Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Метаболические аспекты биосинтеза полигидроксибутирата/валерата аэробными метилобактериями

Диссертация: Метаболические аспекты биосинтеза полигидроксибутирата/валерата аэробными метилобактериями
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

До сих пор себестоимость ГГГБ/В служит основным препятствием широкому использованию в промышленном масштабе. Одной из причин является высокая цена субстратов для культивирования микроорганизмов, которая достигает треть стоимости биополимера (Вугош, 1987). Как известно, метилотрофные бактерии с сериновым путем Ci метаболизма накапливают значительное количество ПГБ (Trotsenko et al., 1992). Метанол… Читать ещё >

Содержание

  • ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
  • Глава 1. Биосинтез бактериальных полигидроксиалканоатов
    • 1. 1. История вопроса
    • 1. 2. Внутриклеточная локализация ПГА
    • 1. 3. Пути биосинтеза ПГА у микроорганизмов
    • 1. 4. Деградация ПГБ
    • 1. 5. Биосинтез ПГА при культивировании бактерий на различных субстратах
    • 1. 6. Регуляция биосинтеза ПГБ
  • Глава 2. Биотехнологические аспекты синтеза биополимера
    • 2. 1. Методы анализа ПГА
    • 2. 2. Физико-химические свойства и сферы применения ПГА
    • 2. 3. Факторы, определяющие экономику производства ПГА
    • 2. 4. Способы культивирования различных бактерий — продуцентов ПГА
    • 2. 5. Перспективы производства ПГА
    • 2. 6. Метилотрофные бактерии как продуценты ПГБ/В 34 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТ
  • Глава 3. Объекты и методы исследования
    • 3. 1. Объекты исследования и условия культивирования
    • 2. Изучение влияния различных компонентов среды на биосинтез ПГБ
      • 3. 3. Биосинтез ПГБВ
      • 3. 4. Культивирование в ферментере
      • 3. 5. Анализ распределения 14С в ССЬ, ПГБ/В и клеточных компонентах
      • 3. 6. Динамика включения радиоуглерода
      • 3. 7. Ингибиторный анализ
      • 3. 8. Экстракция и измерение внутриклеточного содержания НАД (Ф)Н
      • 3. 9. Методы определение активности ферментов
      • 3. 10. Нативный электрофорез
      • 3. 11. Гель-хроматография
      • 3. 12. Методы количественного анализа ПГБ/В
      • 3. 13. Определение метаболитов в культуральной жидкости
      • 3. 14. Методы анализа физико-химических свойств ПГБ/В
      • 3. 15. Аналитические методы 50 РЕЗУЛЬТАТЫ
  • Глава 4. Новый метод анализа ПГБ/В с использованием ВЭЖХ
  • Глава 5. Биосинтез ПГБ/В метилобактериями
    • 5. 1. Отбор штаммов-продуцентов ТТГБ
    • 5. 2. Влияние компонентов минеральной среды на синтез ПГБ у метилобактерий
    • 5. 3. Биосинтез ПГБВ M. extorquens, M. helvetica и P. methylutens при культивировании на различных соединениях
    • 5. 4. Подбор оптимальных концентраций пропанола и пентанола для биосинтеза ПГБВ
    • 5. 5. Свойства ПГБ/В: температура плавления и молекулярный вес
    • 5. 6. Ферменты биосинтеза и деградации ПГБ у M. extorquens и M. helvetica
    • 5. 7. Ферменты метаболизма пропанола и пентанола у M. extorquens, M. helvetica
  • Глава 6. Физиолого-биохимические особенности биосинтеза ПГБ/В у M. extorquens
    • 6. 1. Биосинтез ПГБ/В M. extorquens при периодическом культивировании в ферментере
    • 6. 2. Метаболические изменения при культивировании M. extorquens на метаноле и на смеси метанола/пентанола
    • 6. 3. Уровни внеклеточных метаболитов при культивировании M. extorquens на метаноле
  • Глава 7. Анализ углеродных потоков в С02, ПГБ/В и биомассу при росте метилобактерий на различных субстратах
    • 7. *1. Анализ углеродных потоков при росте на метаноле, ацетате и бутирате
      • 7. 2. Математическая модель метаболизма метанола и ацетата
      • 7. 3. Влияние ингибиторов на биосинтез ПГБ и внутриклеточное содержание НАД (Ф)Н
      • 7. 4. Включение 14С из пропанола, пентанола, пропионата и валерата в СО2, ПГБВ и биомассу 90 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
  • ВЫВОДЫ юо
  • СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Метаболические аспекты биосинтеза полигидроксибутирата/валерата аэробными метилобактериями (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность проблемы: Многие прокариоты синтезируют и запасают поли-3-гидроксибутират (ПГБ) при несбалансированных условиях роста (дефицит азота, фосфатов, кислорода или магния) в виде цитоплазматических гранул. Биополимер обладает полезными свойствами — биоразлагаемостью, биосовместимостью, термопластичностью — и поэтому имеет очевидное практическое значение для биотехнологии, сельского хозяйства и медицины.

Введение

3-гидроксивалерата (ЗГВ) в ПГБ существенно улучшает физико-химические свойства полимера. Сополимер 3-гидроксибутирата/З-гидроксивалерата (ГТГБВ) обладает большей прочностью и эластичностью (уменьшается модуль Юнга с увеличением фракции ЗГВ в ПГБВ), чем ПГБ, и поэтому более перспективен как биоразлагаемый заменитель персистентных химических полимеров (Anderson and’Dawes, 1990).

