Разработка статистического метода видовой идентификации микроорганизмов на примере представителей рода STAPHYLOCOCCUS

Актуальность проблемы. Оценка видового биологического разнообразия в настоящее время стала одним из традиционных методов оценки состояния природных экосистем и экологического мониторинга [34]. В наибольшей степени подобный подход разработан применительно к сложным многоклеточным биообъектам (животным, растениям, насекомым и др.), для большинства которых показано снижение показателей видового биологического разнообразия при увеличении антропогенной нагрузки на экосистему [31]. Применительно же к представителям микромира представления о биологическом разнообразии разработаны в значительно меньшей степени [36], что определяется сложностями проведения корректной видовой идентификации.

В полной мере подобное утверждение может быть отнесено и к имеющим важное экологическое и биоиндикационное значение микроорганизмам рода Staphylococcus, в номенклатуре и таксономии которых в 80−90-х годах XX века произошли принципиальные изменения [13]. В результате для решения данной задачи предложено множество миниатюризированных тест-систем для биохимической идентификации с визуальным или автоматизированным учетом результатов и определением вида микроорганизма по прилагаемым каталогам кодов, или с использованием специализированных компьютерных программ [38].

Однако, существенным недостатком разработанных на сегодняшний день методов является все еще невысокая достоверность результатов идентификации, определяемая особенностями используемых математических алгоритмов с невозможностью получения диагностических заключений при произвольной комбинации идентификационных тестов. В этой связи актуальным представляется разработка универсальной компьютерной программы видовой идентификации стафилококков, позволяющей максимально оптимизировать данную процедуру и тем самым, создать условия для качественной оценки присутствия данных микроорганизмов в организме человека и объектах внешней среды.

Цель работыПрименение вероятностно-статистических методов обработки данных при решении задач идентификации сложных биологических объектов на примере микроорганизмов рода Staphylococcus.

Задачи исследования:

1) Обосновать оптимальный многомерный статистический метод, пригодный для целей видовой идентификации микроорганизмов с последующей разработкой компьютерной программы, унифицирующей и автоматизирующей данную процедуру на примере представителей рода Staphylococcus.

2) Использовать разработанную программу для анализа диагностической эффективности различных тест-систем для видовой идентификации стафилококков с определением причин возникновения возможных диагностических ошибок.

3) Оценить видовое биологическое разнообразие санитарно-показательных микроорганизмов рода Stapylococcus в воздушной среде и организме носителей в условиях техногенного химического воздействия, формируемого в зоне влияния крупного объекта газовой промышленности.

Научная новизна. Обоснован оптимальный вероятностно-статистический метод дифференциации сложных биологических объектов, основанный на использовании процедуры кластерного анализа. Продемонстрированы преимущества подобного подхода перед применяемыми в настоящее время вероятностно-статистическими методами, заключающиеся в высокой точности показателей идентификации, а также мобильности процедуры при введении новых дифференцирующих тестов или расширении перечня идентифицируемых видов.

Впервые проведен анализ диагностической эффективности наиболее распространенных тест-систем для видовой идентификации стафилококков и охарактеризованы две основные причины возникновения диагностических ошибок. На основании проведенных исследований получены новые данные о зависимости диагностической эффективности тест-системы от суммарной информативности входящих в нее дифференцирующих тестов, а также отклонений от значений конвенциональных тестов, приведенных в «Определителе бактерий Берджи» [29].

Получены новые данные об увеличении видового биологического разнообразия стафилококков в организме человека и объектах внешней среды в условиях техногенного химического воздействия на экосистему, преимущественно связанные с расширением перечня определяемых видов и, тем самым, для своей оценки требующие использования индекса разнообразия Шеннона.

Практическая значимость. Разработана, апробирована и внедрена в работу бактериологических лабораторий «Универсальная компьютерная программа для видовой идентификации микроорганизмов» (свидетельство о регистрации № 2 004 610 330 от 2 февраля 2004 г.), позволяющая автоматизировать и унифицировать процесс интерпретации биохимических идентификационных тестов. Основным отличием данной программы от существующих аналогов является то, что она представляет из себя «открытую систему», позволяющую получить правильное диагностическое заключение при любой комбинации дифференцирующих тестов, как входящих в состав коммерческих идентификационных систем, так и выполняемых непосредственно пользователем.

