.22 P. 771−775.
  122. Blanco R. M., Rakels J. L., Guisan J. M., Hailing P. J. Effect of thermodynamic water activity on amino-acid ester synthesis catalyzed by agarose-chymotrypsin in 3-pentanone. // Biochim Biophys Acta. 1992. V. l 156 P. 67−70.
  123. Ueno Y., Morihara K. The use of immobilized trypsin for semisynthesis of human insulin. //Biotechnol. Bioeng. 1989. V.33 P. 126−128.
  124. Valivety R. H., Hailing P. J., Peilow A. D., Macrae A. R. Relation between water activity and catalytic activity of lipases in organic media. // Eur. J. Biochem. 1994. V.222 P. 461 466.
  125. Klibanov A. M. Asymmetric transformations catalyzed by enzymes in organic solvents. // Acc. Chem. Res. 1990. V.23 P. 114−120.
  126. Griebenow K., Klibanov A. M. Can conformational changes be responsible for solvent and excipient effects on the catalytic behavior of subtilisin Carlsberg in organic solvents? // Biotech. Bioeng. 1997. V.53 P. 351 362.
  127. Gorman L. S., Dordick J. S. Organic solvents strip water off enzymes. // Biotechnol. Bioeng. 1992. V.39 P. 392−397.
  128. Wangikar P. P., Carmichael D., Clark D. S., Dordick J. S. Active-site titration of serine proteases in organic solvents. // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.50 P. 329−335.
  129. Clapes P., Adlercreutz P., Mattiasson B. Enzymatic peptide synthesis in organic media: a comparative study of water-iniscible and water-immiscible solvent systems. // J. Biotechnol. 1990. V.15 P. 323−338.
  130. Clapes P., Adlercreutz P., Mattiasson B. Enzymatic peptide synthesis in organic media. Nucleophile specificity and medium engineering in a-chymotrypsin catalyzed reactions. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1990. V.12 P. 376−386.
  131. Klibanov A. M. Improving enzymes by using them in organic solvents. // Nature. 2001. V.409P. 241−246.
  132. Ampon K., Salleh A. B., Teoh A., Yunus W. M. Z. V., Razak C. N. A., Basri M. Sugar esterification catalyzed by alkylated trypsin in dimethylformamide. // Biotechnol. Lett. 1991. V.13 P. 25−30.
  133. Sakurai K., Kashimoto K., Kodera Y., Inada Y. Solid phase synthesis of peptides with polyethylene glycol-modified protease in organic solvents. // Biotechnol Lett. 1990. V.12 P. 685−688.
  134. Wong C.-H. Enzymatic catalysts in organic synthesis. // Science. 1989. V.244 P. 1145−52.
  135. Arnold F. H. Engineering enzymes for non-aqueous solvents. // Trends Biotechnol. 1990. V.8 P. 244−9.
  136. Kidd R. D., Yennawar H. P., Sears P., Wong C.-H., Farber G. K. A Weak Calcium Binding Site in Subtilisin BPN' Has a Dramatic Effect on protein Stability. // J. Am. Chem. Soc. 1996. V.118P. 1645−1650.
  137. Wong C.-H. Engineering enzymes for chemoenzymatic synthesis. Part 2: Modifying proteases for peptide synthesis. // Trends Biotechnol. 1992. V.10 P. 378−81.
  138. Haring D., Shreier P. Novel Biocatalysts by Chemical Modification of Known Enzymes: Cross-Linked Microcrystals of the Semisynthetic Peroxidase Seleno-Subtilisin Publication. //Angew. Chem. 1998. V.37 P. 2628 -2631.
  139. Wang Y.-F., Yakovlevsky J. K., Zhang В., Margolin A. L. Cross-Linked Crystals of Subtilisin: Versatile Catalyst for Organic Synthesis. // J. Org. Chem. 1997. V.62 P. 34 883 495.
  140. Sears P., Witte K., Wong C.-H. The effect of counterion, water concentration, and stirring on the stability of subtilisin BPN' in organic solvents. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 1999. V.6P. 297−304.
  141. Schulze В., Klibanov A. M. Subtilisins in neat organic solvents. // Biotechnol. Bioeng. 1991. V.38 P. 1001−1006.
  142. А. К., Левашов А. В. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями. // Биохимия. 1998. Т.63 С. 408−421.
  143. Meyer J. D., Kendrick В. S., Matsuura J. E., Ruth J. A., Bryan P. N., Manning M. C. Generation of soluble and active subtilisin and a-chymotrypsin in organic solvents via hydrophobic ion pairing. /V Int. J. Peptide Protein Res. 1996. V.47 P. 177−181.
  144. Getun I. V., Filippova 1. Y., Lysogorskaya E. N., Oksenoit E. S. SDS-subtilisin catalyzed synthesis of tetra-peptides containing multifunctional amino acids in ethanol. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 2001. V. 15 P. 105−110.
