Идентификация жиров животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

ВЫВОДЫ:

1. Действующие в настоящее время в России нормативные документы и применяемые аналитические методы идентификации и определения основных видов порчи жиров, основанные на определении физико-химических характеристик и состава жирных кислот исследуемых объектов, не позволяют достаточно точно классифицировать жировые продукты, оценить их пищевую ценность и выявить случаи фальсификации.

2. Разработан метод, позволяющий в одном анализе проводить достоверное определение видовой принадлежности жиров и проверку их качества путем определения и идентификации молекулярных форм триацилглицериновопределения наличия гидроперекисей и сопряженных двойных связейопределения содержания витаминов и стеролов.

3. Метод имеет следующие преимущества: за счет использования многоканального УФ-детектирования (диодная матрица) осуществляется мультикомпонентный анализ масел и жиров, включая и анализ ТАГ с перекисными кислотами в качестве ацильных радикаловболее достоверна идентификация определяемых пиков, основанная на изучении их спектров и времен удерживания. При использовании диодной матрицы в качестве детектора это осуществляется за счет параллельной регистрации пиков на нескольких специфических длинах волн с одновременной записью спектров.

4. Предел обнаружения разработанного метода составляет 10 нг для ненасыщенных ТАГ — жирные кислоты с тремя двойными связями, 25 нг для ненасыщенных ТАГ — жирные кислоты с двумя двойными связями, 150 нг для ненасыщенных ТАГ жирные кислоты с одной двойной связью и 10,0 мкг для насыщенных ТАГ.

5. Изучена эффективность растворителей для экстракции фракций триацилглицеринов. Для экстракции ТАГ из природных масел наиболее пригодна смесь диоксан-этанол или изопропанол. Из маргаринов хорошо экстрагируют ТАГ и диацилглицерины ацетон, в меньшей степени ацетон-этанол и диоксан-этанол.

6. Определен полный спектр триацилглицеринов говяжьего, свиного, бараньего, куриного, гусиного, утиного жиров и жира кролика.

7. Разработана и применена оригинальная программа идентификации индивидуальных ТАГ помощью ЭВМ после хроматографического разделения их методом ВЭЖХ с многоканальным УФ-детектированием.

8. Выявлено качественное и количественное различие состава триацилглицеринов указанных жиров, что может служить критерием их идентификации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В настоящей работе был детально изучен состав ТАГ наиболее распространенных пищевых животных жиров (говяжьего, свиного, бараньего, куриного, гусиного, утиного и жира кролика) с целью разработки критериев их идентификации и подлинности, выявления фальсификации, а также новых подходов к оценке пищевой ценности.

Для решения этой задачи был разработан метод определения ТАГ-состава жиров, масел и родственных им продуктов, основанный на комбинации следующих этапов:

• выделение фракции ТАГ из исходного образца;

• определение состава жирных кислот, входящих в состав ТАГ методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием;

• разделение молекулярных видов ТАГ с помощью модифицированного метода обращенно-фазовой ВЭЖХ с многоканальным УФ-детектированием (детектор — диодная матица, длины волн 215, 240, 280 нм);

• идентификация и количественная оценка содержащихся ТАГ с помощью существенно модифицированной авторами специальной компьютерной программы.

Комбинация разработанных и модифицированных авторами современных научных подходов позволила решить трудную проблему анализа ТАГ-состава, степень сложности которой возрастает с увеличением числа различных жирных кислот в ацильных остатках ТАГ образца.

Примененная авторами программа идентификации, основанная на компьютерной обработке данных, полученных при исследовании жиров и масел методом ВЭЖХ с многоканальным УФ-детектированием, позволяет достоверно идентифицировать основные индикаторные ТАГ-компоненты исследованных жиров.

Применение компьютерного анализа позволило создать вероятностный состав молекулярного спектра ТАГ пищевых жиров, максимально приближающегося к действительному и резко снизить время анализа.

Идентификация основана на зависимости между относительным приведенным временем удерживания К' и эквивалентным углеродным числом (ЕС11) индивидуальных ТАГ. Такие закономерности устанавливают с помощью определенного набора стандартов триацилглицеринов, рассчитывая ЕСЫ и К'. Предполагая гомологичность ТАГ, считают, что каждая точка построенной кривой соответствует индивидуальному ТАГ с полученным значением ЕС1М. Далее методом итерации с применением ЭВМ можно подобрать все возможные ТАГ с учетом определенного жирно-кислотного состава исследуемого образца, рассчитанные эквивалентные углеродные числа которых попадают в интервал вблизи данного значения, протяженность которого равна удвоенной погрешности эксперимента.

С помощью описанного метода были идентифицированы индивидуальные триацилглицерины говяжьего, свиного, бараньего, куриного, гусиного, утиного жиров и жира кроликов.

Основной спектр во всех образцах исследованных жиров содержал 12 видов ТАГ, из них 7 видов были представлены в количествах, превышающих 3% каждый от общего весового соотношения, а остальные менее 1%. До настоящей работы не было данных, касающихся детального и достоверного состава молекулярных форм ТАГ животных жиров, исследованных в работе.

Результаты отдельных публикаций по ряду макрокомпонентов исследованных жиров в основном не расходятся с нашими данными.

Сравнительный анализ молекулярного спектра ТАГ позволил выявить характеристический качественный и количественный состав ТАГ для всех жиров.