Определены направления создания новых и совершенствования существующих тест-систем для видовой идентификации стафилококков на основе отбора комплекса тестов с наибольшей диагностической информативностью.

Продемонстрирована возможность использования показателя видового биоразнообразия стафилококков в организме человека и объектах внешней среды при проведении микробиологического мониторинга природных экосистем в условиях их техногенного химического загрязнения.

Положения, выносимые на защиту;

1. Применение методов кластерного анализа для целей идентификации сложных биологических объектов на примере микроорганизмов рода Staphylococcus.

2. Сравнение диагностической эффективности наиболее распространенных тест-систем для видовой идентификации стафилококков.

3. Использование показателей видового биологического разнообразия стафилококков при проведении экологического мониторинга.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались на 4-х всероссийских и региональных научно-практических конференциях, экспонировались на Второй Приволжской Ярмарке «Российским инновациям — Российский капитал» и IX выставке — конгрессе «Высокие технологии. Инновации. Инвестиции», отмечены дипломом за разработку «Универсальной компьютерной программы для видовой идентификации микроорганизмов». По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 4 статьи в реферируемых журналах и 2 тезисов докладов в материалах конференций, получено свидетельство о регистрации разработанного программного продукта.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 118 страницах и состоит из введения, пяти глав, заключения, двух приложений и списка использованной литературы, включающего 104 публикации отечественных и зарубежных авторов. Материал иллюстрирован 6 таблицами и 19 рисунками.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Оценка видового биологического разнообразия в настоящее время стала одним из традиционных методов оценки состояния природных экосистем и экологического мониторинга [34]. В наибольшей степени подобный подход разработан применительно к сложным многоклеточным биообъектам (животным, растениям, насекомым и др.), для большинства которых показано снижение показателей видового биологического разнообразия при увеличении антропогенной нагрузки на экосистему [31]. Применительно же к представителям микромира представления о биологическом разнообразии разработаны в значительно меньшей степени [36], что определяется сложностями проведения корректной видовой идентификации.

Для решения данной задачи предложено множество миниатюризированных тест-систем для биохимической идентификации с визуальным или автоматизированным учетом результатов и определением вида микроорганизма по прилагаемым каталогам кодов или с использованием специализированных компьютерных программ [38].

Однако, существенным недостатком разработанных на сегодняшний день методов является невысокая достоверность результатов идентификации, определяемая особенностями используемых математических алгоритмов с невозможностью получения диагностических заключений при произвольной комбинации идентификационных тестов. В этой связи актуальным представляется разработка универсальной компьютерной программы видовой идентификации стафилококков, позволяющей максимально оптимизировать данную процедуру и тем самым, создать условия для качественной оценки присутствия данных микроорганизмов в организме человека и объектах внешней среды.

Оценка биологического разнообразия микроорганизмов в настоящее представляется одним из достаточно перспективных методов изучения состояния природных экосистем. Однако, несовершенство методов видовой идентификации микроорганизмов делает этот аспект оценки биоразнообразия наименее изученным. В этом контексте разработка вероятностно-статистических подходов к решению задачи видовой идентификации микроорганизмов становится одним из необходимых условий для проведения подобных экологических исследований.

Новый взгляд на видовое разнообразие стафилококков потребовал разработки новых методов их дифференциации, так как используемые до этого подходы, основанные на применение одного-двух высокоинформативных тестов, оказались полностью неприемлемы. Кроме того, среди всего спектра известных таксономически значимых фенотипических признаков отсутствуют такие, которые на основании положительного или отрицательного результата только одного теста позволяли бы с достаточной точностью дифференцировать какой-либо один вид стафилококков от всех остальных. Решение данной проблемы оказывается возможным только при использовании достаточно широкого комплекса идентифицирующих тестов.