  145. Gololobov M. Y., Stepanov V. M., Voyushina T. L., Morozova 1. P., Adlercreutz P. Side reactions in enzymatic peptide synthesis in organic media: effects of enzyme, solvent, and substrate concentrations. // Enzyme Microb Technol. 1994. V.6 P. 522−8.
  146. Stepanov V. M., Terent’eva E. Y., Voyushina T. L., Gololobov M. Y. Subtilisin and a-chymotrypsin catalyzed synthesis of peptides containing arginine and lysine p-nitroanilides as c-terminal moietes. // Bioorg. Med. Chem. 1995. V.3 P. 479−485.
  147. Terent’eva E. Y., Voyushina T. L., Stepanov V. M. Enzymatic synthesis of YIGSR -Laminin pentapeptide i’ragment derivatives. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995. V.5 P. 2523−2526.
  148. Gill I., Lopez-Fandino R., Jorba X., Vulfson E. N. Biologically active peptides and enzymatic approaches to their production. // Enzyme Microb Technol. 1996. V.18 P. 16 383.
  149. Dordick J. S. Enzymatic catalysis in monophasic organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1989. V. l 1 P. 194−211.
  150. Dordick J. S. Designing enzymes for use in organic solvents. // Biotechnol. Prog. 1992. V.8 P. 259−267.
  151. Kuhn P., Knapp M., Soltis S. M., Ganshaw G., Thoene M., Bott R. The 0.78 A structure of a serine protease: Bacillus lentus subtilisin. // Biochemistry. 1998. V.37 P. 1 344 613 452.
  152. В. X., Беляиова Jl. П., Баратова Л. А., Степанов В. М. Субтилизин 72-сериновая протеиназа Bacillus subtilis штамм 72, близкая субтилизину Карлсберг. // Биохимия. 1979. Т.44 С. 886−891.
  153. Stepanov V. M. Proteinases as catalysts in peptide synthesis. // Pure & Appl. Chem. 1996. V.68 P. 1335.
  154. Т. Л., Люблинская Л. А., Степанов В. М. Синтез пептидов, катализируемый сериновыми протеиназами. Применение эфиров ацилпептидов в качестве карбоксильных компонентов. // Биоорг. химия. 1985. T. l 1 с. 738−744.
  155. Morihara К., Oka Т. Peptide bond synthesis catalyzed by subtilisin, papain, and pepsin. // J. Biochem. (Tokyo). 1981. V.89P. 385−390.
  156. Gron H., Meldal M., Breddam К. Extensive comparison of the substrate preferences of two subtilisins as determined with peptide substrates which are based on the principle of intramolecular quenching.//Biochemistry. 1992. V.31 P. 6011−6018.
  157. Vakurov A. V., Gladilin A. K., Levashov A. V., Khmelnitsky Y. L. Dry enzyme-polymer complexes: stable organosoluble biocatalysts for nonaqueous enzymology. // Biotechnology Letters. 1994. V.16P. 175−178.
  158. В. А., Мустафаев В. И. Влияние ионной силы и рН среды на поведение БСА с поли-4-винил-Ы-этилпиридинийбромидом в водных растворах. // ВМС. 1981. Т.23 С. 255−260.
  159. В. А. Зезин А. Б., Кабанов В. А. Макромолекулярный обмен в растворах комплексов глобулярных белков с неприродными полиэлектролитами. // ДАН СССР. 1984. Т.275 С. 168−172
  160. В. А., Зезип А. Б., Кабанов В. А. Кинетика макромолекулярного обмена в растворах комплексов глобулярных белков с полиэлектролитами. // ДАН СССР. 1984. Т.291 С. 1150−1154.
  161. В. А., Марголин A. JI., Зезин А. Б., Кабанов В. А. Свойства нестехиометричных полиэлектролитных комплексов, содержащих фермент. // ДАН СССР. 1982. Т.269С. 15−22
  162. Xia J., Dubin P. L., in Macromolecular complexes in Chemistry and Biology, P.L. Dubin, R.M. Davies, D.N. Schultz, C. Thies, Eds. 1994: Berlin, Heidelberg, p. 247−270.
  163. J. В., Mekras С. I. The effect of polycations on the activity of pepsin. // J Pharm Pharmacol. 1985. V.37 P. 396−400.
  164. С. I., Lawton J. В., Washington R. J. The interaction of papain with polycations. //J Pharm Pharmacol. 1989. V.41 P. 22−6.
  165. Mekras С. I. Inhibition of pepsin by polyions and c.d. studies. // Int. J. Biol. Macromol. 1989. V. ll P. 207−215.
  166. Mellgren R. L. Interaction of human erythrocyte multicatalytic proteinase with polycations. //Biochim Biophys Acta. 1990. V.1040 P. 28−34.
