Изучение интерактома протеинкиназы MAK-V с целью характеризации ее функциональных свойств

Протеинкиназы представляют собой одно из крупнейших суперсемейств эукариотических белков. Они ф о с фор ил и ру ют белковый субстрат, катализируя перенос у-фосфата с АТР на гидроксильную группу остатков серина, треонина или тирозина. Такая модификация может изменять ферментативную активность белка-субстрата, его внутриклеточную локализацию или взаимодействие с другими белками. Протеинкиназы являются медиаторами большинства сигнальных путей в эукариотической клетке и контролируют многие клеточные процессы, включая метаболизм, транскрипцию, прогрессию клеточного цикла, перестройку цитоскелега, клеточную подвижность, дифференцировку и апоптоз. Они играют ключевую роль в межклеточной коммуникации во время эмбрионального развития, в поддержании гомеостаза, в функционировании нервной и иммунной систем. Протеинкиназы индуцируют и поддерживают механизм долговременной потенциации синаптической передачи, лежащей в основе памяти и обучения.

Из 518 генов протеинкиназ человека почти половина картируется в локусах хромосом, ассоциированных с различными заболеваниями. Мутации и нарушение регуляции протеинкиназ напрямую связаны с развитием многих болезней, в том числе и онкологических. Модулирование активности протеинкиназ с помощью специфических ингибиторов и активаторов является одним из подходов к терапии этих заболеваний. Ключевая роль протеинкиназ во всех аспектах клеточной физиологии и их участие в патологических процессах объясняет большой интерес к изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе регуляции и функционирования этой группы ферментов.

Протеинкиназа MAK-V относится к семейству АМРК-иодобных серин-треониновых протеинкиназ, многие представители которого выполняют высококонсервативные функции во всех эукариотических организмах, от дрожжей до человека. Однако на сегодняшний день протеинкиназа MAK.-V является одним из наименее изученных представителей семейства АМРК-иодобных протеинкиназ. При этом остаются практически неизвестными механизмы регуляции протеинкиназы MAK-V, ее мишени и молекулярные процессы, в которых она принимает участие. Принимая во внимание не вызывающую сомнений ключевую роль протеинкиназ в регуляции клеточных процессов, исследование свойств и функций протеинкиназы MAK-V является актуальным и представляет несомненный интерес.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Основные результаты работы получены автором лично или при его непосредственном участии. Масс-спектрометрический анализ белков проведен Р. Х. Зиганшиным (ИБХ РАН, г. Москва). Биохимическое фракционирование клеток РС12ТеЮп с индуцированной экспрессией протеинкиназы MAK-V мыши и анализ ее мембранной локализации в дрожжах выполнен совместно с И. В. Коробко. Иммунофлуоресцентный анализ колокализации синаптоподина и протеинкиназы MAK-V в клетках линии NCI-H1299 проведен И. В. Коробко. Фракция периферических мембран клеток головного мозга мыши были получена П. Н. Вихревой (ИБГ РАН, г. Москва). Получение клонов клеток PC12TetOn, продуцирующих микроРНК к гену Nedd4 крысы и контрольную микроРНК, проводилось при участии И. В. Коробко. Эксперименты по трансляции мРНК генов mak-v и Nedd4 в эмбрионах X. laevis выполнены Кейджи Ито (Mount Sinai School of Medicine, г. Нью-Йорк, США) с использованием предоставленных автором плазмидных конструкций и планом эксперимента. Имена соавторов приведены в соответствующих публикациях.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю И. В. Коробко за чуткое руководство, за неоценимые научные и практические советы, а также за критическое чтение диссертации;

С.Ю. Соколу (Mount Sinai School of Medicine, г. Нью-Йорк, США) за организацию экспериментов с эмбрионами лягушки, позволивших выявить функциональность взаимодействия белков MAK-V и Nedd4;

Р.Х. Зиганшину (ИБХ РАН, г. Москва) за проведение масс-спектрометрического анализаЕ.В. Коробко и Е. Ю. Лысюк (ИБГ РАН, г. Москва) за помощь в работе с культурами клетока также всем сотрудникам Отдела генной терапии рака ИБГ РАН за моральную поддержку, помощь в работе, теплую и дружескую атмосферу в коллективе.

6.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В работе был" изучены некоторые функциональные связи протеинкиназы MAK-V в клетке. При этом были исследованы возможные механизмы анти-апоптотической активности MAK-V, проанализирована ее внутриклеточная локализация и предпринят поиск белков — партнеров, но взаимодействию с последующим анализом функциональных следствий выявленных взаимодействий.