Причины возникновения диагностических ошибок, как показала практика, связаны со многими факторами, основными из которых являются:

1) низкое качество используемых реагентов и несовершенство технологий, не позволяющее получать стабильные и воспроизводимые результаты. Данная проблема была наиболее актуальной на первых этапах становления методологии видовой идентификации микроорганизмов (Dowell, У. Я, СаЬгп-НапБеп В.) и к настоящему времени в основном решена;

2) недостаточное количество используемых тестов, неадекватное количеству идентифицируемых видов. Для решения этой проблемы количество одновременно используемых тестов в современных идентификационных системах увеличено до более чем 20 [63−68]. Однако, частично названная проблема существует и в настоящее время — ни одна из известных тест — систем не позволяет идентифицировать все описанные к настоящему времени виды стафилококков: для этого пришлось бы еще более увеличить количество определяемых параметров, что неизбежно отразится на стоимости проводимого исследования. Разумным компромиссом в этом плане представляется разработка и создание неких «оптимальных» тестсистем, ориентированных на использование в медицинской или ветеринарной практике с акцентом для выявления потенциально патогенных для человека или животных видов стафилококков;

3) взвешенный учет результатов комплекса идентификационных тестов, каждый из которых считается независимым и равнозначным для определения видовой принадлежности микроорганизма. На разных этапах предлагалось решать эту задачу на основании дихотомических схем, каталога кодов или компьютерных программ с указанием вероятности формулируемого диагностического заключения [11,25,26,38]. Однако, резко возросшее количество самих видов микроорганизмов, так и используемых для их идентификации тестов на сегодняшний день требует привлечения использования специальных методов математического анализа.

В условиях многоальтернативной дифференциации вероятностный характер признаков определил необходимость использования вероятностно-статистических подходов к дифференциации видов микроорганизмов, которые были положены в основу существующих методов идентификации.

Относительно простые математико-статистические вычисления посредством таблиц и простых арифметических действий, лежащие в основе многих дифференцирующих методов, привело к их всестороннему использованию, одними из самых распространенных которых являются: метод определения ошибок, предложенный Нечмеревым, метод диагностических порогов, разработанный Генкиным, а таюке методы нумерической таксономии [20]. Однако, несмотря на свое широкое применение данные методы обладают рядом существенным недостатков: отсутствие мобильности при увеличении перечня дифференцирующих признаков и снижение тем самым достоверности получаемых результатов, а также «закрытость систем», не позволяющая получать требуемый результат при использовании любой комбинации конвенциональных таксономически значимых тестов.

С этих позиций представляется возможным использование современных математических методов многомерного статистического анализа, с привлечением специализированных статистических программных модулей. Наиболее перспективными для решения поставленной задачи были выбраны методы корреляционного, дискриминантного и кластерного анализов.

Анализ адекватности применения каждого из данных методов на примере решения задачи дифференциации 36 видов и подвидов стафилококков, показал, что наиболее перспективным для решения задачи дифференциации сложных биологических объектов является методика кластерного анализа, и это послужило обоснованием для его дальнейшего использования при разработке компьютерной программы для видовой идентификации микроорганизмов.

Разработанная в системе программирования Delphi программа, позволяющая автоматизировать идентификацию неизвестного вида стафилококка, реализует многомерный статистический подход к решению задачи видовой идентификации микроорганизмов на основе учета комплекса их таксономически значимых биологических характеристик.

Данный программный комплекс позволяет автоматизировать идентификацию неизвестного вида стафилококка, где на «входе» задачи располагают классифицируемыми данными и для решения задачи обращаются к методам кластер-анализа. При этом производилось вычисление наибольшей близости каждого из вновь анализируемых объектов (штаммов) с определенным видом стафилококка с известными таксономическими характеристиками, сформированными на основе данных об описанных в международном определителе Берджи [Берджи] видах и подвидах микроорганизмов.

Существующие аналоги компьютерных программ дл идентификации микроорганизмов, такие как API — Staph и StaphyTest, включают меньшее количество дифференцирующих признаков (у API — Staph — 20, у Staphytest -18) и представляют собой «закрытую систему», то есть отсутствует возможность использования любой комбинации таксономически значимых тестов, что является их главным отличием от разработанной универсальной компьютерной программы для видовой идентификации микроорганизмов [57−65, 72−83]. При этом исследование диагностической эффективности программы на примере 23 эталонных и 150 клинических штаммов стафилококков, предварительно идентифицированных до вида референс-методом в соответствии с «Определителем бактерий Берджи» (1997), свидетельствовало о не менее чем 95% точности при вероятности идентификации каждого штамма на уровне не менее 85%.

