Роль аналога аденозина в изменении фенотипических свойств дендритных клеток человека моноцитарного происхождения при бронхиальной астме

Актуальность проблемы.

В настоящий момент повышенный интерес исследователей во всем мире вызывают аденозин и аденозиновые рецепторы (АР) как ключевые регуляторы множества тканевых функций.

Аденозин — эндогенный нуклеозид, продукт метаболизма АТФ [Kunapuli S. Р., 1998], в повышенных количествах высвобождается из клеток при повреждении тканей в различных ситуациях, включая гипоксию и воспаление [Fredholm В. В. et al, 2007]. Действуя паракринно на АР типов Аь А2а, А2в> А3 окружающих клеток, аденозин вызывает ряд эффектов, как про-, так и противовоспалительного характера (выброс медиаторов воспаления, изменение направления дифференцировки клеток). Тем самым, аденозин является своего рода «сигнализацией», сообщающей окружающим клеткам о патологическом состоянии ткани. В ответ на сигнал клетки.развивают.

V’t/1 <' приспособительные реакции [Hasko G., 2008]. ffe.

Дисбаланс в системе взаимоотношений аденозин -!^АР/ может.

— к". способствовать возникновению и развитию ряда различных заболевании с резко выраженным воспалительным компонентом в патогенезе: бронхиальной астме (БА) [Spicuzza L. et al, 2006], ревматоидному артриту [Montesinos М. С., 2007], болезни Крона [Kolachala V. L., 2008;, Hasko G., 2008].

Для установления механизмов развития процесса воспаления одним из центральных звеньев является рецепторная передача сигнала. Важным моментом является установление связи между активностью тех или иных рецепторов на клетках иммунной системы с их дифференцировкой, а также секрецией ими прои противовоспалительных медиаторов. Важнейшими клетками — участниками воспалительных реакций, наряду с моноцитами, макрофагами, лимфоцитами и прочими клетками иммунной системы, являются дендритные клетки (ДК) [Duez С. et al, 2006; Fransen J. H. et al,.

2010]. Данные клетки для исследований in vitro получают главным образом из моноцитов путем культивирования с интерлейкином 4 (ИЛ-4) и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ), что соответствует происходящему in vivo процессу [Peters J. Н., 1993; Yona S., 2010; Clark G., 2010].

Влияние активации АР на дифференцировку моноцитов в ДК (в том числе: изменение уровней мРНК АР разных типов, мРНК цитокинов, поверхностной экспрессии рецепторов, секреции цитокинов в окружающие клетки среду) на данный момент изучено слабо [Hasko G., 2008; Novitskiy S. V. et al, 2008].

ДК моноцитарного происхождения, дифференцированные в присутствии аденозина, никогда на начальном этапе их дифференцировки ранее не изучались, тогда как этот этап во многих случаях характеризуется i высокой продукцией провоспалительных цитокинов [Novitskiy S. V. et al, tif i i X.

2008]. Вместе с тем, было показано, что действие высоких концентраций.

Mt*f (J<' аденозина (30 мкМ) на АР типа А2 В при дифференцировке моноцитов в ДК nf f-f. приводит к формированию на шестые сутки клеток, характеризующихся i одновременным присутствием как рецепторов, свойственных для ДК, так и рецепторов, свойственных для моноцитов. Также для этих клеток была.

V/ характерна высокая продукция интерлейкина 6 (ИЛ-6), интерлейкина 8 (ИЛ-8) и фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) (значительно более высокая, по сравнению как с «обычными» ДК, дифференцированными в отсутствие аденозина, так и по сравнению с моноцитами) [Novitskiy S. V. et al, 2008]. Перечисленные цитокины обладают провоспалительным и фибротическим действием, способны поддерживать воспаление и вызывать ремоделирование [Eddahibi S. et al, 2006; Papaioannou A. I., 2006; Tuder R. M., 2008; Геренг E. A., 2011]. Таким образом, дифференцированные в присутствии высоких концентраций аденозина ДК могут в значительной степени опосредовать развитие и поддержание воспаления.

