/л-[р-аминоэтилэфир]-К, Ы, К', М'-тетрауксусная кислота- HEPES — К-[2-гидроксиэтил]пиперазин-М' - этансульфоновая кислота- Н-мтДНК — «тяжелая» митохондриальная ДНК- kbp — тысяча пар оснований ДНК- MNA — methylnadic anhydrid.
В настоящее время изучение процессов запрограммированной гибели клеток (апоптоза) представляет собой одно из наиболее интенсивно развивающихся направлений современной молекулярной биологии. Подобно животным, эмбриогенез и другие ранние этапы онтогенеза у растений сопровождаются запрограммированной гибелью отдельных клеток и тканей [СгеепЬе^, 1996; Ванюшин, 2001]. Однако, объектом большинства проводящихся исследований являются клетки животных. Сравнительно недавно было установлено, что по некоторым морфологическим и биохимическим данным, запрограммированная гибель клеток растений и животных во многом схожи. Это связано с эволюционной консервативностью процесса апоптоза, в частности, с экспрессией ряда сходных генов, контролирующих апоптоз как в растительных, так и в животных клетках. Однако, до настоящего времени единая картина последовательности биохимических и морфологических событий происходящих в растительной клетке в процессе апоптоза не установлена.
Запуск механизмов запрограммированной клеточной гибели часто связан с процессами, происходящими в митохондриях. В частности, одним из пусковых механизмов апоптоза может служить выход из митохондрий ряда апоптогенных белков, активирующих протеолитический каскад. Важным биохимическим маркером апоптоза служит межнуклеосомная фрагментация ядерной ДНК.
Значительную роль в активации процессов апоптоза играет окислительный статус клетки. Протекание многих форм клеточной гибели сопровождается генерацией активных форм кислорода (АФК). В связи с этим особый интерес представляет изучить возможное модулирование запрограммированной гибели клеток с помощью экзогенных антиоксидантов и прооксидантов.
Одной из возможных моделей для изучения индуцированного и естественного апоптоза при нормальном онтогенезе являются проростки пшеницы, характеризующиеся относительно синхронным развитием клеток в таких органах, как колеоптиль и первый лист. Эта модель уникальна тем, что в терминах синтеза ДНК она позволяет рассматривать целый интактный растительный организм практически, как одну клетку. Кроме того, колеоптиль является примером органа со строго ограниченной продолжительностью жизни и может служить моделью для изучения молекулярных, в том числе пусковых, механизмов запрограммированной гибели клеток у растений.
Целью настоящей работы являлось исследовать ультраструктурные и биохимические особенности интактных растительных тканей в онтогенезе и под влиянием антиоксиданта ВНТ (ионола) и перекисей на модели проростков пшеницы.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
АПОПТОЗ У РАСТЕНИЙ.
выводы.
1. Установлено, что развитие этиолированных проростков пшеницы сопровождается выраженным апоптозом в колеоптиле и первом листе. Впервые сформирована структурно-морфологическая картина апоптоза в тканях интактного растения: в стареющем колеоптиле и первом листе апоптоз сопровождается конденсацией и маргинацией хроматина в ядре, межнуклеосомной фрагментацией ядерной ДНК, конденсацией и реорганизацией цитоплазмы.
2. Впервые в растительных клетках обнаружены особые вакуолярные везикулы, содержащие цитоплазму и клеточные органеллы. Эти везикулы были выделены впервые. Установлено, что именно в этих структурах происходит интенсивный синтез митохондриальной ДНК при апоптозе.
3. Обнаружено, что антиоксиданты и перекиси модулируют апоптоз у этиолированных проростков пшеницы. Антиоксидант ВНТ (ионол) предупреждает появление характерных признаков старения и апоптоза: в колеоптиле ВНТ полностью блокирует апоптозную фрагментацию ядерной ДНК и образование характерных цитоплазматических везикул с активными реплицирующими мтДНК митохондриями. Действие ВНТ тканеспецифично. В противоположность ВНТ, перекиси резко усиливают апоптозную фрагментацию ядерной ДНК в колеоптиле и индуцируют ее в первом листе.