  167. С. В. Модифицированные субтилизины в сегментной конденсации пептидов. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва. 1999.
  168. Mcphalen С. A., James М. N. G. Structural comparison of tow serin proteinase-protein inhibitor complexes: eglin-c-subtilisin Carlsberg and CI-2-subtilisin Novo. // Biochemistry. 1988. V.27 P. 6582−6598.
  169. M., Морозова И. П., Воюшина Т. JI., Тимохина Е. А., Степанов В. М. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы из Bacillus subtilis штамм 72. // Биохимия. 1991. Т.56 С. 230 239.
  170. В. И., Плиева Ф. М., Зубов А. Л. // Биотехнология. 1995 Т. С. 32−37.
  171. P. A., Steinmetz А. С. U., Ringe D., Klibanov А. М. Enzyme crystal structure in a neat organic solvent. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90 P. 8653−8657.
  172. Schmitke J. L., Stern L. J., Klibanov A. M. The crystal structure of subtilisin Carlsberg in anhydrous dioxane and its comparison with those in water and acetonitrile. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94 P. 4250−4255.
  173. Schmitke J. L., Stem L. J., Klibanov A. M. Comparison of x-ray structures of an acyl-enzyme intermediate of subtilisin Carlsberg formed in anhydrous acetonitrile and in water.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V.95 P. 12 918−12 923.
  174. Cerovsky V., Jakubke H.-D. Acyl transfer reactions catalyzed by native and modified a-chymotrypsin in acetonitrile with low water content. // Enzyme Microb. Technol. 1994. V.16P. 596−600.
  175. Voyushina T. L., Potetinova J. V., Milgotina E. I., Stepanov V. M. Synthesis of peptide aldehydes via enzymatic acylation of amino aldehyde derivatives. // Bioorg Med Chem. 1999. V.7 P. 2953−9.
  176. Milgotina E. I, Shcheglov A. S., Lapa G. B., Chestukhina G. G., Voyushina T. L. Enzymatic synthesis of chromogenic substrates for Glu, Asp-specific proteinases. // J Pept Res. 2001. V.58P. 12−6.
  177. Klibanov A. M. Why are enzymes less active in organic solvents than in water? // Trends Biotechnol. 1997. V.15 P. 97−101.
  178. Fruton J. Protease-catalyzed synthesis of peptide bonds. // Adv. Enzymol. 1982. V.53 P. 239−306.
  179. Hailing P. J. Thermodynamic predictions for biocatalysis in nonconventional media: theory, tests, and recommendations for experimental design and analysis. // Enzyme Microb. Technol. 1994. V.16 P. 178−206.
  180. Barbas C. F., Matos J. R., West J. B., Wong C.-H. A search for peptide ligase: cosolvent-mediated conversion of proteases to esterases for irreversible synthesis of peptides. // J. Am. Chem. Soc. 1988. V. l 10 P. 5162−5166.
  181. Shechter J., Berger A. Size of the active site in proteinases. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967. V.27P. 157−162.
  182. И. В., Филиппова И., Лысогорская Е. Н., Колобанова С. В., Оксенойт Е. С., Анисимова В. В., Степанов В. М. Синтез три-и тетраиеитидов, катализируемый субтилизином в органических растворителях. // Биоорганическая Химия. 1998. Т.24 С. 306−312.
  183. А., Форд Р. Спутник химика. // Москва. Мир. 1976.
  184. А. А., Кибирев В. К. Химический синтез пептидов. //Киев. Наукова Думка. 1992.
  185. Filippova I. Yu., Lysogorskaya Е. N., Anisimova V. V., Suvorov L. I., Oksenoit E. S., Stepanov V. M. Fluorogenic peptide substrates for assay of aspartyl proteinases. // Anal. Biochem. 1996. V.234. P. 113−118.
  186. И., Лысогорская E. H., Оксенойт Е. С., Комаров Ю. Е., Степанов В. М. Флуоресцентные субстраты аспартильных протеиназ с внутренним тушением флуоресценции. Биоорг. химия. 1986. Т. 12 С. 1172−1180.
  187. Патент РФ- А. С. // Бюллетень Изобрет. 1995. Т.15.
  188. Л. А., Хайду И., Баландина Г. Н., Филиппова И., Маркарян А. Н., Лысогорская Е. Н., Оксенойт Е. С., Степанов В. М. и-Нитроанилиды пироглутамилпептидов хромогенные субстраты сериновых протеиназ. // Биоорг. химия. 1987. Т.13 С. 748−753.
  189. Schonbaum G. R., Zerner В., Bender М. L. Mechanism of action of proteolytic enzymes. VIII. Spectrophotometric determination of the operational normality of an chymotrypsin solution. // J. Biol. Chem. 1961 P. 2930−2935.
Заполнить форму текущей работой

На отлично!