Разработка ПЦР тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей

Актуальность проблемы.

В последние годы были отмечены случаи поставок в Российскую Федерацию кормов, предназначенных для пушного звероводства, фальсифицированных, а также контаминированных тканями плотоядных животных. Использование такой продукции приносит большой экономический ущерб пушному звероводству из-за опасности распространения трансмиссивной энцефалопатии и алеутской болезни норок.

Алеутская болезнь норок (АБН) или вирусный' плазмоцитоз — высоко контагиозная болезнь норок и хорьков, возникающая вследствие персистентной вирусной инфекции. Она характеризуется медленным развитием инфекционного процесса и пожизненной виремией. В организме больных норок вирус находится в сыворотке крови, головном мозге, мезентериальных лимфатических узлах, почках, селезенке, печени, слюнных железах, кишечнике. Высокая восприимчивость животных к АБН, устойчивость возбудителя к внешним условиям, использование в качестве корма тушек забитых зверей и мясокостной муки из таких тушек (Самуйленко А.Я., 2002).обусловили широкое распространение инфекции во всех странах, где занимаются разведением норок.

Болезнь наносит огромный экономический ущерб зверосовхозам в связи с высокой смертностью (70−80%), ухудшением качества пушнины, снижением плодовитости самок и необходимостью проведения ограничительных и ветеринарно-санитарных мероприятий.

Значение мероприятий по выявлению фальсификации кормов для животных в последние годы также сильно возросло в связи с открытием новых видов прионных болезней сельскохозяйственных и домашних животных, относящихся к группе трансмиссивных губкообразных энцефалопатий (ГЭ). Особую опасность для пушного звероводства представляет трансмиссивная энцефалопатия норок (ТЭН).

Данное заболевание имеет длительный инкубационный период, сопровождается дистрофичными поражениями центральной нервной системы, развитием дегенеративного губкообразного состояния серого вещества головного мозга и 100%-ной летальностью. Возбудителем ТЭН, как и других трансмиссивных губкообразных энцефалопатий, является инфекционный прионный белок (РгР8с), представляющий собой конформационно измененную форму нормального прионного белка (РгРс). Известна лишь оральная передача инфекции. Основным источником заражения норок ТЭН являются корма, содержащие сырье от как больных ГЭ овец, коз, крупного рогатого скота, так и больных ГЭ пушных зверей.

Средства специфической профилактики данного заболевания не разработаны. Важнейшим мероприятием по предотвращению ТЭН, как и АБН, служит ветеринарно-санитарный контроль кормов, используемых в пушном звероводстве.

Существующие методы определения видовой принадлежности животных белков в составе корма, такие как иммунодиффузия в геле, изоэлектрическое фокусирование, РИД и ИФА оказываются малоэффективными, т.к. корма проходят термическую обработку, ведущую к денатурации белков, следствием чего является потеря ими видовой специфичности. Наиболее перспективным методом для определения видовой принадлежности ингредиентов животного происхождения в составе кормов является метод ПЦР.

С 1996 г. во всех странах Европейского Союза (ЕС) ввели запрет на скармливание животным мясокостной муки, приготовленной из млекопитающих. Однако из-за незаконного сбыта мясокостной муки в страны, не являющиеся членами ЕС, и фальсификации рыбной муки добавками протеинов млекопитающих по экономическим причинам риск заражения достаточно велик (Butler D., 1998, Worswick R., 2001).

В целях недопущения поставок на территорию Российской Федерации подобной продукции, в соответствии с письмом от 24.09.2004 № 13−3-6/1825 заместителя главного государственного ветеринарного инспектора Российской Федерации, запрещен ввоз на территорию РФ кормов, кормовых добавок и сырья для их производства, предназначенных для пушного звероводства, содержащих ткани жвачных и плотоядных.

Учитывая отсутствие тест-систем, необходимых для мониторинга и контроля импортируемых кормов, предназначенных для пушного звероводства, разработка тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в составе кормов для пушных зверей весьма актуальна. В отличие от белков ДНК более устойчива к термической обработке и не утрачивает своей информативной функции. Поэтому применение молекулярно-генетических методов, в частности полимеразной цепной реакции (ПНР) является перспективным для определения видовой принадлежности ДНК в составе продуктов и кормов, подвергавшихся термической обработке.