4. Найдено, что ВНТ вызывает выраженные структурные изменения в организации органелл клетки (ядро, митохондрии, пластиды, аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум) и нарушает деление клеток и ядер. Показано, что ВНТ индуцирует образование и дифференцировку пластид в корнях этиолированных проростков пшеницы: под влиянием этого антиоксиданта в клетках корня развиваются хлоропласта. ВНТ индуцирует образование неизвестных ранее необычных мембранных структур в цитоплазме растительной клетки.
5. Множественное действие ВНТ, очевидно, обусловлено тем, что он модулирует уровень активных форм кислорода в апоптозных клетках.
.
Развитие этиолированных проростков пшеницы сопровождается апоптозом в тканях колеоптиля и первого листа. Таким образом, апоптоз является обязательной интегральной составляющей онтогенеза растений, в том числе — и на самых ранних этапах их развития (проросток). В проростках пшеницы апоптоз сопровождается конденсацией и маргинацией хроматина, межнуклеосомной фрагментацией ядерной ДНК и появлением в вакуолях клеток необычных, содержащих митохондрии, цитоплазматических везикул. Фрагментация цитоплазмы с образованием необычных цитоплазматических везикул, содержащих митохондрии и (или) пластиды в апикальной зоне колеоптиля и первого листа этиолированных проростков пшеницы предшествует апоптозной фрагментации ядерной ДНК и усиленному синтезу Н-мтДНК. Установлено, что усиленный, характерный для апоптоза, синтез Н-мтДНК локализован именно в этой особой фракции везикул. В клетках колеоптиля и первого листа, содержащих необычные цитоплазматические везикулы, отчетливо наблюдаются конденсация и маргинация ядерного хроматина и конденсация цитоплазмы. Межнуклеосомная фрагментация ДНК и образование содержащих митохондрии цитоплазматических везикул могут модулироваться при помощи антии прооксидантов. Антиоксидант ВНТ (ионол) ингибирует апоптоз в клетках колеоптиля и, вероятно, даже несколько стимулирует его в клетках первого листа этиолированных проростков пшеницы. Таким образом, действие антиоксиданта ВНТ тканеспецифично: в разных органах этиолированных проростков пшеницы ВНТ способен действовать как в качестве анти-, так и, по-видимому, в качестве прооксиданта. Такая разнокачественность воздействия ВНТ обусловлена, скорее всего, различным количественным содержанием молекулярного кислорода в разных тканях этиолированных проростков. Ингибирование процесса апоптоза под действием ВНТ в клетках колеоптиля выражается, в частности, в отсутствии в вакуолях клеток содержащих митохондрии цитоплазматических везикул и межнуклеосомной фрагментации ядерной ДНК. ВНТ вызывает существенные ультраструктурные изменения в организации большинства субклеточных структур и нарушает клеточное деление в клетках колеоптиля и корня. В присутствии ВНТ нарушается формирование клеточных стенок (возникают многоядерные клетки), и деление ядер (в результате образуются гигантские многолопастные ядра). Показано, что в корнях этиолированных проростков пшеницы антиоксидант ВНТ индуцирует образование и дифференцировку пластид. Эти органеллы не свойственны корням вообще, а корням этиолированных растений — в особенности. В корнях контрольных проростков, выросших без ВНТ, они никогда не наблюдаются. Оксиданты (Н2О2, гидроксиперекись кумола) стимулируют апоптоз (фрагментацию ДНК) в колеоптиле и индуцируют его в клетках первого листа, в то время как в листе у контрольных проростков он еще совсем не выявляется. Тем самым, запрограммированный в онтогенезе апоптоз контролируется активными формами кислорода (АФК) и может эффективно модулироваться антии прооксидантами. Вероятно, что контролируемые антии прооксидантами активные формы кислорода (АФК) обусловливают структурную перестройку цитоплазмы с образованием особых вакуолярных везикул с синтезом в них мтДНК и запускают апоптоз.