Наряду со специфичными ТАГ, для отдельных жиров обнаружен ряд общих триацилглицеринов, которые могут служить в качестве характерного родового признака и признака локализации жира в организме. Такими примерами являются триацилглицерин РаОО, характерный для всех видов птицы и триацилглицерины MOS и LSS, характерные для подкожного жира лопаточной области и подкожного жира тазовой области свиньи.

Важным фактором для оценки пищевой ценности исследованных жиров явилось установление факта сниженного содержания в ацильных радикалах фракций ТАГ ю 3 ПНЖК. Эти данные расходятся с данными общего ЖК состава липидной фракции указанных жиров и, по-видимому, свидетельствуют, что источником ПНЖК серии ю 3 в животных жирах являются полярные липиды (фосфолипиды).

Разработанный нами метод анализа мультикомпонентного состава жиров был внедрен в Центральной таможенной лаборатории ГТК РФ и двенадцати региональных таможенных лабораториях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ:

1. Разработа’н и внедрен в Центральной таможенной лаборатории ГТК РФ и двенадцати региональных таможенных лабораториях метод анализа мультикомпонентного состава жиров, основанный на градиентном элюировании в сочетании с диодной матрицей в качестве детектора.

2. Выработаны основные критерии, позволяющие идентифицироватьи оценить качество животных жиров, в том числе и при исследовании жиров, импортируемых на территорию Российской Федерации.

3. Разработанные критерии идентификации научно обосновывают правильную классификацию жиров и масел, позволяют предотвратить снижение качества питания населения и попадания на товарный рынок недоброкачественных и потенциально опасных для здоровья жировых продуктов, позволяют оценить пищевую ценность указанных продуктов.

1. Алимова Е. К. Биосинтез ацилглицеринов в различных тканях животного организма// Липиды. Структура, биосинтез, превращения и функции. М.: Наука, -1977, -С. 5−15.

2. Алимова У. К., Аствацатурьян А. Т., Жаров Л. В. В кн. Липиды и жирные кислоты в норме и при ряде патологических состояний. Биохимические аспекты переваривания, всасывания и транспорта липидов//М.: Медицина, -1975, -С.6−16.

3. Айвазян С. А. и др. Прикладная статистика// М.: Финансы и статистика, -1989, -С. 144−148, -С. 332−382.

4. Ауст Л., Брюкнер Ю., Левачев М. М. и др. Влияние триацилглицеринов жирных кислот плазмы, жировой ткани и мембран эритроцитов у крыс//Вопросы питания, -197 8, -№ 4, -С. 18 .

5. Бергельсон Л. Д., Дятловицкая Э. В., Молотковский Ю. Г. и др. Препаративная биохимия липидов// М.: Наука,-1981,-С. 259.

6. Венгерова Н. В., Загонова Э. В. Фракционирование жирных кислот растительных масел и китового жира карбамидным методом// Л.: Труды ВНИИЖ, Химия и технология жиров и моющих средств. -1963, -вып. 24, -С. 143.

7. Верещагин А. Г. Биохимия триацилглицеринов//М.: Наука, -1972, С. 308.

8. Глебов Р. И., Рекомендации по идентификации молекулярных форм триацилглицеринов в маслах, жирах и прочих жиросодержащих продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием// М., 1998 (Для таможенных целей).

9. Глебов Р. И., Родин В. И., Эллер К. И. Исследование состава молекулярных форм триацилглицеринов животных жиров. //Мясная индустрия, -1998.-№ 7.-С.33−36.

10. Глебов Р. И., Родин В. И. Идентификация масло-жировых продуктов, поступающих на товарный рынок России. Материалы международной научно-производственной конференции, посвященной 190-летию высшего ветеринарного образования в России. СПб., 1998. С. 62.

11. Гольберт К. А., Вигдергауз М. С. Курс газовой хроматографии//М.: Химия. -1974. -С. 55.

12. Зиновьев A.A. Химия жиров// М.: -1962. -С. 308.

13. Кейтс М. Техника липидологии// М.: Мир. -1975. -С. 74−75.

14. Киселева Т. В., Ляпков Б. Г. Воинов Д.И., Сравнительный анализ состава триацилглицеринов в маргаринах, полученных сиспользованием различных технологий// Сб. научных трудов: Теоретические и клинические аспекты науки. -1989. -Т. IX. -С. 117−127.

15. Клиорин А. И. Атеросклероз в детском возрасте// М.: Медицина.-1981. С. 102.

16. Кученев П. В. Молоко и молочные продукты// М.: Россельхозиздат.-1985. -С.9.

17. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам//М.: Мир. -1982. -Т. 1. 11. -С. 783.

18. Либерман С. Г. Способы фракционирования жиров и их кислот// М. ЦНИИТЭИ мясопром. -1965.

19. Левачев М. М. Роль липидов пищи в обеспечении процессов жизнедеятельности организма// Вопросы питания. -1980. -№ 2. -С. 3−11.

20. Ляпков Б. Г., Воинов Д. И., Меламед Д. Б. Определение молекулярных типов ТАГ в растительных маслах ВЭЖХ с использованием ЭВМ// IV Всесоюзн. симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии. -Алма-Ата.: Изд-во АН КазССР. -1987. -С. 93.

21. Ляпков Б. Г., Воинов Д. И., Меламед Д. Б. Состав ТАГ пищевых жиров// Мед. реф. жур. -1988. VII разд. -№ 4. -С. 34.

22. Ляпков Б. Г., Воинов Д. И. и др. Сравнительный анализ состава молекулярных форм ТАГ жира сардины Иваси и некоторых растительных масел// Вопросы питания. -1988. -№ 2. -С. 56−60.