Для изучения процесса воспаления используют экспериментальные модели, реализованные на животных Ц^апа А. е1 а1, 2005; гаупа§ е1с!тоу Я. е1 а1, 2010; Ре&ога М. е1 а1, 2011]. В то же время, данные, полученные на таких моделях, нельзя переносить на человека, так как иммунная система человека имеет существенные отличия от иммунной системы любого животного [Наэко в., 2008]. Течение воспалительных процессов у человека изучают в рамках заболеваний, в которых воспалительный компонент является ведущим: хронической обструктивной болезни легких, бронхиальной астмы, ревматоидного артрита, болезни Крона.

Изучение связи активации аденозиновых рецепторов на дендритных клетках человека и секреции плейотропных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8 и ФРЭС) этими клетками поможет раскрыть фундаментальные механизмы развития воспаления и обозначить критические точки механизмов, необходимых для разработки лекарственных препаратов. Такое исследование будет иметь большое значение для медико-биологической науки. -г.

При высоких концентрациях аденозина, наблюдаемых <7 в очаге воспаления (до ~30−100 мкМ), свою активность проявляют — не только высокоаффинные рецепторы типов Аь А2а, Аз, но и низкоаффинные — типа А2вИнтерес представляют многие аспекты функционирования данных рецепторов, в том числе механизмы взаимодействия аденозина и других известных лигандов с лиганд-связывающим центром АР А2вРасчеты лиганд-рецепторных взаимодействий удобно производить при помощи компьютерного моделирования [Вахеуашз А. Б., 2001]. Наименее затратными и в то же время качественными методами расчетов являются молекулярно-механические методы [Беленикин М. С., 2002]. Построение моделей АР типа Агв возможно сделать на основании моделирования по гомологии с рецептором типа А2а (существует точная компьютерная модель последнего, полученная при помощи рентгеноструктурной кристаллографии) |7аако1а V. Р., 2008].

Цель: Изучить роль аналога аденозина в изменении фенотипических свойств дендритных клеток человека моноцитарного происхождения при бронхиальной астме.

Задачи исследования:

1. Оценить количества CDla, CD14, CD209 на дендритных клетках моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки при стимуляции аналогом аденозина.

2. Исследовать уровни мРНК аденозиновых рецепторов (Аь Агд, А2в> А3) в дендритных клетках моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки при стимуляции аналогом аденозина.

3. Установить количество мРНК интерлейкина 6, интерлейкина 8, фактора роста эндотелия сосудов в дендритных клетках моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки при стимуляции У аналогом аденозина, а также концентрации этих цитокинов в культуральной среде данных клеток.

1. >

4. Оценить взаимосвязи между количеством CDla, CD14, CD209 на дендритных клетках, содержанием в данных клетках мРНК аденозиновых рецепторов (А1} А2а, Агв5 Аз), интерлейкина, интерлейкина 8, фактора роста эндотелия сосудов, количеством белка этих цитокинов в среде указанных клеток и интенсивностью воспалительного процесса у больных бронхиальной астмой.

5. При помощи компьютерного моделирования изучить взаимодействие аминокислотных остатков, образующих лиганд-связывающий центр аденозинового рецептора А2 В, с известными активаторами и ингибиторами аденозиновых рецепторов.

Научная новизна работы.

Впервые дана функциональная характеристика дифференцированных в присутствии аналога аденозина дендритных клеток моноцитарного происхождения человека на начальной стадии их дифференцировки.

Получены данные о влиянии аналога аденозина на уровни экспрессии поверхностных маркеров (CDla, CD14, CD209) на ДК, количестве мРНК аденозиновых рецепторов (Аь А2а, А2 В, А3) и цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8, ФРЭС) в ДК, а также о содержании белка этих цитокинов в культуральной среде ДК.

Установлены взаимосвязи между интенсивностью воспалительного процесса при бронхиальной астме и вышеперечисленными показателями.

Впервые обнаружены межиндивидуальные различия в степени чувствительности дендритных клеток к действию аналога аденозина (NECA). Чувствительность к NECA выражается в аденозин-зависимом увеличении накопления клеток с сочетанием рецепторов CD 1 a'/l0WCD 14+CD209+. Частота встречаемости лиц с высокой чувствительностью ДК к NECA зависит от.

1 (¦[ I ' степени тяжести бронхиальной астмы. '</ ¦ «i» *.

• > 4 Ч V V.

Отмеченное в исследовании повышение уровня мРНК АР, типа А2а у больных Б, А под действием NECA в научной литературе f ранее не встречалось.