Выявленные преимущества разработанного комплекса позволили применить его при оценке диагностической эффективности наиболее распространенных тест-систем для видовой идентификации стафилококков и охарактеризовать основные причины возникновения диагностических ошибок. На основании проведенных исследований получены новые данные о зависимости диагностической эффективности тест-системы от суммарной информативности входящих в нее дифференцирующих тестов, а также отклонений от значений конвенциональных тестов, приведенных в «Определителе бактерий Берджи». При оценке эффективности сравниваемых тест-систем в ряде случаев создавался «виртуальный образ штамма», характеризуемый наличием или отсутствием анализируемых таксономически значимых конвенциональных характеристик, для чего использовалась разработанная «Универсальная компьютерная программа для видовой идентификации стафилококков».

При выполнении данного раздела работы были изучены пять наиболее широко представленных на российском рынке тест-систем: ПБДС (пластина биохимическая дифференцирующая стафилококки), производимая НПО «Диагностические системы» (Россия), «STAPHYtest-8» и «STAPHYtest-16» (Lachema, Чехия), а также API-Staph и ГО32 («bioMerieux», Франция).

Результаты идентификации изученной выборки стафилококков по совокупности тестов, предусмотренных при использовании системы ПБДС, позволили констатировать совпадение с результатами, полученными с использованием референс-метода в 57,14±1,06% случаев. При этом причины неправильной видовой идентификации стафилококков при использовании тест-системы ПБДС были сведены к двум основным моментам. Ошибки первого рода были связаны с тем, что диагностические возможности данной тест-системы принципиально не позволяли получить верное заключение, так как она изначально предусматривала возможность идентификации только 19 из 36 известных видов и подвидов стафилококков (14,34±0,98% от общего количества диагностических заключений). Ошибки второго рода определялись тем, что несмотря на заявлённые диагностические возможности тест-системы как достаточные для идентификации определенного спектра видов стафилококков, полученный результат все же оказывался неверным. На долю последней причины приходилось более половины всех ошибочных результатов идентификации и 28,52±1,27% от общего количества полученных диагностических заключений.

Проведенные исследования позволили констатировать, что результаты идентификации стафилококков по трехзначному цифровому коду, предусмотренному при использовании диагностической тест-системы «8ТАРНУ1е51−8», совпали с результатами, полученными с использованием референс-метода, лишь в 44,83±5,33% случаев.

Совершенствование данной системы с удвоением перечня идентифицирующих тестов («8ТАРН У1ез1−16») результировалось в значительном повышении ее диагностической эффективности, выразившемся в совпадении с результатами, полученными с использованием универсальной компьютерной программы, в 73,83±3,6% случаев.

Результаты идентификации изученной выборки стафилококков по совокупности тестов, предусмотренных при использовании системы АР1−8СарЬ, позволили констатировать совпадение с результатами, полученными с использованием референс-метода только в 58,33±5,05% случаев.

Результаты идентификации изученной выборки стафилококков по совокупности тестов, предусмотренных при использовании системы 32 ГО, совпали с результатами, полученными с использованием референс-метода в 85,0±6,87% случаев, что является самым высоким показателем из всех исследованных тест-систем.

Таким образом, у пяти сравниваемых коммерческих тест-систем для идентификации стафилококков была продемонстрирована различная диагностическая эффективность. В этой связи был осуществлен анализ информативности входящих в них идентификационных тестов, а также отклонений в их интерпретации от значений, приведенных в «Определителе бактерий Берджи».

Информативность каждого из конвенциальных таксономически значимых признаков стафилококков была расчитана и выражена в числовой форме. При этом в группе из 44 конвенциональных тестов, используемых для целей межвидовой дифференциации стафилококков, были выявлены 20 признаков с максимальной информативностью (1>20), в наибольшей степени пригодные для решения соответствующих задач.

В состав системы ПБДС входили тесты с достаточно низкой информативностью что привело к относительно невысокой суммарной информативности данной тест-системы (?1=346,40) и результировалось в ее минимальной диагностической эффективности.

Входящие в состав панели «БТАТЧ^ПЛез^» тесты имели достаточно высокую информативность, однако их небольшое количество определило суммарную информативность всей тест-системы на уровне всего ?1=171,68, что также результировалось в ее невысокой диагностической эффективности.