Цель и задачи исследования

.

Цель исследования — разработать тест-систему для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной цепной реакции.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Сконструировать олигонуклеотидные праймеры и разработать оптимальные параметры ПЦР для идентификации ДНК пушных зверей в кормах.

2. Оценить эффективность различных способов выделения ДНК из мясных кормов, комбикормов, премиксов, сухих кормов (в т.ч. рыбной и мясной муки).

3. Провести оценку аналитических характеристик ПЦР-тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей при тестировании кормов, поступающих по импорту в Россию.

4. Провести комиссионные испытания разработанной тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом ПНР.

Научная новизна работы.

Впервые сконструированы оригинальные олигонуклеотидные праймеры для амплификации специфических последовательностей ДНК пушных зверей в формате электрофоретической детекции.

Разработан положительный контрольный образец ДНК (ПКО), являющийся генно-инженерной конструкцией, несущей вставку фрагмента гена су! В. ПКО позволяет контролировать работу амплификационной смеси и является маркером длины ПЦР-продуктов.

Впервые в России разработана ПЦР тест-система для идентификации ДНК пушных зверей в кормах, обладающая 100% специфичностью с пределом аналитической чувствительности 0,1% примеси тканей пушных зверей в исследуемом материале или 10 пг ДНК пушных зверей в пробе.

Практическое значение работы.

Разработана и впервые внедрена в ветеринарную практику тест-система «ПЗ-ком» для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной цепной реакции. и.

Внедрение в систему государственного контроля ПЦР-тест-системы «ПЗ-КОМ» с декабря 2005 года по 20 декабря 2009 года позволило выявлять фальсификацию рыбной муки и кормов тканями пушных зверей, что имеет важное эпизоотологическое и эпидемиологическое значение.

Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные нормативные документы:

Инструкция по применению тест-системы «ПЗ-КОМ» для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной цепной реакции;

Технические условия на тест-систему «ПЗ-КОМ» для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной цепной реакции (ТУ № 9388−152−494 189−06).

Апробация диссертации.

Основные положения диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях ученого совета ФГУ «ВГНКИ» (2005;2009 гг.), а также на научных и практических конференциях: на научно-проблемных методических комиссиях ФГУ ВГНКИ (2005;2007 гг.) — на 6-й Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2007» (Москва, 2007 г.) — на Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов», посвященной 75-летию ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2006 г.) — Втором съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России (Казань, 2009 г.).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 1 страницах компьютерного текста, и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего источника, в том числе — иностранных). Диссертация иллюстрирована — рисунками и — таблицами. Прилагаются разработанные нормативно-технические и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.

ВЫВОДЫ.

1. На основании компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей гена митохондриального цитохрома В сконструированы оригинальные праймеры и оптимизированы параметры ПЦР для идентификации ДНК пушных зверей семейства куньих и псовых.

2. Предложен универсальный способ выделения высоочищенной ДНК пушных зверей из разных типов кормов с использованием протеиназной обработки и последующей афинной сорбции её на силикагеле в присутствии высокой концентрации солей гуанидина.

3. Разработан положительный контрольный образец ДНК, являющийся индикатором работы амплификационной смеси и маркером длины ПЦР-продуктов.

4. При определении аналитических характеристик разработанной тест-системы установлено, что «ПЗ-КОМ» обладает 100% специфичностью и имеет предел аналитической чувствительности 0,1% примеси тканей пушных зверей в исследуемом материале или 10 пг ДНК пушных зверей в пробе ПЦР.

5. Тест-система «ПЗ-КОМ» позволяет выявлять ДНК пушных зверей в продукции животного происхождения в течение 4 часов, что имеет важное эпизоотологическое значение.

6. Внедрение в систему государственного контроля ПЦР-тест-системы «ПЗ-КОМ» за период с декабря 2005 по май 2010 года позволило снизить количество фальсифицированной продукции с 8,3% до 2,63%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Инструкция по применению тест-системы «ПЗ-КОМ» для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной цепной реакции (утверждена 29.12.06).