23. Ляпков Б. Г., Киселева Т. В. Использование молекулярной жидкостной хроматографии ТАГ в оценке пищевых и кормовых жиров// Мат-лы V Всесоюзн. симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии. -Рига. -1990. -С. 193.

24. Ляпков Б. Г., Киселева Т. В. Контроль качества пищевых и кормовых жиров по составу индивидуальных триацилглицеринов// Мат-лы Всесоюзной научно-технической конф-ции. -Киев. -1991. -4.1. -С. 263.

25. Ляпков Б. Г., Меламед Д. В., Воинов Д. И. Сравнительный анализ по ТАГ составу// Пищ. и перераб. пром-сть. -1988. -№ 8. -С. 42.

26. Ляпков Б. Г., Меламед Д. Б., Воинов Д. И. Идентификация пищевых растительных масел по ТАГ составу// Вопросы питания.1988. -№ 3. -С. 61−66.

27. Ляпков Б. Г., Меламед Д. Б. Хроматографические методы анализа смесей индивидуальных ТАГ// Ж. аналит. химии. -1990. -Т. 45. -Вып. 3. -С. 434−452.

28. Математическая статистика Под ред. А. М. Длина. М.: Высшая школа. -1975. -С. 145.

29. Пецев Н., Коцев Н. Справочник по газовой хроматографии// М.: Мир. -1987. -С. 93. 43. Поляков И. И. Докл-д Моск. Ин-та инж. с-х производства// М. -1971. -С. 336.

30. Редько Т. С., Смирнова Л. Т., Трауэрман Л. А. Производство заменителя масла какао за рубежом// М.: ЦНИИТЭИпищепром. -1974. -С. 16.

31. Хроматография. Практическое приложение метода// М.: Мир.1989. -Т.1. -С. 327.

32. Шаршунова M.: Шварц В., Михалец Ч. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии// М.: Мир. -1980. -Т. 2. -С. 536−541.

33. Analysis of oil and fats// London, N.Y.: Elsevier Sci. Pabl. -1986. P. 324.

34. Barron L., Cesaa M., Santa-Maria G., Gorro N. Determination of the triglycerides Composition of grapes by HPLC// Chromatographia. -1988. -V. 25. -№ 7. -P. 609.

35. Barth H., Barber W., Lochmuller Ch., Majors R. Column liquid Chromatography// Anal. Chem. -1986. -V. 58. -№ 5. -P.211−239.

36. Bracco U., Hidalgo J. and Bohren H. Lipid Composition of the fat globule membrane of human and bovine milk// J. Dairy Sci.-1972. V. 55. -P. 165−175.

37. Brockerhoff H., Hoyle R. On the structure of the depot fast of marine fish and mammals// Arch.Biochem. and Biophys. 1963.-V. 102. -№ 3. -P. 452−455.

38. Brunnekreeft J., Leijnse B.// J.chin. Chem. Clin. Biochem.-1986a. -V. 24. -№ 7. -P. 445.

39. Buning-Pfaue H., Eggers R., BartschA.// Fat Sci. Technol.-1989. -V. 91. -№ 3. -P. 92.

40. Christie W. Biosynthesis of triglycerides in freshly secreted milk from goats// Lipids. -1974. -V.9. -№ll. -P.876−882 .

41. Chromatography of lipid in biomedical research and clinical diagnosis// Amsterdam: Elsevier J. chromatogr. library. 1987.-V. 37. -P. 441.

42. Daae L.N. The mitochondrial acylation of glycerophosphate in rat liver: fatty acid and positional specificity// Biochim. et biophys. acta. -1972. -V. 270. -P. 23.

43. Edwards W. // J. Liq.chromatogr. -1985. -V. 8. -14. P. 2625.

44. Farines M., Soulier R., Soulier J. Analysis of the triglycerides of some vegetable oils// J. chem. Ed. -1988.-V. 65.-№ 5. -P. 464−466.

45. Fiebig H. HPLC trennung von triglyceriden// Fette, Seifen, Anstrichmittel. -1985. -V. 87. -№ 2. -P. 53−57.

46. Folch J., Lees M., Stanley G. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues// J. Biol. chem. -1957. -V. 226. -P. 497−510.

47. Food chemicals codex// National Academy press. Washington. DC. -1986.

48. Fox P.F. Developments in dairy Chemistry-2, Lipids// Applied science publishes, London and New York. -1983. -P. 1−37.

49. Frede E. Improved HPLC of triglycerides by special tempering procedures// Chromatographia. -1986. -V.21. -№ 1. -P. 29−36.

50. Frede E. Thiele H. Analysis of milk fat by HPLC// J. Amer. Chem. Soc. -1987. -V. 64. -№ 4. -P. 521−528.

51. Gargouri Y., Moreau H., Veget R. Gastric lipases: biochemical and physiological studies// BBA. -1989. -V. 1006. -№ 3. -P.255−271.

52. Geeraert E., De Schepper D. Structure of triglycerides by chromatographic techniques// J. High Resol. chrom. 1983. -V. 6. -№ 3. -P. 123.

53. Geeraert E., Sandra P. On the potential of CGC in triglyceride analysis// J. High Resol chrom. -1984. -V. 7. -P. 431−432.

54. Geeraert E. Possibilities of gas chromatography on polar capillary columns in the triglyceride analysis of fats and oils, with special reference to chocolate fats// J. Amer. Oil chem. Soc. -1985. -V. 62. -№ 4. -P. 629.