До сих пор себестоимость ГГГБ/В служит основным препятствием широкому использованию в промышленном масштабе. Одной из причин является высокая цена субстратов для культивирования микроорганизмов, которая достигает треть стоимости биополимера (Вугош, 1987). Как известно, метилотрофные бактерии с сериновым путем Ci метаболизма накапливают значительное количество ПГБ (Trotsenko et al., 1992). Метанол является одним из потенциальных субстратов для производства биополимера, так как имеет низкую цену, высокую чистоту, небольшую плотность и хорошую растворимость в воде. Однако физиолого-биохимические основы биосинтеза ПГБ/В у аэробных метилобактерий до сих пор не ясны, что существенно ограничивает возможности реализации этого перспективного процесса в биотехнологии.

Создание промышленных производств на основе микробиологического синтеза биополимера требует детального и всестороннего изучения штаммов-продуцентов, в том числе исследования метаболизма субстратов. Это позволит оценить потенциальные возможности штаммов и разработать подходы к улучшению их производственных характеристик, снизить себестоимость биополимера.

Цель и задачи исследования

В связи с вышеизложенным понимание принципов метаболической организации метилотрофных продуцентов ПГБ/В было предпосылкой и целью данного исследования.

Для достижения указанной цели в работе решались следующие основные задачи:

1. Разработать быстрый и чувствительный метод определения ПГБ/В в микробной биомассе.

2. Подобрать метилотрофные продуценты и оптимальные условия их культивирования для биосинтеза ПГБ/В. Оценить физико-химические свойства биополимера.

3. Установить пути биосинтеза и деградации ПГБ/В и пути метаболизма косубстратов у метилотрофных продуцентов.

4. Определить источник НАД (Ф)Н для биосинтеза ПГБ/В у сериновых мепгилобактерий.

Научная новизна работы.' Разработан простой чувствительный метод количественного определения ПГБ/В в микробной биомассе с помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой Ci8 в изократическом режиме элюции.

В результате скрининга отобраны 3 продуцента ПГБ — Methylobacterium extorquens, Methylopila helvetica и Paracoccus methylutens. Обнаружено, что метилобактерии накапливают ПГБВ в присутствии пропанола, пентанола, пропионата и валерата, при этом добавление С5-субстратов приводит к более высокому содержанию ЗГВ в составе сополимера, нежели внесение Сз-соединений. P. methylutens синтезирует ГГГБВ также в присутствии глицерина и гептана.

Впервые установлены пути метаболизма пропанола и пентанола у M. extorquens и M.helvetica. Радиоизотопным методом показано у M. extorquens существование нового альтернативного пути окисления пропионил-КоА и валерил-КоА, связанного с декарбоксилированием первого углеродного атома.

У M. extorquens и M. helvetica определены ферменты биосинтеза и деградации ПГБ, Обнаружено, что только НАДФН-зависимая ацетоацетил-КоА редуктаза участвует в биосинтезе полимера. Выявлены различия в путях деградации ПГБ.

Впервые определены скорости образования С02, ПГБ/В и биомассы при росте на С! и Cn-субстратах. Разработана математическая модель, описывающая метаболизм этих субстратов у сериновых метилобактерии. Показано, что при росте бактерий на метаноле скорость образования НАДФН в цикле Кребса не обеспечивает скорость биосинтеза ПГБ и биомассы.

У M. extorquens и M. helvetica выявлены активности НАД (Ф)-зависимых дегидрогеназ метилентетрагидрометаноптерина и метилентетрагидрофолата. Результаты радиоуглеродного, энзимологического, ингибиторного анализа и математического моделирования метаболических потоков у сериновых метилобактерий свидетельствуют об участии тетрагидрофолатного и/или тетрагидрометаноптеринового/метанофуранового путей переноса одноуглеродных фрагментов в генерировании НАДФН для биосинтеза ПГБ при метилотрофном росте.

Практическое значение работы. Разработанный нами метод анализа ПГБ/В достаточно прост и чувствителен, что позволяет оперативно проводить серийные анализы микробной биомассы и контролировать кинетику накопления биополимера в процессе ферментации.

Отобраны метилотрофные штаммы, активно синтезирующие ПГБ/В. Установлен спектр косубстратов, культивирование на которых приводит к биосинтезу ПГБВ, подобраны их оптимальные ростовые концентрации. В связи с этим результаты работы могут представлять практическую ценность при разработке способов получения ПГБВ.

Полученные данные по метаболической организации у штаммов-продуцентов ПГБ/В могут служить основой для их направленного культивирования с целью повышения эффективности биотехнологического процесса.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях «Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 1995 г.) и «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 1996 г.), на международных симпозиумах «Bacterial Polyhydroxyalcanoates» (Davos, 1996 г.) и «Biochemical principles and mechanisms of biosynthesis and biodegradation of polymers» (Munster, 1998 г.), a также на стендовых сессиях научных работ ИБФМ РАН (Пущино, 1995, 1997, 1998 гг.). В целом работа обсуждена на совместном семинаре отдела биохимии микроорганизмов и лаборатории радиоактивных изотоповю.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания методов исследования, изложения результатов (4 главы), обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 27 таблиц, 16 рисунков.