2. Технические условия на тест-систему «ПЗ-КОМ» для идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной цепной реакции (ТУ № 9388−152−494 189−06).

6.

Заключение

.

В конце XX века в России кормление плотоядных пушных зверей было дорогим, так как использовали в основном дефицитные пищевые продукты при высоком уровне белка в рационе. В последние годы подвоздействием рыночных реформ структура рационов пушных зверей! значительно изменилась. Зверохозяйства перестали централизованно получатьпо твердым ценам основные корма, витамины, и медикаменты. В связи со снижением доходов при сокращении. спроса на отечественные меховые изделия, хозяйства стали испытывать трудности: с деньгами напокупку кормов, которые составляют около 70% от себестоимости пушнины. Качество5закупаемых мясных и рыбных кормов резко ухудшилось. При этом в рационе животных увеличилась доля сухих белковых кормов животного, растительного и микробиального происхождения. Наряду с опасностью использованияв качестве корма тушек забитых зверей., пораженных ТЭН и АБН, а также мясокостной муки из таких тушек, появилась опасность использования кормов, поступающих из-за рубежа, фальсифицированных, а также контаминированных тканямиплотоядных животных. Использование такой продукции может принести большой экономический ущерб пушному звероводству из-за опасности распространения ТЭН и АБН.

Анализ литературных данных о применении метода ГТЦР для выявления видовой принадлежности мясных ингридиентов в кормах показывает, что данный метод обладает рядом преимуществ по сравнению с существующими методами, такими как иммунодиффузия в геле, изоэлектрическое фокусирование, РИД и ИФА, так как сочетает в себе быстроту и простоту исполнения, а также потенциально высокую специфичность и чувствительность при выявлении патогенных микроорганизмов.

Тест-система на основе метода ПЦР должна обладать высокоэффективным методом выделения ДНК, системой амплификации обеспечивающую максимальную чувствительность, с последующей детекцией ПЦР-продукта, и набором контрольных образцов, позволяющим осуществлять контроль качества проведения каждого теста. Вышеперечисленные соображения послужили основой проведения собственных исследований.

ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Работа была выполнена в отделе биотехнологии Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») Федеральной службы по в.

1. Базы данных нуклеотидных последовательностей ДНК и компьютерные программы для обработки этих данных.

На первом этапе был проведен анализ литературы и баз данных нуклеотидных последовательностей NCBI (Национальный центр биотехнологической информации, США). Отобранные нуклеотидные последовательности были выровнены с помощью системы ClastalW Multi Sequence Alignment с целью их последующего анализа на вариабельность и поиска консервативных участков, необходимых для выбора праймеров.

Специфичность выбранных праймеров теоретически изучали с помощью компьютерных программы FASTA (Pearson W.G. 2000) и BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast).

2. Образцы сравнения ДНК.

В работе использовали коммерческие и самостоятельно полученные референс-препараты ДНК.

2.1. Коммерческие препараты ДНК.

ДНК тимуса теленка «ICN», США, кат.№ 195 129- ДНК спермы лосося «ICN», США, кат.№ 101 501- ДНК эритроцитов цыпленка «Reanal», Венгрия, кат.№ D-28- ДНК фага лямбда «СибЭнзим», г. Новосибирск, кат.№ Dil. Лиофилизированные образцы ДНК разводили в ТЕ-буфере (трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид (трис-НС1) 10 мМ, динатриевая соль этилендиамин-тетрауксусной кислоты (ЭДТА) 1 мМ, рН=8,0) до концентрации 0,5 мг/мл.

2.2. Самостоятельно полученные образцы ДНК.

Образцы ДНК получали из мышц норок, песца, хорька, куницы, курицы, свиньи, барана, крови песца, печени норки, хорька. ДНК сои и кукурузы получали из образцов кукурузной и соевой муки. Пробы обрабатывали протеиназой К. Из полученного лизата при помощи фенол-хлороформной обработки экстрагировали ДНК и преципитировали ее этанолом (Маниатис и др., 1984). Осадок ДНК растворяли в ТЕ-буфере. Концентрацию полученного препарата ДНК оценивали спектрофотометрически (см. п. 7 настоящей главы).