55. Geeraert E. Sandra P. capillary GC of triglycerides in fats and oils using a high temperature phenylmethylsilicone stationary phase// J. High Resol. chromatogr. -1985. -V. 8. -№ 8. -P. 415−422.

56. Geeraert E., Sandra-P. Capillary GC of triglycerides in fat and oils using a high temperature phenylmethylsilicon stationary phase// J. Amer. Oil chem. Soc. -1987. -V. 64. -№ 1. -P. 100−106.

57. Gilkson 1. Quantitative and qualitative analysis of triglycerides using gradient elution with UV detection// Chromatographia. -1988. -V. 26. -№ 1. -P. 181.

58. Goiffon J., Reminiac C., 011e M.11 Rev.Fr.Corps.Gras. -1981. -V. 28. -№ 4. -P. 167.

59. Goiffon J., Reminiac C. Olle M.// Rev.Fr.corps.Gras. -1981. -V. 28. -№ 5. -P. 199.

60. Grob K., Grob G.// J. High Resol.Chromatogr. -1979. -V.2. -№ 2. -P. 109.

61. Grob K. Degradation of triglyceridesin gas chromatographic capillaries: studies by reversing the column// J.Chromatogr. -1981. -V. 25. -№ 2. -283−289.

62. Grob K., LaubliT. High oven temperature on Column injection in capillary gas chromatography. I sample introduction// J. chromatogr. -1986. -V. 357. -№ 3. -P. 345.

63. Grob K., Laubli T. High oven temperature on column injection in capillary gas Chromatography. Avoidance of peak distortion// J. chromatogr. -1986. -V. 357. -№ 3. -P. 357.

64. Hamosh M.A. Fat digestion, in the newborn role of lingual ligase and preduiodenal digestion// Pediat.Res. -1979. -V. 13. -№ 5. -P615−622.

65. Hernquist L. AHerslof B., Herslof M. Polymorphism of interes-terified triglycerides and triglycerides mixture// Fette, Seifen, Anstrichmittel. -1984. -V. 86. -№ 10. -P. 393.

66. Herslof B., Podlaha C., Toregart B. HPLC of triglycerides// J.Amer.Oil chem.Soc. -1979. -V. 56. -№ 9. -P. 864−866.

67. Herslof B., Kindmark G. HPLC of triglycerides with gradient elution and mass detection// Lipids. -1985. -V. 20. -№ 11. -P. 783.

68. Hinshaw J., Seferovic W. Programmed-temperature split-split-less injection of triglycerides: comparison to cold on column injection// J. High ResoLchromatogr. -1986. -V. 89. -№ 2. -P. 69−72.

69. Jandacek K.J., Whiteside J.A., Holcombe B.N. et. al. The rapid hydrolysis and efficient absorption of triglycerides with octanoic acid in the 1 and 3 positions and long-chain fatty acid in the 2 position// Am.J.clin. Nutr. -1987. -V.45.1. P.940−945.

70. Jansson L., Akesson B., Hoimberg L. Identification of tocopherols//Am.J.clin.Nutr. -1981. -№ 34. -P.8−14.

71. Janness R. and Sloan R. Lipid composition of human milk// Dairy Sci. Abstr. -1970. -№ 32. -P. 599−608.

72. Jensen G. Improved separation of triglycerides at low temperatures by reversed phase liguid chromatography// J. chromatogr. -1981. -V. 204. -№ 2. -P. 407−432.

73. Kates M. Technigues of lipidology. Isolation, analysis and identification of lipids// Amsterdam: Elsevier. -1986. P. 321.

74. Kcenper K., Melchert H., Rabach K.// Lebensmittel-chem. Gerichtl.chem. -1988. -V.B.42. -P. 105.

75. Kimmey R., Perkins E. Confectionery fat analysis with high performance liguid chromatography// J.Amer.Oil chem.Soc. -1984. -V.61. -№ 7. -P. 1209−1211.

76. Kobayashi H., Kanno C., Yamauchi K. et.al. Identification of a, p, x and 5-tocopherols and their contents in human milk// BBA -1975. -N380. -№ 2. -P. 282−290.

77. Kondon Y., Takano S. Analysis of acyiglycerols by highperformance liquid chromatography with post-column derivatization// J. chromatogr. -1987. -V. 393. -№ 2. -P. 427 435.

78. Kuksis A., Myher J., Marai L. Lipid methodology chromatography and beyond. Part I. GC/MS and LC/MC of glycerolipids// J.Amer. Oil.chenkSoc. -1984. -V.6L -№ 10. -P. 1582−1589.

79. Kuksis A., Maher J., Marai L. Lipid methodology-chromatograph and beyond. Part II. GC/MS, LC/MS and specific enzymatic hydrolysis of glycerolipids// J.Amer.Oil chem.Soc. -1985. -V. 62. -№ 4. -P. 762−767. ,.

80. Kuksis A., Meher J., Marai L. Analyses of nattural and H-labe led glycerolipids by GC/MS and LC/MS with specific enzymic hydrolyses // J.Amer.Oil chem.Soc. -1985. -V. 62. -№ 4. -P. 767−773.

81. Kuksis J., Marai L., Sandra P. Identification of the more complex triacyiglycerols in bovine milk fat by gas chromatograph-by-mass spectrometry using polar capillary columns// J.chromatogr. -1988. -V. 452. -№ 1. -P. 93−105.

82. Lie Ken Jie M. Fatty asids. XIX A quantitative treatment of saturated triglycerides by reversed-phase high-performance liquid chromatograhy// J.chromatogr. -1980. -V. 192. -№ 2.1. P.457−472.