При помощи компьютерного моделирования установлено, что активаторы образуют водородные связи с остатками аминокислот 11е67, Phel73 и Glul74 чаще, чем ингибиторы. Взаимодействие этих аминокислотных остатков преимущественно с активаторами обнаружено впервые. Возможно, именно они в первую очередь ответственны за активацию АР типа А2 В.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные сведения о влиянии аналога аденозина на фенотипические и функциональные характеристики дендритных клеток моноцитарного происхождения на ранней стадии их дифференцировки могут быть использованы при разработке новых противовоспалительных средствблокаторов аденозиновых рецепторов, а также при разработке новых схем лечения на основании таких средств-блокаторов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Дендритные клетки человека моноцитарного происхождения на начальном этапе их дифференцировки обладают различной способностью к изменению фенотипа под действием аналога аденозина — NECA, зависящей от наличия или отсутствия БА, степени тяжести БА и индивидуальных особенностей. Изменение фенотипа под действием NECA у больных БА отличается от такового у практически здоровых людей повышением.

5 h I количества мРНК аденозинового рецептора типа А2аУ больных БА1 легкой и средней степеней тяжести — повышением количества мРНК интерлейкина 8- у практически здоровых людей происходит понижение i секреции интерлейкина 8.

2. Аминокислотные остатки Ile67, Phel73 и Glul74 лиганд-связывающего центра аденозинового рецептора типа А2 В образуют водородные связи с активаторами аденозиновых рецепторов, в то время как для ингибиторов не удается выделить специфичные к ним аминокислотные остатки.

Апробация работы.

Материалы данного исследования доложены и обсуждены на научных семинарах кафедры биохимии и молекулярной биологии СибГМУ (2011 г.) — на научных семинарах центральной научно-исследовательской лаборатории.

СибГМУ (2009 — 2011 гг.) — на XI и XII научных конференциях (2010 и 2011 гг.) «Конгресс Молодых ученых с международным участием «Науки о человеке"" — на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (2011) — на III Международной Студенческой Научной Конференции с участием молодых ученых «Клинические и теоретические аспекты современной медицины», посвященной 50-летию Медицинского Факультета РУДН (2011).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 работ в центральной и местной печати, из них 2 — в журналах из списка ВАК.

ВЫВОДЫ.

1. При действии аналога аденозина NECA на дендритные клетки начального этапа их дифференцировки (у больных бронхиальной астмой, равно как и у практически здоровых доноров), наблюдается повышение количества белка фактора роста эндотелия сосудов в кулыуральной среде указанных клеток, а также увеличение количества клеток с сочетанием рецепторов CD1 а" ЛстСО 14+CD209+. При этом в группе больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой количество пациентов с высоким индивидуальным ответом дендритных клеток на аналог аденозина, выраженном в NECA-зависимом увеличении накопления клеток с сочетанием рецепторов CDla" /lowCD14+CD209+, в 2,5 раза больше по сравнению с группой здоровых доноров. В группе больных тяжелой бронхиальной астмой число пациентов с высоким индивидуальным ответом дендритных клеток на NECA больше в 3,3 раза по сравнению с группой здоровых доноров.

2. Стимуляция аналогом аденозина (NECA) дендритных клеток начального этапа их дифференцировки (полученных от больных бронхиальной астмой, но не от практически здоровых доноров), приводит к повышению в этих клетках количества мРНК аденозинового рецептора типа а2а.

3. Действие аналога аденозина (NECA) на дендритные клетки (полученные от практически здоровых доноров, но не от больных бронхиальной астмой) на начальном этапе их дифференцировки приводит к понижению секреции интерлейкина 8 этими клетками. При этом в дендритных клетках, полученных от больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой, NECA вызывает повышение количества мРНК интерлейкина 8.

4. Дендритные клетки начального этапа их дифференцировки, в которых наиболее сильно повышено число клеток с профилем CD 1 a" /IowCD 14+CD209+ в ответ на стимуляцию NECA, характеризуются более значительным увеличением количества мРНК аденозиновых рецепторов типа А2а при стимуляции.