Референс-препараты ДНК хранили в аликвотах при минус 70 °C. Различные концентрации ДНК получали при помощи последовательных 10-ти кратных разведений в ТЕ-буфере.

3. Образцы мясного фарша, куриной, рыбной и мясокостной муки.

Образцы отбирали по ГОСТ 13 496.0 «Комбикорма, сырье. Методы отбора проб», ГОСТ 8756.0 «Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытаниям» и ГОСТ 2671 «Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов», соблюдая все меры предосторожности препятствующие контаминации. Каждый образец предварительно измельчали и далее растирали до гомогенного состояния в стерильной посуде в количестве 1−2 г. Измельченный образец аккуратно переносили в пробирки типа эппендорф. Всю посуду, контактировавшую с образцами обрабатывали хромпиком. Образцы хранили при температуре -20°С.

4. Образец сыворотки лошадей.

Сыворотка лошадей неспецифическая, неконсервированная по ТУ10.19.85−89. Федеральное Государственное Унитарное предприятие «Курская биофабрика — фирма «БИОК». Сыворотку использовали в анализе без предварительной подготовки.

5. Выделение ДНК из цельной крови.

5.1. Выборочный лизис эритроцитов.

Образец цельной крови, взятой с консервантом (ЭДТА в конечной концентрации 0,3%) смешивали с гемолизирующим буфером (Трис-НС1 10 мМ, NH4CI 155 мМ, ЭДТА 0,1 мМ, рН=7,4) в отношении 1:2 (1 мл крови и 2 мл гемолизирующего буфера), инкубировали на льду 15−30 мин и центрифугировали с охлаждением до 10 °C 10 мин при 300−400 g. Супернатант с гемолизированными эритроцитами удаляли, а лейкоцитарный осадок тщательно ресуспендировали в 1 мл фосфатного буфера — PB S (NaCl 137 мМ, КС1 2,7 мМ, Na2HP04 10 мМ, КН2Р04 2 мМ, рН=7,4). Суспензию лейкоцитов осаждали на центрифуге в прежнем режиме и удаляли супернатант. Промывку PB S повторяли до полного удаления остатков эритроцитов (присутствие эритроцитов оценивалось по наличию красноватого окрашивания осадка). Отмытый осадок лейкоцитов тщательно ресуспендировали в 0,1 мл PBS и хранили при 2 — 8 °C в течение недели.

5.2. Обработка лейкоцитарного осадка протеиназой К.

Полученную методом 5.1. суспензию лейкоцитов смешивали с 1 мл экстракционного буфера для протеиназы К (Трис-НС1 10 мМ, ЭДТА 10 мМ, додецилсульфат натрия (ДСН) 0,5%, рН=7,4) и выдерживали 1 ч при 37 °C. Далее к раствору добавляли протеиназу К до конечной концентрации 0,6 мг/мл и инкубировали не менее 3-х часов при 55 °C. Полученный лизат лейкоцитов охлаждали до комнатной температуры сразу же подвергали фенольной экстрации.

5.3. Экстракция ДНК фенол-хлороформом с последующей преципитацией этанолом.

К охлажденному лизату добавляли равный объем уравновешенного Трис-HCl (рН=7,4) фенола и тщательно перемешивали содержимое пробирки переворачиванием. Пробирку центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин, при этом раствор разделялся на две фазы: верхнюю — водную, содержащую ДНК и нижнюю — фенольную, содержащую белки. Верхнюю фазу, не задевая границу раздела фаз, аккуратно отбирали и переносили в новую пробирку. Фенольную фазу и границу раздела отбрасывали. К водной фазе добавляли равный объем смеси фенол: хлороформ: изоамиловый' спирт (25:24:1), перемешивали содержимое, повторяли центрифугирование в прежнем режиме, водную фазу переносили в новую пробирку. К водной фазе (второго порядка) добавляли хлороформ с изоамиловым спиртом (24:1) и повторяли экстракцию.