На этом фоне суммарная информативность тест-системы «БТАРНУЧея!:-16» составила уже ?1=402,31.

Суммарная информативность системы АР1−81ар11 (?1=365,95) оказалась выше чем у ПБДС, но ниже чем у «8ТАРНУ1езИ6», что соответствует указанным выше промежуточным значениям ее диагностической эффективности.

В состав панели 32ГО входили уже 25 тестов, основная масса которых является высокоинформативными, что среди сравниваемых тест-систем позволяет констатировать ее наибольшую суммарную информативность (?1=507,06) и соответствующую ей диагностическую эффективность.

Проведенный анализ позволил сделать предположение о связи диагностической эффективности тест-системы с суммарной информативностью входящих в нее дифференцирующих тестов, каковая была выражена логарифмической зависимостью вида ДЭ=90,99^(£1%)-88,23- где ДЭ — диагностическая эффективность (в %), И% - суммарная информативность диагностической панели в процентах от суммарной информативности всех 44 конвенциональных тестов.

Дополнительной причиной возникновения диагностических ошибок, выявленной при проведении настоящего исследования, явились отклонения в интерпретации результатов дифференцирующих тестов от таковых, приведенных в «Определителе бактерий Берджи». При этом наибольшее количество подобных отклонений, обнаружено у тест-системы 32ГО (105 значений), а наименьшее у ПБДС (14 значений).

Найденное на этой основе уравнение множественной регрессии имело вид: ДЭ=0,8536*(П%)+0,17*(%отк)+2,9863, где ДЭ — диагностическая эффективность (в %) — %отк — процент отклонений от значений, приведенных в «Определителе бактерий Берджи», и при расчете через коэффициент детерминации свидетельствовало о том, что диагностическая эффективность изученных тест-систем для идентификации стафилококков на 75% определяется суммарной информативностью входящих в них дифференцирующих тестов, а на 20% - осутствием отклонений от значений, приведенных в «Определителе бактерий Берджи».

Разработанный программный комплекс был использован при оценке показателей видового биологического разнообразия стафилококков в природных экосистемах. При этом основной акцент был сделан на анализе биоразнообразия стафилококков в воздушной среде и организме бактерионосителей в условиях техногенного химического воздействия, формируемого в зоне влияния крупного объекта газовой промышленности.

С использованием данной программы выявлены представители 20 из 36 доступных для идентификации видов стафилококков.

Результаты бактериологического исследования атмосферного воздуха и анализ мазков-отпечатков, выделенных от бактерионосителей позволили констатировать стабильное присутствие представителей рода Staphylococcus, обнаруживаемых в 70,3±7,9% исследованных проб в первом случае и в 68,0±3,3% во втором. В зоне влияния крупного объекта газовой промышленности регистрировалось существенное расширение перечня определяемых видов, что нашло свое отражение в соответствующих сдвигах числовых индексов, описывающих биологическое разнообразие стафилококков. В данном случае использование индекса Симпсона, оценивающего в первую очередь доминирующие виды, не позволило выявить достоверных отличий между обследованной и фоновой зонами. С другой стороны, расчет индекса Шеннона, придающего больший вес редким видам и лучше подходящего для целей сравнения в тех случаях, когда исследователя не интересуют компоненты разнообразия по отдельности, позволил констатировать достоверный рост видового биологического разнообразия стафилококков в атмосферном воздухе населенных пунктов и выделенных от бактерионосителей, находящихся в зоне влияния крупного объекта газовой промышленности.

Проведенная оценка видового биологического разнообразия стафилококков, изолируемых из атмосферного воздуха и от бактерионосителей, в первом приближении позволила сделать выводы о направленности сдвигов данного показателя в экологически скомпрометированных зонах. При этом одним из последствий техногенного химического воздействия оказалось не снижение (как это типично для более сложных сообществ), но рост видового биологического разнообразия потенциально патогенных микроорганизмов в организме человека и объектах окружающей среды. Прикладные же аспекты обнаруженного феномена могут быть связаны как с возможностью углубленной оценки последствий воздействия экотоксикантов, так и с разработкой новых подходов к биоиндикации техногенного воздействия на экосистемы.