Список литературы

содержит 146 источников литературы.

выводы.

1. Разработан быстрый и чувствительный метод анализа полигидроксибутирата (ПГБ) и его сополимера с 3-гидроксивалератом (ГТГБВ) посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе Cig. Метод использовался для количественного определения содержания ГТГБВ в образцах биомассы метилобактерий и скрининга активных продуцентов.

2. Обнаружено, что сериновые метилобактерии Methylobaclerium extorquens и Methylopila helvetica активно синтезируют ПГБВ на смесях метанола с пропанолом, пропионатом, пентанолом или валератом, включая в сополимер Cs-косубстраты эффективнее, чем Сз-соединения. С увеличением количества 3-гидроксивалерата в составе ПГБВ температура плавления полимера снижалась, а кристалличность уменьшалась. Молекулярный вес ПГБВ в среднем составлял 50 кДа и не зависел от соотношения мономеров.

3. Определены пути биосинтеза и деградации ПГБ у М. extorquens и М.helvetica. Отсутствие у них D-кротоназы свидетельствует о функционировании классического трех стадийного пути биосинтеза ПГБ с участием 3-кетотиолазы, НАДФН-зависимой ацетоацетил-КоА редуктазы и ПГБ-синтазы. Выявлены различия в путях деградации ПГБ: у M. extorquens присутствуют 3-гидроксибутиратдегидрогеназа и ацетоацетат-сукцинат КоА-трансфераза, а у М. helvetica функцию ацетоацетат-сукцинат КоА-трансферазы выполняет ацетоацетил-КоА синтетаза.

4. Показано, что в первичном метаболизме пропанола и пентанола у M. extorquens и М. helvetica участвуют ФМС-связанные алкогольи альдегиддегидрогеназы, а также ацил-КоА синтетаза. Найдено, что М. extorquens обладает новым путем декарбоксилирования пропионил-КоА и валерил-КоА, причем метанол стимулирует их декарбоксилирование и включение в ПГБВ.