83. Lin D.S., Connor W.E. Are the n-3 fatty acids from dietary fish oil deposited in the triglyceride stores of adipose tissue// Am.J.clin.Nutr. -1990. -V. 51. -№ 4. -P. 535−539.

84. Lichfield C. Analysis of triglycerides// N.Y.and L.: Academic Press. -1972. P -355.

85. Lloyd-Davied K.A., Brindley D.N. Palmitat-co-enzyme A ligase and sn-glycerol 3-phosphate aceltransferase in the microsomal fraction of rat liver//Biochim.Soc.Trans. -1973. -V.l. -№ 2. -P.436−445.

86. Lohninger A., Linhart L., Laudau M., Glogar D.// Anal.Biochem. -1988. -V. 171. -№ 2. -P. 366.

87. Lund P. Analysis of butterfat triglycerides by capillary gas chromatograhy//Mi Ichwissenschaft. -1988. -V. 43. -№ 3. -P. 159−163.

88. Mares P., Husek P. Quantitative capillary gas-liquid chromatography of triglycerides on a fused-silica column with a chemically bonded stationary phase// J.chromatogr. -185. -V.350. -№ 1. -P. 87−98.

89. Methods in membran biology// N.Y.London: Plenum Press. 1977. -V. 8. 218 P.

90. Merritt C., Vajdi Jr., Kayser S. et.al. Validation of computational methods for triglycerides composition of fats and oils by liquid chromatography and mass spectrometry// J.Amer.Oil chem. Soc. -1982. -V. 59. -№ 10. -P. 422−432.

91. Moilanen T., Viikari J., Rasanen L. et.al. Three year tracking of serum fatty acids in Finnish boys and girls// Atherosclerosis -1987. -V.67. -P. 191−197.

92. Moore J.H. Industrial aspects of biochemistry// Amsterdam: North Holland Publ. co. -1974. -234P.

93. Murata T. Analysis of triglycerides by gas chromatography (chemical ionization mass spectrometry)// Anal. chem. -1977. -V. 49. -№ 12. -P. 2209−2213.

94. Murata T., Takahashi S. Analysis of triglycerides mixtures by gas chromatography mass spectrometry// Anal. chem. -1973. -V. 45. -№ 11.-P. 1816−1823.

95. Myher J., Kuksis A., Breckenridge W. comparative studies of triacyiglycerols structure of very low density lipoproteins and chylomicrons of normolipemic subjects and patients with type II hyper-lipoproteinemia// Lipids. -1985. -V. 20. -№ 2. -P. 90−95.

96. Nanderkar A.K., Schirmer E., Kumar S. Biosynthesis of fatty acids in mammary tissue// Arch.Biochem. and Biophys. -1969. -V. 134.-№ 2. -P. 554−562.

97. Nordby H., Yelenosky G. Analisis of triacyiglycerols in leaves of citrus by HPLC// J.Amer.Oil chem.Soc. -1984. -V.61.-P. 1028−1031.

98. Nurmela K., Satama L. Quantitative analysis of triglycerides by high-performance liquid non-linear gradient elution and flame ionization detection// J.Chromatogr. -1988. -V. 435. -№ 1. -P. 139−148.

99. Ong A.S.H. Fractionation studies of palm oil by density gradient// J. Oil chem. -1983. -V. 60. -№ 10. -P. 1755.

100. Parris N. Non-aqueous reversed phase chromatography of glycerides using inforared detection// J.Chromatogr. -1978. -V. 149. —№ 2. -P. 615−620.

101. Patton S.// J.Amer.Oil chem. Soc. -1973. -V. 50. P. 178.

102. Pel P., Henly R., Ramachandran S. New application of high pressure reversed-phase liquid chromatography in lipids// Lipids. -V. 10. -№ 3. -P. 152−156.

103. Phillips F., Erdahl W., Nadenicek J. et.al. Analysis of triglyceride species by high-performance liquid chromatography via a flame ionization detector// Lipids. -1984. -V. 19. -№ 2. -P. 142−150.

104. Pillips F., Erdahl W., Schmit J. et.al. Quantitative analysis of triglycerides species of vegetable oil by high performance liquid chromatography via a flame ionization detector// Lipids. -1984. -V. 19. -№ 11. -P. 880−887.

105. Plattner R., Spencer G., Kleiman R. Triglyceride separation by reverse phase high performance liquid chromatography// J.Amer. Oil chem.Soc. -1977. -V54. -№ll. -P.511−515.

106. Plattner R., Payne-Wane K. Separation of triglycerides by chain length and degree of unsaturation on silica HPLC colums// Lipids. -1979. -V. 14. -№ 2. -P. 152−153.

107. Plattner R.// J.Amer.Oil Chem.Soc. -1981. -V.58. -№ 5. P.638.

108. Podlaha C. Toregard B.// J. High Resol.chrom. -1982. -V. 5. -№ 10. P. 553.

109. Podlaha C., Toregard B. HPLC trennung mono-ungesattigter triglyceride hinschtlich der a-oder ?-position der olsaure in einigen vegetabilischen fetten// Fette, Saifen, Anstrichmittel.-1984. -V. 86. -№ 6. -P. 243−256.

110. Proot M., Sandra P., Geeraert E.// J. High Resol. chromatog. -1986. -V. 9. -№ 3. -P. 189.

111. Report of the joint FAG/WHO expert consultation on the role of dietary fat and oil in human nutrition// FAO Papers № 3. Rome (FAO) -1978.