Далее к пробе добавляли 0,1 объема 3 М ацетата натрия (до конечной концентрации 0,3 М) и 2,5 объема 96% этанола, тщательно перемешивали и оставляли не менее, чем на 30 мин при минус 20 °C для образования преципитата. Преципитат осаждали, при 8000^ и 10 °C в течение 10 мин. Супернатант удаляли, не задеваяосадка. Осадок промывали 70% этанолом, осаждали в прежнем режиме и подсушивали его при комнатной температуру до удаления остатков этанола. Сухой осадок растворяли в 1 мл ТЕ-буфера.

5. Оценка концентрации''ДНК спектрофотометрическим методом.

Метод основан на зависимости интенсивности поглощения света от концентрации © вещества в растворе. Логарифм: отношения интенсивности падающего (/0) и прошедшего (/) через поглощающий слои толщиной (с/) света называется оптической плотностью? данного раствора (ОО) (1). Коэффициент пропорциональности (в), зависящий от природы растворенного вещества называется молярным коэффициентом поглощения (экстинкции).

00 = .

Максимум поглощения нуклеиновых кислот приходится, на 260 нм и создаетсясуммой поглощенийкаждогоиз нуклеиновых оснований. Для больших молекул двухцепоченой ДНК установлен средний коэффициент экстинкции (2) позволяющий оценить концентрацию ДНК не прибегаяк вычислению суммы-экстинкций каждого из нуклеотидов. 50——— (2) мкгхсм.

Соотношение (2) означает, что концентрация-раствора ДНК, имеющего при длине волны 260 нм оптическую плотность равную 1 составляет 50 мкг/мл. Пользуясь этимсоотношением рассчитывали концентрацию полученных препаратов ДНК.

7. Выделение ДНК сорбцией на силикагеле.

Методика основана на лизисе исследуемого материала при помощи специального хаотропного агента (гуанидина тиоционата) и последующем связывании нуклеиновых кислот частицами силикагеля в присутствии этого агента.

Исследуемый материал обрабатывали лизирующим раствором (гуанидина тиоционат 5,2 М, Трис-НС1 10 мМ, ЭДТА 12,5 мМ, тритон Х-100 2%, рН=8,0). Соотношение исследуемого материала и лизирующего раствора подбиралось в работе. Добавляли 20 мкл ВКО, если его использовали в данном анализе. Пробу инкубировали при 65 °C в течение 5 мин. Не растворившийся материал осаждали при 8000−10 000 g 5 мин, супернатант переносили в новую пробирку. К супернатанту добавляли 20 мкл тщательно ресуспендированного сорбента, хорошо перемешивали на вортексе, давали отстоятся в течение 2 минут, снова перемешивали и отстаивали еще 10—12 минут. Пробирки центрифугировали при 2000 g 1 мин, супернатант удаляли.

Осадок сорбента тщательно ресуспендировали (промывали) в растворе для отмывки 1 (гуанидина тиоцианат 4,0 М, трис-НС1 10 мМ, ЭДТА 12,5 мМ, тритон Х-100 0,5%, рН=8,0), повторяли центрифугирование в прежнем режиме и удаляли супернатант. Далее осадок дважды промывали раствором для отмывки 2 (трис-НС1 10 мМ, ЭДТА 1 мМ, хлорид натрия 5 мМ, спирт этиловый 50%, рН=8,0), каждый раз осаждая сорбент при 8000 g 1 мин. Осадок сорбента высушивали при 65 °C в течение 10 мин в твердотельном термостате, после чего элюировали ДНК с сорбента низкосолевым буфером (ТЕ-буфер). Для элюции осадок тщательно ресуспендировали в ТЕ, инкубировали при 65 °C в течение 5 мин, периодически встряхивая. Сорбент осаждали при 8000−10 000 g в течение 1 мин. Супернатант содержал ДНК.

8. Проведение реакции амплификации.

8.1. Состав реакционной смеси, условия амплификации.