5. Результаты радиоизотопного, энзимологического, ингибиторного анализов и математического моделирования метаболических потоков у сериновых метилобактерий свидетельствуют, что основным донором НАДФН для биосинтеза ПГБ/В является не цикл Кребса, а прямое окисление метанола с участием тетрагидрометаноптериново-го/метанофуранового пути.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Белова JI. JL, Соколов А. Р., Моргунов И. Г., Троценко Ю. А. 1997. Очистка и характеристика цитратсинтазы из Methylobacterium extorquens — метилотрофного продуцента полигидроксибутирата. Биохимия. Т. 62. С. 85−90.
  2. Л.В., Троценко Ю. А. 1983. Очистка и некоторые свойства диоксиацетонкиназы метилотрофных дрожжей Candida boidinii. Биохимия. Т. 48. С. 16 111 616.
  3. Н.В., Троценко Ю. А. 1979. Карбосилазы пирувата и фосфоенолпирувата у метилотрофов. Микробиология Т. 48. С. 202−206.
  4. Akita S., Einaga Y, Miyaki Y, Fujita H. 1976. Solution properties of poly (D-/?-hydroxybutyrate). 1. Biosynthesis and characterization. Macromolecules. V. 9. P. 774−780,
  5. A.J., Dawes E.A. 1990. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiol. Rev. V. 54. P. 450−472,
  6. С., Zatman L.J. 1964. The microbial oxidation of methanol. The methanol-oxidizing enzyme of Pseudomonas sp. M 27. Biochem. J. V. 92. P. 614−621.
  7. MM., Harder W. 1978. Formate assimilation of Hyphomicrobium X. FEMS Microbiol. Lett. V. 3. P. 111−114.
  8. W., Mothes G. 1978. Dissimilatorische Sequenzen in methylotrophen bakterien. Z. Allg. Mikrobiol. V. 18. P. 17−26.
  9. L.L., Sokolov A.P., Sidorov I.A., Trotsenko Y.A. 1997. Purification and characterization of NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase from Methylobacterium exlorquens. FEMS Microbiol. Lett. V. 156. P. 275−279.
  10. M.A., Quayle J.R. 1970. Microbial growth on oxalate by a route not involving glyoxylate carboligase. Biochem. J. V. 118. P. 53−59.
  11. Bluhm T L., Hamer G.K., Marchessault R H., Fyfe C A., Veregin R.P. 1986. Isodimorphism in bacterial poly (/?-hydroxybutyrate-co-/?-hydroxyvalerate). Macromolecules. V. 19. P, 28 712 876.
  12. D., Pomerleau Y., Groleau D. 1995. High-cell-density production of po1y-,#-hydroxybutyrate (PHB) from methanol by Methylobacterium exlorquens production of high-molecular-mass PHB. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 44. P. 367−376.
  13. G., Sonnleither B., Lalferty R.M. 1978. A rapid method for the determination poly-/?-hydroxybutyric acid in microbial biomass. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 6. P. 2937.
  14. D. 1987. Polymer synthesis by microorganisms: technology and economics. Trends Biotechnol. V. 5. P. 246−250.
  15. L., Lidstrom M.E. 1994. Genetics of the serine cycle in Methylobacterium exlorquens AMI: identification of sgaA and rnldA and sequences of sgaA, hprA, and in Id A. J. Bacteriol. V. 176. P. 1957−1968.
  16. L., Vorholt J.A., Thauer R.K., Lidstrom M.E. 1998. Ci transfer enzymes and coenzymes linking methylotrophic bacteria and methanogenic archaea. Science. V. 281. P. 99 102.
  17. Y., Hall K.J., Oldham W.K. 1988. Determination of poly-/?-hydroxybutyrate and poly-^-hydroxyvalerate in activated sludge by gas-liquid chromatography. Appl. Environ. Microbiol. V. 54. P. 2325−2327.
  18. Copeland L., Quinnell R.G., Day D.A. 1989. Malic enzyme activity in bacteroids from soybean nodules. J. Gen. Microbiol. V. 135. P. 2005−2011.
  19. Cornibert J., Marchessault R H., Benoit H., Weill G. 1970. Physical properties of po. y (?-hydroxybutyrate). TTT. Folding of helical segments in 2,2,2-trifluoroethanol. Macromolecules V. 3. P. 741−746.
  20. B.J. 1964. Disk electrophoresis-11. Method and application to human serum proteins. Ann. N. Y. Acad. Sei. V. 121. P. 404−427.
  21. E.A., Senior P.J. 1973. The role and regulation of energy reserve polymers in microorganisms. Adv. Microbiol. Physiol. V. 10. P. 135−266.
  22. E.A. 1988. Polyhydroxybutyrate: an intriguing biopolymer. Bioscience Reports. V. 8. P. 537−547.
  23. De Smet M.J., Eggink G., Witholt B., Kingma J., Wynberg H. 1983. Characterization of intracellular inclusions formed by Pseudomonas oleovorans during growth on octane. J. Bacteriol. V. 154. P. 870−878.
  24. Doi Y., Kunioka M., Nakamura Y., Soga K. 1986. Nuclear magnetic resonance studies on poly (/?-hydroxybutyrate) and a copolyester of /^-hydroxybutyrate and /3-hydroxyvalerate isolated from Alcaligenes eutrophus H 16. Macromolecules. V. 19. P. 2860−2864.
  25. Doi Y., Tanaki A., Kunioka M., Soga K. 1987a. Biosynthesis of terpolyesters of 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate and 5-hydroxyvalerate from 5-chloropentanoic and pentanoic acids. Makrom. Chem. Rapid. Commun, V. 8. P. 631−635.
  26. Doi Y., Kunioka M., Nakamura Y., Soga K. 1987b. Biosynthesis of copolyesters in Alcaligenes eutrophus H 16 from 13C-labeled acetate and propionate. Macromolecules. V. 20. P. 2988−2991.