112. Rhodes S., Netting A. Normal-phase high-performance liquid chromatography of triacylglycerols// J.Chromatogr. -1988. -V. 448. -№ 1. -P. 135−138.

113. Satama T., Nurmela K. The use of flame ionization detection in liquid chromatography// Kemia-Kemi. -1987. -V.14. -№ 106. -P.1001−1007.

114. Schwabe A., Bennett L., Bowman L. Octanoic acid absorption and oxidation in humans// J.Appl.Physiol. -1967. -V. 19. -P. 335−342 .

115. Singleton J., Pattee H. Optimization of parameters for the analysis of triglycerides by reverse phase HPLC using a UV detector at 210 nm// J.Amer. Oil Chem.Soc. -1984. -V.61. -№ 4. -P.761−766.

116. Singleton J., Pattee H. Retention behavior of triglycerides on reverse phase columns using pseudophase liquid chromatography// J.Amer. Oil Chem.Soc. -1985. -V. 62. -№ 4. -P. 739−742.

117. Singleton J., Pattee H. Characterization of peanut oil triacyiglycerols by HPLC. GLC and EIMS// J.Amer. Oil Chem.Soc. -1987. -V. 84. -№ 4. -P. 534−538.

118. Smith N. Hydrogenation of cholesterol esters during gas chromatography on a polar fused-silica capillary column// J.Chromatogr. -1982. -V. 249. -№ 1. -P. 57−63.

119. Stolk C., Purdy W.//Anal. Lett. -1988. -V.21. -№ 1. -P.l.

120. Stolyhwo A., Colin H., Guiochon G. Use of light scattering as a detector principle in liquid chromatography// J.Chromatogr. -1983. -V. 265. -№ 1. P. 1−12.

121. Stplyhwo A., Colin H., Guiochon G. Analysis of triglycerides in oils and fats by liquid chromatography with the laser light scattering detector// Anal. Chem. -1985. -V. 57. -№ 7. -P. 1342−1354.

122. Takano S., Kondoh Y. Triglyceride analysis by combined argentite Ion/nonaqueous reversed phase HPLC// J.Amer.Oil Chem. Soc. -1987. -V. 64. -N3. -P. 380−383.

123. Triacyiglyctrols: influence of structure on metabolism in the rat//Nutr.Rev. -1989. -V.47. -N7. -P.221−223.

124. Trimidou M., Macrae R.// J.chromatogr.Sci. -1985. -V.23.-№ 1. -P. 155.

125. Van Der Streege G., Muskiet E., Martini 1. et.al. Simultaneous quantification of mediumand long-chain fatty acids in human milk by capillary gas chromatography with split injection// J.Chromatogr. -1987. -V. 415. -P. 1−11.

126. Vasconselos A., Gonsalves M., Azevedo G et.al. Use of computerized patten recognition of triglyceride profiles in monitoring SCF C02 extraction of fatty oil// J. High Resol.chrom. -1989.-V. 12. -№ 4. -P. 244−253.

127. Wada S., Nonaka J.// J. Japan Oil chem.Soc. -1977. -V. 26. -№ 2. -P. 35.

128. Wada S., Koizumi ch., Takiquchi A. A study on triglycerides composition of lipid from commercial beef by HPLC// J. Japan Oil chem. -1978. -V. 27. -№ 9. P.579.

129. Weber Von K., Schulte E., Thier H.// Fat Sci.Technol. -1988. -V.B.90. -P.341.

130. White c., Houck R. Analysis of mono-, di-, and triglycerides by capillary supercritical fluid chromatography// J. High Resol. chromatogr. -1985. -V. 8. № 6. -P. 293−296.

131. Wojtusik M., Brown P,., Turcotte J.//Biochromatogr. -1988. -V. 3. -№ 2. -P. 76.

132. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТАМОЖЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ.

133. ЦЕНТРАЛЬНАЯ ТАМОЖЕННАЯ ЛАБОРАТОРИЯ1. УТВЕРЖДАЮ.

134. Методические рекомендации по идентификации молекулярных форм триацилглицериновв маслах, жирах и прочих жиросодержащих продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ детектированием1. Согласовано:

135. Начальник экспертно-исследовательского отдела товаров органического происхождения, леса, текстиля и изделий из них.

136. Ответственные исполнители:1. Ведущий инспектор1. Л.М. Фомина•г1. Р.И. Глебов1. Москва 1998 г. 1. Содержание.

137. Область применения и сущность метода.2.

138. Аппаратура, материалы и реактивы.31. Подготовка пробы. 41. Проведение измерений.41. Требования безопасности.91.

Литература

9.

139. Область применения и сущность метода.

140. Пробоподготовка жиросодержащих пищевых продуктов включает в себя три этапа: расплавление жировой фракции, растворение жировой фракции в тетрагидрофуране и последующее фильтрование получаемого раствора от возможно попавших нежировых примесей.

141. Полученный раствор подвергают хроматографическому разделению методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии на колонке с твердым сорбентом, -химически модифицированным силикагелем.

142. Детектирование анализируемых компонентов осуществляют при длинах волн, отвечающих области их максимального поглощения в УФ спектрах.

143. Аппаратура, материалы и реактивы.