Реакцию амплификации проводили в объеме 25 мкл в реакционном буфере следующего состава: 66 мМ Тпз-НС1 рН 8,3, 16,7 мМ (КН4)2804, 0,05 мг/мл БСА, 0,01% Туееп-20, 8% глицерин, 3,5 мМ MgC12, 0,2 мМ сЮТРб, по 0,4 мкМ праймеров, 2,5 ед Тщ ДНК-полимеразы. В качестве матрицы (ДНК-пробы) брали 10 мкл препарата ДНК. Чтобы избежать испарения, реакционную смесь сверху накрывали каплей минерального масла. Собственно реакцию проводили в термоциклере (амплификаторе) «Терцик» (ДНК-технология, Россия) с применением функции активного точного регулирования температуры, по следующей программе: 95 °C — 2 мин, 1 цикл- 95 °C — 1 мин, 56 °C — 1 мин, 72 °C — 1 мин, 42 цикла- 10 °C — хранение.

Отптимальную концентрацию праймеров и их температуру отжига подбирали в ходе работы.

8.2. «Горячий старт».

В качестве модификации реакцию проводили с использованием «горячего старта», для чего реакционную смесь делили на две составляющих. Смесь, в которой находились праймеры и нуклеотиды, предварительно разливали на дно пробирок для амплификации, на смесь наслаивали 10 — 15 мкл расплавленного воска, так, чтобы он образовал пробку. Сверху восковой пробки разливали вторую реакционную смесь, минеральное масло и вносили ДНК-пробу. Пробирки с «собранной» по такой схеме реакционной смесью ставили в нагретый не менее чем до 80 °C амплификатор. Для удобства работы с прибором использовали функцию «паузы».

9. Проведение электрофореза в агарозном геле.

Детекцию продуктов реакции амплификации проводили при помощи электрофореза в агарозном геле. Навеску агарозы массой 1,7—1,8 г помещали в термостойкую колбу, заливали 100 мл трис-боратного буфера (трисоксиметил)-аминометан 4,5 мМ, борная кислота 4,5 мМ, ЭДТА 1 мМ, этидия бромид 1 мкг/мл), доводили до кипения, остужали до 65−70°С и заливали в форму, так чтобы толщина геля была 5−6 см. На одном из концов геля с помощью специального приспособления («гребенки») формировали лунки. Застывший гель помещали в камеру для горизонтального электрофореза, расположив лунки ближе к отрицательному электроду, камеру заливали трис-боратным буфером, так чтобы он покрывал гель на 4—5 мм сверху. На дно лунок вносили по 10 мкл амплификата, подключали камеру к источнику тока, соблюдая полярность и проводили электрофорез при напряжении равном 10 В/см не менее 20 мин. Результаты электрофореза визуализировали облучением геля ультрафиолетовым светом на трансиллюминаторе «Биоком» (Россия) и документировали при помощи компьютерной система гель-документирования «Infinity».

10. Обработка посуды хромовой смесью.

Обработку посуды проводили согласно общепринятой методике. В фарфоровую чашку емкостью 300−500 мл помещали 5 г тонко измельченного в ступке К2Сг207 (или 6 г Na2Cr207−2H20), приливали 100 мл концентрированной H2S04 (технической) и осторожно нагревали на водяной бане до полного растворения двухромовокислого калия (натрия). Ступки и пестики и т. п. после обработки проб выдерживали в растворе дезинфицирующего средства, мыли обычным способом, а затем обрабатывали хромовой смесью, которую наливали в очищаемую посуду на ¼ или 1/3 объема, осторожно смачивали все стенки. Затем смесь выливали в сосуд, в котором она хранится, при этом смачивали края обрабатываемой посуды. Когда смесь сливали, добавляли немного водопроводной воды. При этом происходило разогревание, что способствало полному разрушению загрязняющих веществ. Очищаемую посуду наполняли водопроводной водой, еще раз ополаскивали для удаления остатков хромовой смеси и тщательно мыли волосяным ершом. Промывали водопроводной водой 5−6 раз, затем ополаскивали дистиллированной водой и сушили. Лицо, руки, одежду защищали от попадания брызг.