  27. Doi Y, Segawa A., Kunioka M. 1990. Biosynthesis and characterization of po1y (3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) in Alcaligenes eutrophus. Int. J. Biol. Macromol. V. 12. P. 106−111.
  28. Ellar D, Lundgren DG, Okamura K., Marchessault R.H. 1968. Morphology of poly-/?-hydroxybutyrate granules. J. Mol. Biol. V. 35. P. 489−502.
  29. R.H., White D.C. 1983. Polymerie beta-hydroxyalkanoates from environmental samples and Bacillus megaterium. Appl. Environ. Microbiol. V. 45. P 71−78.
  30. H., Erdmann S., Holler E. 1989. An unusual polyanion from Physarum polycephalum that inhibits homologous DNA polymerase in vitro. Biochemistry. V. 28. P. 52 195 226.
  31. Fukui T., Ito M., Tomita K. 1982. Purification and characterization of acetoacetyl-CoA synthetase from Zoogloea ramigera I-16-M. Eur. J. Biochem. V. 127 P. 423−428.
  32. Fukui T., Ito M., Saito T., Kenkichi T. 1987. Purification and characterization NADP-linked acetoacetyl-CoA reductase from Zoogloea ramigera I-16-M. Biochem. Biophys. Acta. V. 917. P. 365−371.
  33. Fuller R.C., O’Donell J.P., Saulnier J., Redlinger T.E., Foster J., Lenz R.W. 1992. The supramolecular architecture of the polyhydroxyalkanoate inclusions in Pseudomonas oleovorans. FEMS Microbiol. Rev. V. 103. P. 279−288.
  34. Garrigues C., Loubiere P., Lindley N.D., Cocaign-Bousquet M. 1997. Control of the shift from homolactic acid to mixed-acid fermentation in Lactococcus lactis predominant role of the NADH/NAD+ ratio. J. Bacteriol. V. 179. P. 5282−5287.
  35. N., Murray E.J., Holmes P.A. 1984. The thermal degradation of poIy-(D)-/?-hydroxybutyric acid. 1. Identification and quantitative analysis of products. Polym. Degrad. Stabil. V. 6. P. 47−61.
  36. Green D.E., Mii S., Mahler HR., Bock R.M. 1954. Studies on the fatty acid oxidizing system of animal tissues. Ill Butyryl coenzyme A dehydrohenase. J. Biol. Chem. V. 206. P. 1−12.
  37. R., Smith Z., Merrick J.M. 1968. Metabolism of poly-/?-hydroxybutyrate, and properties of native poly-/?-hydroxybutyrate granules fron Bacillus megaterium. Biochemistry. V. 7. P. 3676−3681.
  38. Gross RA., DeMello C., Lenz R.W., Brandl H., Fuller R.C. 1989. Biosynthesis and characerization of poly (/i-hydroxyalkanoates) produced by Pseudomonas oleovorans. Macromolecules. V. 22. P. 1106−1115.
  39. Haywood G.W., Anderson A.J., Chu L, Dawes F. A. 1988. The role of NADH and NADPH-linked acetoacetyl-CoA reductase in the poly-3-hydroxybutyrate synthesizing organism Alcaligenes eutrophus. FEMS Microbiol. Lett. V. 52. P. 259−264.
  40. G.W., Anderson A.J., Dawes E.A. 1989a. The importance of PHB-syntase substrate specificity in polyhydroxyalkanoate synthesis by Alcaligenes eutrophus. FEMS Microbiol. Lett. V. 57. P. 1−6.
  41. G.W., Anderson A. J., Dawes E.A. 1989b. A survey of the accumulation of novel polyhydroxyalkanoates by bacteria. Biotechnol. Lett. V. 11. P. 471−476.
  42. R.A., Jones C.W. 1997. Poly-3-hydroxybutyrate production by washed cells Alcaligenes eutrophus- purification, characterization and potential regulatory role of citrate synthase. Arch. Microbiol. V. 168. P. 486−492.
  43. H., Schlegel H.G. 1967. Hydrolyse von PHBS durch intracellulare depolymerase von Hydrogenomonas HI 6. Arch. Mikrobiol. V. 56. P. 278−299.
  44. P.J., Marchessault R.H. 1994. Biopolyesters. In Chemistry and technology of biodegradable polymers. Griffin G.J.L. (ed). Chapman and Hall. London. P. 48−96.
  45. S., Jolly A., Yasin M., Tighe B. 1987. Polymers for biodegradable medical devices. II. Hydroxybutyrate-hydroxyvalerate copolymers. Hydrolytic degradation studies. Biomaterials. V. 8. P. 289−296.
  46. Hollingsworth R.I., Abe M., Sherwood J.E., Dazzo F.B. 1984. Bacteriophage-induced acidic heteropolysaccharide lyases that convert the acidic heteropolysaccharides of Rhizobium trifolli into oligosaccharide units. J. Bacteriol. V. 160. P. 510−516.
  47. J.A. 1966. Microbial growth on Cl compounds. The role of folate in the metabolism of Pseudomonas AMI. Biochem. J. V. 99. P. 389−395.
  48. P.A., Wright L.F., Collins S.H. 1981. Beta-hydroxybutyrate polymers. Eur. Patent Appl. 52 459.
  49. Holmes P A. 1985. Applications of PHB a microbially produced biodegradable thermoplastic. Phys. Technol. V, 16. P. 32−36,
  50. A.A., Kornberg H.L. 1964. Oxaloacetate 4-carboxy-lyase from Pseudomonas ovalis Chester. Biochim. Biophys. Acta. V. 89. P. 318−381.
  51. Jackson F A., Dawes E.A. 1976, Regulation of the tricarboxylic acid cycle and poly-/?-hydroxybutyrate metabolism in Azotobacter beijerinckii grown under nitrogen or oxygen limitation. J. Gen. Microbiol. V. 97. P. 303−312.
  52. Jendrossek D., Frisse A., Behrends A., Andermann M., Kratzin H D., Stanislawski T., Schlegel H.G. 1995. Biochemical and molecular characterization of the Pseudomonas lemoignei polyhydroxyalkanoate depolymerase system. J. Bacteriol. V. 177. P. 596−607.