144. Колонка хроматографическая Hypersil MOS, длиной 200 мм, с внутренним диаметром 2,1 мм и размером зерна 5 мкм производства Хьюлетт Паккард, США (№ в каталоге фирмы Хьюлетт Паккард: 79 916МО-572);

145. Дозаторы пипеточные с постоянным и изменяемыми объемами доз 0,500−0,2000,050−0,025 с суммарной погрешностью + 1,5% отн.;

146. Одноразовые пластиковые наконечники для пипеток-дозаторов с вышеуказанными объемами доз;

147. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709–72;

148. Ацетонитрил для хроматографии «LiChrosolv» фирмы Merck, номер по каталогу № 1.14 291.2500;

149. Тетрагидрофуран, х.ч., (№ в каталоге Aldrich 29,310−5);

150. Одноразовые химически стойкие фильтры ЗОЮ, 45 мкм фирмы «Schleicher & Schuell» (№ в каталоге фирмы Хьюлетт Паккард: 3150−0754);

151. Гелий очищенный марки, А по ТУ 51−940−80- Воздух класса 0 по ГОСТ 17 433.

152. Допускается применение других средств измерения с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов по качеству не ниже указанных.3. Подготовка пробы.

153. Для расплавления жиров и масло-маргариновой продукции оптимальный результат достигается при использовании бытового фена. Для расплавления берут навеску образца массой приблизительно 1 г.

154. Полученный раствор подвергают хроматографическому разделению.4. Проведение измерений.

155. Подготовка прибора к выполнению измерений.

156. Жидкостной хроматограф HP 1090 с диодной матрицей в качестве детектора (DAD HP 1090) эксплуатируют в соответствии с инструкцией по эксплуатации.41.1 Определение молекулярных форм триацилглицеринов жировой фракции образцов.

157. Исследуемый образец подвергают пробоподготовке в соответствии с п. 3 настоящих методических рекомендаций.

158. Разделение проводят на хроматографической колонке Hypersil MOS С8, длиной 200 мм, с внутренним диаметром 2,1 мм и размером зерна 5 мкм.

159. В качестве элюентов используют смесь дистиллированной воды (А) и ацетонитрила (Б).

160. Условия хроматографического разделения: температура колонки 60 С-скорость потока 0,8 млмин-объем анализируемой пробы 3 мкл.;

161. Параметры работы диодной матрицы: длины используемых волн 215 нм, ширина полосы 20 нм- 240 нм, ширина полосы 20 нм- 280 нм, ширина полосы 20 нмконтрольная длина волн — 450 нм, ширина полосы 80 нм.

162. Программа градиентного элюирования: — начало анализа 87% Б— увеличение концентрации Б с 87% до 100%, 25 мин.— концентрация Б -100% без градиента 10 мин. анализа-продолжительность анализа 45 мин.;

163. Проводят два последовательных ввода пробы в хроматограф.

164. Повторяемость времени удерживания (RT) триацилглицеринов стандартной смеси < 0,7%.

165. Повторяемость площадей пиков триацилглицеринов стандартной смеси < 8%. Область измерения — триацилглицерины с ECN от 22 до 56.41.2 Идентификация молекулярных форм триацилглицеринов жировых фракций.

166. Идентификация обнаруживаемых пиков осуществляется с помощью ЭВМ. Идентификация основана на зависимости между относительным приведенным временем удерживания ИТ (К') и ЕСМ индивидуальных ТАГ.

167. В программе идентификации используются следующие данные: состав жирных кислот триацилглицеринов, времена удерживания стандартов ТАГ, времена удерживания пиков на полученной хроматограмме, время «мертвого объема» для данной хроматографической системы.

168. Программа автоматически определяет соответствующий ТАГ для каждого пика хроматограммы, учитывая состав жирных кислот триацилглицеринов в исследуемом жире.

169. Полученные данные о качественном составе ТАГ сравниваются с литературными для каждого вида масел и жиров.

170. Одновременно возможно сравнение получаемой хроматограммы с хроматограммами стандартных образцов масел и жиров из библиотеки прибора .

171. На Рис. 1 и Рис. 1а приведены хроматограммы стандартных смесей триацилглицеринов.

172. Рис. 1 Хроматограмма стандартной смеси ТАГ (ТпС18:3, ТпС18:2, ТпС18:1) *-Гидроперекись (ТпС 18:3) ** Гидроперекись (ТпС18:2).

173. Рис. 1а Хроматограмма стандартной смеси ТАГ (ТпС8, ТпС 10, ТпС 12, ТпС 14, ТпС 16).

174. В стандарте, содержащем триацижлицерины с ненасыщенными кислотами в качестве радикалов (ЬЬЬ и ЬпЬпЬп) обнаруживаются дополнительные пики для каждого го указанных триацилглицеринов. Спектры этих соединений приведены на Рис. 3 и Рис За.1. С18:3.

175. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа с диодной матрицей в качестве детектора следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019−79 и с инструкцией по эксплуатации прибора.

176. Необходимо выполнять требования безопасности при использовании баллонов для газов по ГОСТ 949–73 и сжатого газа (гелия) по ТУ 51−940−80.

177. При работе с метанолом следует соблюдать правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ 6995–77.6.

Литература

.

178. Rothaupt Michael. Food analysis. A collection of analysis for food and beverages performed on modern analytical instrumentation. Hewlett Packard European Center, Waldbronn, 1994.

179. Susan M. Dyszel. Determination of the Country of Origin of Pistachio Nuts by DSC and HPLC. U.S. Customs Service. JAOCS, Vol. 67, no. 12, 1990.

180. J. Gresti, M. Bugaut. Composition of Molecular Species of Triacylglycerols in Bovine Milk Fat. J. of Dairy Science, no. 76, 1993, pp. 1850−1869.

181. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТАМОЖЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ.