Анализ молекулярных событий, которые могли бы опосредовать анти-аиоптотическую активность протеинкиназы MAK-V в клетках РС12ТеЮп при их контакте с коллагеном IV, выявил отсутствие влияния MAK-V на статус фосфорилирования кофилина 1 и уровень активации сигнальных путей протеинкиназ Akt и ERK½. Полученные данные свидетельствуют о том, что анти-апоптотическая активность MAK-V в этих клетках проявляется через воздействие на другие молекулярные события. Выявление сигнальных каскадов, регулирующих возникновение, рост и развитие опухоли, имеет большую практическую ценность для терапии онкологических заболеваний. Полученные нами результаты способствуют дальнейшему изучению роли MAK-V в канцерогенезе и направляют внимание на другие возможные механизмы анти-апоптотической активности протеинкиназы MAK-V, например, па регуляцию экспрессии гена одной из матриксных мегаллопротеиназ.

Изменение внутриклеточной локализации протеинкиназ является одним из способов регуляции их активности. В данной работе было обнаружено, что значительная часть клеточного пула эндогенного белка MAK-V локализована на мембране. Анализ первичной структуры выявил в каталитическом домене белка MAK-V сайт связывания с фосфатидилинозитол-(4,5)-бифосфатом. Можно предположить, что эта последовательность опосредует взаимодействие протеинкиназы MAK-V с мембраной. Кроме того, была продемонстрирована зависимость мембранной локализации белка MAK-V от присутствия убиквитин-ассоциированного домена, регулирующего каталитическую активность и внутриклеточную локализацию других АМРК-иодобных протеинкиназ. Выявленная ассоциация белка MAK-V с мембранами может обеспечивать корректную локализацию относительно субстрата и указывает на один из возможных способов регуляции протеинкиназной активности MAK-V посредством пространственного контроля.

В работе было впервые обнаружено взаимодействие протеинкиназы MAK-V с синаптоподином. Анализируя профили экспрессии генов mak-v и Synpo, можно предположить функциональную связь протеинкиназы MAK-V и синаптоподина в головном мозге. Опубликованные ранее данные свидетельствуют о возможной роли протеинкиназы MAK-V в регуляции эндоцитоза и функционировании синапсов, а анализ хромосомной локализации гена mak-v выявил его возможную ассоциацию с шизофренией, аутизмом и фенотипическими проявлениями синдрома Дауна. Синаптоподин ассоциирован с шиииковым аппаратом дендритных шипиков и регулирует формирование долговременной потенциации, лежащей в основе памяти и обучения. Обнаруженное в работе взаимодействие протеинкиназы MAK-V и синаитоподина может иметь регуляториое значение и определять локализацию MAK-V на шипиковым аппарате. С другой стороны, MAK-V потенциально может фосфорилировагь и предотвращать деградацию синаптоподина, способствуя формированию долговременной потенциации. Полученные результаты открывают дальнейшие перспективы для изучения роли протеинкиназы MAK.-V в головном мозге в свете ее возможного участия в функционировании синапсов, процессах памяти, обучения, интеллектуального развития.

В работе было впервые выявлено взаимодействие протеинкиназы MAK-V и убиквитин-лигазы Nedd4 и установлена его функциональность. В процессе изучения этого взаимодействия было показано, что уровень белка MAK-V контролируется в клетке путем протеасомной деградации, однако Nedd4 не является убиквитин-лигазой протеинкиназы MAK-V и не влияет на ее стабильность. Nedd4 регулирует функции MAK-V независимо от убиквитин-лигазной активности. Установленное влияние Nedd4 на MAK-V вместе с ранее выявленной регуляторной ролыо MAK-V в Wnt сигнальном пути впервые свидетельствует о роли в этом сигнальном пути убиквитин-лигазы Ncdd4. Более того, поскольку убиквитин-лигаза Nedd4 вовлечена в регуляцию Notch и IGF-R1 сигнальных путей, обнаруженная взаимосвязь служит основой для интеграции не только этих сигнальных путей, но и, в дополнение к ним, Wnt сигнального пути через взаимодействие между Nedd4 и MAK-V.

Полученные в работе результаты существенно расширяют наши представления о регуляции и функциональных связях протеинкиназы MAK-V и открывают перспективы для дальнейшего изучения роли MAK-V в клетке и в организме. Это, в свою очередь, является необходимой предпосылкой для установления роли протеинкиназы MAK-V в патологических процессах в организме, что абсолютно необходимо для валидации MAK.-V как молекулярной мишени для терапии и, в конечном итоге, для разработки новых стратегий лечения заболеваний человека, в которых протеинкиназа MAK-V может играть существенную роль, в частности, онкологических заболеваний.