  53. P.A., Quayle J.R. 1964. Microbial growth on Crcompounds. Oxidation of methanol, formaldehyde and formate of methanol-grown of Pseudomonas AMI. Biochem. J. V. 93. P. 281−290.
  54. R.R., Lafferty R.M., Knackmuss H.J. 1975. A simple method for the determination of poly-y9-hydroxybutyric acid in microbial biomass. Eur. J. Appl. Micrbiol. V. 1. P. 233−237.
  55. D.B., Waters J.K., Emerich D.W. 1983. Analysis of poly-/?-hydroxybutyrate in Rhizobium japonicum bacteroids by ion-exchange high-pressure liquid chromatography and UV detection. Appl. Environ. Microbiol. V. 46. P. 1339−1344.
  56. Kim B.S., Lee SC., Lee S.Y., Chang H.N., Chang Y.K., Woo S.L. 1994. Production of poly (3-hydroxybutyric acid) by fed-batch culture of Alcaligenes eulrophus with glucose concentration control. Biotechnol. Bioeng. V. 43. P. 892−898.
  57. Kim S.W., Kim P., Lee H.S., Kim J.H. 1996. High production of poly-/^-hydroxybutyrate (PHB) from Methylobacterium organophilum under potassium limitation. Biotechnol. Lett. V. 18. P. 25−30.
  58. P.P. 1982. Biotechnology. An industrial view. J. Chem. Tech. Biotechnol. V. 32. P. 28.
  59. KuniokaM.Y., Kawaguchi Y., Doi Y. 1989. Production of biodegradable copolyesters of 3-hydroxybutyrate and 4-hydroxybutyrate by Alcaligenes eulrophus. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 30. P. 569−573.
  60. Large P.J., Peel D., Quayle J R. 1961. Microbial growth on Ci compounds. 2. Synthesis of cell constituents by methanol- and formate-grown Pseudomonas AMI, and methanol-grown Hyphomicrobium nlgare. Biochem. J. V. 81. P. 470−479.
  61. Law J.H., Slepecky R A. 1961. Assay of poly-/?-hydroxybutyric acid. J. Bacteriol. V. 82. P.1. JJ-JO.
  62. Lee S.Y., Yim K.S., Chang H.N., Chang Y.K. 1994. Constaiction of plasmids, estimation of plasmid stability, and use of stable plasmids for the production of poly (3-hydroxybutyric acid) by recombinant Escherichia coli. J. Biotechnol. V. 32. P. 203−211.
  63. Lee S.Y., Chang H.N. 1995. Production of poly (hydroxyalkanoic acid). Adv Biochem. Eng. Biotechnol. V. 52. P. 27−58.
  64. Lee Y., Kim M.K., Chang H.N., Park Y.H. 1995. Regulation of poly-/?-hydroxybutyrate biosynthesis by nicotinamide nucleotide in Alcaligenes eutrophus. FEMS. Microbil. Lett. V. 131. P. 35−39.
  65. Lee S.Y. 1996. Plastic bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria. Tibtech. V. 14. P. 431−438.
  66. Lee Y., Kim M.K., Park Y.H., Lee S.Y. 1996. Regulator}' effects of cellular nicotinamide nucleotides and enzyme activities on poly (3-hydroxybutyrate) synthesis in recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. V. 52. P. 707−712.
  67. Lee S.Y., Middeiberg A.P.J, Lee Y.K. 1997. Poly (3-hydroxybutyrate) production from whey using recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Lett. V. 19. P. 1033−1035.
  68. G., Rocher M., Braunegg G. 1997. Effects of low dissolved-oxyden concentrations on poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) production by Alcaligenes eutrophus. Appl. Environ. Microbiol. V. 63. P. 827−833.
  69. M. 1926. Products of dehydration and of polymerization of /?-hydroxybutyric acid. Bull. Soc. Chem. Biol. V. 8. P. 33−36.
  70. Lie S., Steinbuchel A. 1996. Investigation of poly (/?-L-malic acid) production by strains of Aureobasidiumpullulans. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 46. P. 273−278,
  71. M., Hustede E., Timm A., Steinbuchel A., Fuller R.C., Lenz R.W., Schlegel G. 1991. Formation of poly (3-hydroxya1kanoates) by phototrophic and chemolithotrophic bacteria. Arch. Microbiol. V. 155. P. 415−421.
  72. Lowry O H, Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. V. 193. P. 265−275.
  73. D.G., Pfister R.M., Merrick J.M. 1964. Structure of poly (/*-hydroxybutyric acid) granules. J. Gen. Microbiol. V. 34. P. 441−446.
  74. Marchessault R.H., Okamura K., Su C.J. 1970. Physical properties of po1y (/?-hydroxybutyrate). II. Conformation aspects in solution. Macromolecules, V. 3. P. 735−740.
  75. I.W., Attwood M.M. 1982. A possible alternative mechanism for the oxidation of formaldehyde to formate. J. Gen. Microbiol. V. 128, P. 1441−1446.
  76. K. 1982. Short-chain acyl-coenzyme A synthetases in Rhodopseudomonas sphaeroides. J. Biochem. V. 91. P. 725−730.
  77. G.J., Merrick J.M. 1969. Metabolism of poly-/^-hydroxybutyrate. II. Enzymatic synthesis of D (-)-/?-hydroxybutyry! coenzyme A by enoyl hydratase from Rhodospirillum rubrum. Biochemistry. V. 8. P. 2748−2755.
  78. Mothes G, Babel W. 1994. Methylobacterium rhodesianum MB 126 possesses two acetoacetyl-CoA reductases. Arch. Microbiol. V. 161. P. 1441−1446.
  79. G., Babel W. 1995. Methylobacterium rhodesianum MB 126 possesses two stereospecific crotonyl-CoA hydratases. Can. J. Microbiol. V. 41. P. 68−72.
  80. T., Saito T., Tomita K. 1978. Purification and properties of P-ketothiolase from Zoogloeaa ramigera. Arch. Microbiol. V. 116. P. 21−27.