182. ЦЕНТРАЛЬНАЯ ТАМОЖЕННАЯ ЛАБОРАТОРИЯ.

183. Методические рекомендации по определению состава жирных кислот триацилглицеринов жиров, масел и прочих жиросодержащих продуктов методом капиллярной газовой хроматографии с масс-селективным детектированием1. Согласовано:

184. Начальник экспертно-исследовательского отдела товаров органического происхождения, леса, текстиля и изделий из них1. Л. М. Фомина.

185. Ответственные исполнители:

186. Главный инспектор Ведущий инспектор Ведущий инспектор

187. С. А. Климов Р.И. Глебов Г. А. Новикова1. Москва -1997 г. 1. Содержание.

188. Область применения и сущность метода.3.

189. Аппаратура, материалы и реактивы.33. Подготовка пробы. 54. Проведение измерений.65. Обработка результатов.86. Требования безопасности.97.

Литература

10.

190. Область применения и сущность метода.

191. Метод состоит из трех основных стадий: подготовка пробы, проведение измерений и обработки результатов.

192. Подготовка пробы представляет собой щелочной метанолиз триглицеридов жирных кислот с последующей этерификацией полученных кислот раствором BF3 в метаноле и экстракцией образующихся метиловых эфиров гексаном.

193. В результате обработки результатов, произведенной методом внутренней нормализации, определяется жирнокислотный состав продукции, который сравнивается со справочным.

194. Метод пригоден для идентификации и определения фальсификации продукции.

195. Аппаратура, материалы и реактивы.

196. Микрошприц HP 9301−0246 вместимостью 10 мм³, ценой деления 0.2 мм3 или МШ-10М по ТУ 5Е 2−833−106;

197. Весы лабораторные по ГОСТ 24 104–88 2-го класса до 200 г;

198. Мешалка магнитная с подогревом ММ-5;

199. Секундомер по ГОСТ 5072–79 или аналогичного типа;

200. Колба коническая Кн-2−25 вместимостью 25 см³ по ГОСТ 25 336–82;

201. Холодильник ХШ-1−200-ХС по ГОСТ 25 336–82, обратный;

202. Пипетки 6−2-5, 3−2-10 по ГОСТ 25 336–82;

203. Пробирка с делениями до 10 см³ с пришлифованной пробкой по ГОСТ 1770–74;

204. Воронка делительная вместимостью 250 см³ с пришлифованной пробкой по ГОСТ 25 336–82;

205. Воронка коническая В-56 по ГОСТ 25 336–82;

206. Вата медицинская хлопковая;

207. Метанол, х.ч. по ГОСТ 6995–77;

208. Натрия хлорид по ГОСТ 4233–66.

209. Калий гидроокись по ГОСТ 4203–65;

210. Натрий сернокислый безводный ч.д.а. по ГОСТ 1166–76-н-Гексан ч.д.а. по МРТУ 6−09−6518−70 или гексан для хроматографии «LiChrosolv» фирмы Merck, номер по каталогу № 1.4 391.2500.

211. Газ-носитель гелий очищенный марки, А по ТУ 51−940−80.

212. В делительную воронку на 250 см³ помещают 20 см³ насыщенного раствора натрия хлорида, 3 см³ гексана и приготовленную пробуворонку встряхивают в течение 7 мин. Воронку оставляют до полного разделения фракций.

213. Экстракцию гексаном повторяют еще два раза, сливая гексановый слой в ту же пробирку. Доводят объем органических экстрактов в пробирке гексаном до метки 10 мл.

214. Проведение измерений. 4.1. Подготовка прибора к выполнению измерений.

215. Газовый хроматограф НР 5890 с масс-селективным детектором НР 5972А эксплуатируют в соответствии с инструкцией по эксплуатации.л.

216. Пробу объемом 2 мм³ отбирают микрошприцем вместимостью 10 мм³ и вводят в инжектор хроматографа.

217. Вместе с вводом образца необходимо обеспечить синхронный старт температурной программы и сбор хроматографических данных компьютером. Проводят два последовательных ввода пробы в хроматограф.

218. Определение жирных кислот Cs-C24 (растительные масла и др.): Устанавливают следующие условия разделения на хроматографе:

219. Газ-носитель гелий, поток 1 мл/мин.

220. Температура инжектора 250 °C;

221. Температура колонки начальная — 140 °C, выдержка 4 мин.

222. Градиент 10 град/мин до 210 °C, выдержка 4 мин.

223. Градиент 3 град/мин до 270 °C, выдержка 2 мин.

224. Время включения нити накала: 2,5 мин.

225. Остальные параметры хроматографирования, а также работы масс-селективного детектора аналогично указанным в п. 4.2.

226. Условия определения присутствия масляной кислоты С4 в жировых смесях на основе растительных жиров с низким содержанием сливочного масла.

227. Устанавливают режим сканирования селективно выбранных ионов (SIM): для регистрации пика метилового эфира масляной кислоты выбирают ионы т/е 87М-СН3.+, 74, 102[М]+.

228. Остальные необходимые для анализа параметры работы масс-селективного детектора аналогичны указанным в п.п. 4.2 и 4.3.

229. Идентификация метиловых эфиров жирных кислот.

230. Идентификацию метиловых эфиров жирных кислот проводят путем сравнения полученных масс-спектров с библиотечными масс-спектрами органических соединений.

231. Порядок выхода метиловых эфиров жирных кислот из хроматографической колонки и регистрация их по значениям времен удерживания в условиях анализа по п. 4.2 представлены в таблице 1.