5. В результате компьютерного моделирования установлено, что часть аминокислотных остатков лиганд-связывающего центра аденозинового рецептора типа А2 В (Не67, Phel73 и Glul74) образует водородные связи с активаторами аденозиновых рецепторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В данной работе был использован способ получения моноцитов из крови при помощи разделения на градиенте плотности Фиколла и Перколла. Это позволило выделить моноциты с чистотой 74,2±5,5%. Выделенная фракция почти не содержала лимфоцитов.

При культивировании моноцитов в среде с добавлением ИЛ-4 и ГМ-КСФ в течение 38 часов они дифференцировались в дендритные клетки с преобладающим фенотипом CDla+CD14″ CD209+. Известно, что при многих заболеваниях с воспалительным компонентом (в том числе при бронхиальной астме) в тканях наблюдаются повышенные концентрации аденозина. Добавление стабильного аналога аденозина — NECA при культивировании дендритных клеток приводило к появлению у части из них альтернативного фенотипа CD1 a/l0WCD 14+CD209+, что согласуется с проведенными ранее исследованиями на дендритных клетках с большим сроком культивирования (5−6 суток). Из литературных источников известно, что дендритные клетки с таким фенотипом характеризуются повышенной уровнями производимых ИЛ-6, ИЛ-8, ФРЭС. Этот феномен наблюдался и в нашем исследовании уже после 38 часов культивирования. Дендритные клетки с фенотипом CD 1 a'/lowCD 14+CD209+ появлялись и в культурах, не подвергавшихся действию NECA, что вполне объяснимо. Известно, что, помимо аденозина и NECA, появление дендритных клеток с указанным фенотипом вызывают активаторы аденилатциклазы: простагландин Е2, ИЛ-6, ИЛ-ip, холерный токсин, форсколин. В данном исследовании во всех культурах дендритных клеток наблюдалась спонтанная продукция ИЛ-6 -вероятно, по причине активации моноцитов/дендритных клеток в результате адгезии к пластику культуральных планшетов. Очевидно, что ИЛ-6 мог вызывать изменение фенотипа части анализируемых клеток. При этом наблюдался также и эффект NECA на изменение фенотипа: наблюдалось статистически значимое повышение процентного содержания клеток с альтернативным фенотипом под действием этого аналога аденозина в группе практически здоровых людей и в группе больных бронхиальной астмой легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой.

Существуют литературные данные, согласно которым эффект аденозина и NECA на изменение сочетания поверхностных маркеров на дендритных клетках с CDla+CD14-CD209+ на CDla" /lowCD14+CD209+ обусловлен активацией аденозинового рецептора типа А2 В. Полученные в нашем исследовании данные позволяют предположить, что данный феномен может быть обусловлен также и действием аденозинового рецептора типа А2а. Это предположение требует проверки в экспериментах с селективными активаторами и ингибиторами аденозинового рецептора типа А2д.

Внутри всех анализируемых групп (больные БА разных степеней тяжести, практически здоровые люди) наблюдались значительные межиндивидуальные различия в приросте количества ДК с альтернативным фенотипом под действием NECA. На основании различий в приросте все 40 обследуемых, вне зависимости от наличия бронхиальной астмы и ее тяжести, были разделены на 2 группы: «слабо реагирующие на NECA» и «сильно реагирующие на NECA». Было установлено, что культуры клеток выделенных групп различаются не только по выраженности изменений фенотипа, но и по разностям количеств мРНК АР типа А2а и ИЛ-6 (таб. 7). По разностям уровней белка какого-либо из цитокинов различий не наблюдалось.

Следует отметить, что в данном исследовании под действием NECA уровень мРНК АР типа А2а повышался в ДК больных бронхиальной астмойкак легкой и средней, так и тяжелой степени (таб. 5), но не у практически здоровых людей. Повышение уровня мРНК АР типа А2а (в группах 1 и 2 — у обследуемых с активно протекающим воспалительным процессом при БА) под действием аналога аденозина NECA обнаружено впервые.

Известно, что активация АР типа А2а (в том числе на дендритных клетках) обладает защитным действием при патологических процессах воспалительного генеза. Возможно, отмеченное в данном исследовании повышение уровня мРНК АР типа А2а происходит уже после повышения уровня мРНК ИЛ-6, ИЛ-8, ФРЭС, после усиления секреции белка этих цитокинов и является реакцией на эти события: ограничивает провоспалительную активность ДК и, таким образом, является защитным механизмом, действующим угнетающе на распространение воспаления. Подобные предположения относительно роли аденозинового рецептора типа А2д, на клетках иммунной системы, уже выдвигались ранее несколькими исследователями.