  81. O’Brien WE., Brewer J.M., Ljungdahl LG 1973. Purification and characterisation of thermostable 5,10-methylenetetrahydrofolate dehydrogenase from Clostridium thermoaceticum. J. Biol. Chem. V. 2−18. P. 403−408.
  82. V., Schlegel H.G. 1973. /WKetothiolase from Hydrogenomonas eutropha H16 and its significance in the regulation of poly-/^-hydroxybutyrate metabolism. Biochem. J. V. 134. P. 239−248.
  83. I., Merrick J.M. 1968. Identification of propionate as an endogenous CO2 acceptor in Rhodospirillum rubrum and properties of purified propionyl-coenzyme A carboxylase. J Bacteriol. V. 95. P. 1774−1778.
  84. W.J., Cornish A. 1993. Growth of Azotobacter vinelandii UWD in fish peptone medium and simplified extraction of poly-/?-hydorxybutyrate. Appl. Environ Microbiol. V. 59. P. 4236−4244.
  85. Park J.S., Lee Y.H. 1996. Metabolic characteristics of isocitrate dehydrogenase leaky mutant of Alcaligenes eutrophus and its utilization of poly-/?-hydroxybutyrate production. J. Ferment. Bioeng. V. 81. P. 197−205.
  86. Y., Nawrath C., Somerville C. 1995. Production of polyhydroxyalkanoates, a family of biodegradable plastics and elastomers, in bacteria and plants. Biotechnology. V. 13. P. 142 150.
  87. H., Kingma J., Witholt B. 1991. Physiology and polyester formation of Pseudomonas oleovorans in continuous two-liquid-phase cultures. Enzyme. Microb. Technol. V. 13. P. 770−780.
  88. H., Hazenberg W., Witholt B. 1993b. Continuous production of poly (3-hydroxyalkanoates) by Pseudomonas oleovorans in a high-cell-density, two-liquid-phase chemostat. Enzyme. Microb. Technol. V. 15. P. 311−316.
  89. Pronk J.T., Linder-Beuman A., Verduyn C, Schefifers W.A., Dijken J.P. 1994 Propionate metabolism in Sacchoromyces cerevisial: implications for the metabolon hypothesis. Microbiol. V. 140. P. 717−722,
  90. J.R. 1980. Aspects of regulation of methylotrophic metabolism. FEBS Lett. V. 117. P. 16−27.
  91. Raemakers-Franken P.C., Korstee A.J., van der Drift C., Vogels G. D 1990. Methanogenesis involving a novel carrier of Ci compounds in Methanogenium talionis. J. Bacteriol. V. 172. P. 1157−1159.
  92. Reeves H.C., Rabin R., Wegener W.S., Aje S.L. Assays of enzymes of the tricarboxilic acid and glioxylate cycles. Methods in microbiology, Norris J.R. and Ribbons W.W. (ed.) Acad. Press. V. GA.
  93. Reusch R.N., SadoflfH.L. 1983. D (-)-Po1y-/?-hydroxybutyrate in membranes of genetically competent bacteria. J. Bacteriol. V. 156. P. 778−788.
  94. R.N., Sadoflf H.L. 1988. Putative structure and functions of a poly-,/2-hydroxybutyrate/calcium polyphosphate channel in bacterial plasma membranes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. V. 85. P. 4176−4180.
  95. R.N. 1989. Poly-/Ahydroxybutyrate/calcium polyphosphate complexes in eukarvotic membranes. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. V. 191. P. 377−381.
  96. Riis V., Mai W. 1988. Gas chromatographic determination of poly-/i-hydroxybutyric acid in microbial biomass after hydrochloric acid propanolysis. J. Chrornatogr. V. 445, P. 285−289.
  97. Ritchie G.A.R., Senior P.J., Dawes E.A. 1971. The purification and characterization NADP-linked acetoacetyl-CoA reductase from Azotobacler beijerinckii. Biochem. J. V. 121. P.309−316.
  98. Rodrigues M.F.A., da Silva L.F., Gomez J.G.C., Valentin H.E., Steinbuchel A. 1995. Biosynthesis of poly (3-hydroxybutyric acid co-3-hydroxy-4-pentenoic acid) from unrelated substrates by Bnrkholderia sp. Appl. Microbial. Biotechnol. V. 43. P. 880−886.
  99. T., Fukui T., Ikeda F., Tanaka Y., Tomita K. 1977. An NADP-linked acetoacetyl-CoA reductase from Zoogloea ramigera. Arch. Microbiol. V. 114. P. 211−217.
  100. P.J., Dawes E.A. 1973. The regulation of poly-3-hydroxybutyrate metabolism in Azotobacler beijerinckii. Biochem. J. V. 134. P. 225−238.
  101. K., Matsushina K., Fukumoto J., Yamato T. 1969. Poly-L-malic acid, a new protease inhibitor from Penicillium cyclopium. Biochem. Biophy. Res. Commun V. 35. P. 619 624.
  102. H., Fukui T., Saito T., Shirakura Y., Tomita K. 1981. An NAD-linked acetoacetyl-CoA reductase from Zoogloeaa ramigera I-16-M. Eur. J Biochem. V. 118. P. 53−59.
  103. A. 1991. Polyhydroxyalkanoic acids. In Biomaterials. Byrom D. (ed.) P. 123 213. MacMillan Publishers. Basingstoke.
  104. A., Pieper U. 1991. Production of a copolyester of 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyvaleric acid from single unrelated carbon sources by a mutant of Alcaligenes eutrophus. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 37. P. 1−6.
  105. A., Valentin HE., Schonebaum A. 1994. Application of recombinant gene technology for production of polyhydroxyalkanoic acids: biosynthesis of poly (4-hydroxybutyric acid) homopolyester. J. Environ. Polymer Degrad. V. 2. P. 67−74.
  106. A., Schmack G. 1995. Large-scale production of poly (3-hydroxyvaleric acid) by fermentation of Chromohacteriwn violaceum, processing, and characterization of the homopolyester. J. Environ. Polymer Degrad. V. 3. P. 243−258.
  107. A., Valentin H.E. 1995. Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids. FEMS Microbiol. Lett. V. 128. P. 219−228.
  108. E.S., Lenz R.W., Fuller R.C. 1995. The ordered macromolecular surface of polyester inclusion bodies in Pseudomonas oleovoram. Can. J. Microbiol. V. 41. P. 84−93.
  109. T., Yamane T., Schimizu S. 1986a. Mass production of poly-/^-hydroxybutyric acid by fed-batch culture with controlled carbon/nitrogen feeding. Appl. Microbiol. Biotechnoi. V. 24. P. 370−374.
  110. T., Yamane T., Schimizu S. 1986b. Mass production of poly-/?-hydroxybutyric acid by folly automatic fed-batch culture of methylotroph. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 23. P. 322−329.
  111. C., Lang S., Wagner R., Wray V., Witfe L. 1985. Chemical and physical characterization of four interfacial-active rhamnolipids from Pseudomonas spec. DSM 2874 grown on n-alkanes. Z. Naturforch V. 40. P. 61−67.
  112. I. J., Anthony C. 1976. Acetyl-CoA production and utilixation during growth of the facultative methylotroph Pseudomonas AM! on methanol, malonate and 3-hydroxybutyrate. J. Gen. Microbiol. V. 95. P. 134−143.
  113. Textor S" Wendisch V.F., De Graaf A.A., Muller U" Linder M I, Linder D, Buckel W. 1997. Propionate oxidation in Escherichia coli, evidence for operation of methvlcitrate cycle in bacteria. Arch. Microbiol. V. 168. P. 428−436.
  114. A., Byrom D., Steinbuchel A. 1990. Formation of blends of various poly (3-hydroxyalkanoic acids) by a recombinant strain of Pseudomonas oleovorans. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 33. P. 296−301.
  115. G., Scandola M., Briese B.H., Jendrossek D. 1996. Enzymatic degradation of bacterial poly (3-hydroxybutyrate) by a depolymerase from Pseudomonas iemoignei. Macromolecules. V. 29. P. 507−513.
  116. L., Saito T., Fukui T. 1983. Bacterial metabolism of poly-/i-hydroxybutyrate. P. 353−366. In Lennon D.L.F., Statman F.W., and Zahlten R.N. (ed.) Biochemistry of metabolic process. Elsevier Science Publishing. Inc. New York.
  117. S., Sato K., Shimizu S. 1978. Role of vitamin Bi2 and enzymes related to methylmalonyl-CoA mytase in a methanol-utiiizing bacterium Proiaminobacier ruber. J. Nutr. Sei. Vitaminol. V. 24. P. 477−489.
  118. S., Sato K., Shimizu S. 1981. Glyoxylate formation from mesaconyl-CoA and its related reactions in methanol-utiiizing bacterium, Proiaminobacier ruber. Agric. Biol. Chem. V. 45. P. 823−830.
  119. H.E., Steinbuchel A. 1994. Application of enzymatically synthesized short-chain-length hydroxy fatty acid coenzyme A thioesters assay of polyhydroxyalkanoic acid synthases. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 40. P. 699−709.
  120. J.A., Chistoserdova L., Lidstrom M.E., Thauer R. 1998. The NADP-dependent methylene tetrahydromethanopterin dehydrogenase in Methylokacterium extorque m AMI. J. Bacteriol. V. 180. P. 5351−5356.
  121. L.L., Rohwedder W.K. 1974. Poly-/^-hydroxyalkanoate from activated siudge. Environ. Sci. Technol. V. 8. P. 576−579.
  122. Wegener W.S., Reeves H.C., Rabin R., Ajl S.J. 1968. Alternate pathways of metabolism of short-chain fatty acids. Bacteriol. Rev. V. 32. P. 1−26.
  123. Whiteley H.R., Huennekens F.M.' 1962. Mechanism of reaction catalyzed by the formate-activating enzyme from Micrococcus aerogenes. J. Biol. Chem. V. 237. P. 1290−1297.
  124. T. 1993. Yield of poly-D (-)-3-hydroxybutyrate from various carbon sources: a theoretical study. Biotechnol. Bioeng. V. 41. P. 165−170.
  125. Yamane T., Fukunaga M., Lee Y.W. 1996a. Increased PHB productivity by high-cell-density fed-batch culture of Alcaligenes latus, a growth-associated PHB producer. Biotechnol. Bioeng. V. 50. P. 197−202.
  126. T., Chen X., Ueda S. 1996b. Growth-associated production of poly (3-hydroxyvalerate) from n-pentanol by a methylotrophic bacterium, Paracoccus denitnficans, Appl Environ. Microbiol. V. 62. P. 380−384.
  127. Yamane T, Chen X., Ueda S. 1996c. Polyhydroxyalkanoate synthesis from alcohols during the growth of Paracoccus denitrificans. FEMS Microbiol. Lett. V. 135. P. 207−211.
  128. Yoon S.C., Song J.J., Kim T.U. 1994. Isolation and characterization of Pseudomonas putida BM01 accumulating high amount of PHA, ul-!. Biodegradable plastics and polymers. In Doi Y, Fukuda K. (ed.) Elsevier Science B. V P. 400−409.
  129. H., Obias V., Gonyer K., Dennis D. 1994. Production of polyhydroxyalkanoates in sucrose-utilizing recombinant Escherichia coli and Klebsiella strains. Appl. Environ. Microbiol. V. 60. P. 1198−1205.
  130. Автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям Троценко Ю. А. и Дорониной Н. В. за плодотворное руководство при выполнении работы.
  131. Благодарю сотрудников лаборатории радиоактивных изотопов за постоянную товарищескую поддержку и помощь в работе.
Заполнить форму текущей работой

На отлично!