Уровни мРНК АР типа А2а в нашем исследовании превышали уровни мРНК АР типа А2 В как по всем 40 обследуемым в сумме, так и по большинству групп в отдельности. В исследованиях других коллективов на дендритных клерсах, напротив, наблюдалось преобладание рецептора типа А2 В над рецептором типа А2а — как при стимуляции аденозином или NECA, так и без стимуляции.

Активация А2 В на иммунных клетках, как правило, приводит к усилению секреции ИЛ-6 и ИЛ-8, а также ФРЭС. Активация А2А, напротив, понижает продукцию ИЛ-6 и ИЛ-8. Отрицательное действие активации А2А на количество секретируемого ФРЭС в литературных источниках не упоминается. Напротив, для макрофагов показано усиление секреции ФРЭС, опосредованное этим рецептором.

Полученные в нашем исследовании результаты согласуются с приведенными фактами о регуляции ИЛ-6, ИЛ-8 и ФРЭС аденозиновыми рецепторами типов А2А и А2 В.

Содержание белка ИЛ-6 и ИЛ-8 не была повышено ни в одной из исследуемых групп: видимо, преобладание мРНК АР А2а над мРНК АР А2 В приводило к преобладанию ингибирующего эффекта А2А на продукцию этих цитокинов над активирующим эффектом А2 В.

Концентрации ФРЭС без стимуляции NECA были невысоки во всех исследуемых группах и колебались в пределах 0,01−0,35 нг/мл. Стимуляция NECA приводила к многократному увеличению секреции ФРЭС — до 0,1−0,65 нг/мл. Вероятно, аденозиновые рецепторы А2А и А2 В обладают синергичным действием на секрецию ФРЭС дендритными клетками.

В соответствии с целями, поставленными в исследовании, было проведено компьютерное моделирование взаимодействия АР типа А2 В с его известными агонистами и антагонистами.

Было установлено, что активаторы и ингибиторы образуют водородные связи преимущественно с несколькими аминокислотами из множества аминокислот, находящихся в сайте связывания, причем некоторые аминокислоты обладают сродством как к активаторам, так и к ингибиторам: Ala82, Glu 174, Asnl86, Asn254. Помимо этого, активаторы образуют водородные связи с аминокислотами Ile67, Leu81, Cysl71, Phel73, Glu 175, Val250, a ингибиторы образуют водородные связи с аминокислотами А1а60, Ala64, Ser68, Thr89, Ser92, Arg269, Ser279, His280, Ser283.

Взаимодействие Ser283 преимущественно с ингибиторами согласуется с данными компьютерного моделирования взаимодействия аденозинового рецептора типа А2А, имеющего сходное с А2 В строение, с активаторами и ингибиторами.

Выяснено, что активаторы образуют водородные связи с аминокислотой Ие67 чаще, чем ингибиторы. Phel73 и Glu 174 также чаще связываются с активаторами. Роль данных аминокислот в активации аденозиновых рецепторов типов Аь А2А, Аз в выполненных ранее работах не была установлена. Возможно, именно они в первую очередь ответственны за активацию аденозинового рецептора типа А2 В.

Внесение мутации первого типа не привело к статистически значимым различиям в образовании водородных связей в лиганд-связывающем центре рецептора.

Внесение мутации второго типа почти не приводило к статистически значимым различиям в образовании водородных связей в лиганд-связывающем центре рецептора. Действительно, ни одна из произведенных аминокислотных замен не затронула лиганд-связывающий центр. Единственное статистически значимое следствие замены — отсутствие связывания с Ие67. Вероятно, смена аминокислот вне лиганд-связывающего центра, тем не менее, слегка изменила его конформацию в аллостерической манере, приведя к изменению характера связывания лигандов с аминокислотой Ие67.

Одна из замен, Ьуз269—>Аг§ 269, характерная для мутации второго типа, затронула лиганд-связывающий центр. Однако такая замена не привела к изменению связывания с остатком Аг§-269 (рис. 8), вероятно, по причине того, что положительно заряженная аминокислота была заменена также на положительно заряженную.