Исследование состояния популяции водоросли Scenedesmus quadricauda в норме и при интоксикации методом микрокультур

Токсичные вещества оказывают влияние на самые разные компоненты водных биоценозов: бактерии, водоросли, простейшие, ракообразные, моллюски, рыбы и др. При этом их влияние сказывается как на уровне отдельного организма или клетки, так и на уровне всей популяции и экосистемы вцелом.

Удобным объектом изучения влияния токсичных веществ на популяционном уровне являются культуры микроводорослей. Главным образом, это связано с коротким жизненным циклом отдельных клеток, что позволяет в ходе одного опыта проследить влияние неблагоприятного фактора на нескольких поколений. Кроме того, высокая численность клеток в опыте позволяет получать массовый материал для статистических сравнений.

Особый интерес к процессам, происходящим в популяции культивируемых одноклеточных организмов, появился в 50-х годах прошлого века, когда были опубликованы работы, в которых популяцию (в первую очередь, микроорганизмов) стали рассматривать как единую систему со многими разнообразными связямисистему, которая нередко ведет себя как целостный организм. В частности, в работах Иерусалимского И. Д. (1952) отмечается, что популяции микроорганизмов даже в пределах лабораторных культур характеризуются:

1) фенотипической гетерогенностью составляющих ее клеток как основой для дифференциации клеток по социальным ролям- 2) наличием внутри популяции (например, колонии микроорганизмов) в той или иной мере обособленных микроколоний- 3) целостностью популяции в процессе развития, наличием у нее интегральных свойств, отсутствующих у индивидуальных клеток- 4) способностью популяции влиять на характеристики окружающей среды при достаточной плотности клеток в ней.

Многочисленные работы по колониальной организации микроорганизмов свидетельствуют о морфологической и физиологической гетерогенности входящих в её состав клеток (Олескин, 2001). Так в популяции микроорганизмов отмечают наличие активно делящихся, покоящихся и спонтанно автолизирующихся клеток (Уголев, 1987). Особенно четким разделение клеток на эти группы становится в стационарной фазе роста (Ждан-Пушкина, Хасанова, 1991). Гетерогенность (разнородность) клеток в популяции обеспечивает устойчивость культуры к меняющимся внешним условиям (Greenberg, 2003).

По сравнению с микроорганизмами культуры водорослей изучены слабее, но имеющиеся данные позволяют предположить наличие сложных связей и в их популяциях.

Так в культурах водорослей предполагается появление резерва покоящихся клеток, обеспечивающего выживание популяции в целом при неблагоприятном воздействии (Гапочка, 1981; Саакян, 1987). Кроме того, у водорослей была обнаружена программируемая клеточная смерть, ранее описываемая только у микроорганизмов (Segovia, 2003). Этот феномен является ярким примером социального контроля, когда в интересах популяции в целом происходит гибель отдельных клеток.

Другим примером сложности процессов, происходящих в популяции микроводорослей, является наличие у них сложной коммуникативной системы. Информация между клетками культуры может передаваться с помощью различных химических агентов, на уровне метаболитоввыделяемых клетками в среду (Кажлаева, Плеханов, Максимова, 1991) — путем контактного ингибирования (Costas et al, 1993). Одним из средств передачи информации может являться кальций, входящий в состав оболочки клетки (Sanders, Brownlee, Harper, 1999). Установлена возможность передачи информации из поколения в поколение путем записи ее в клеточную мембрану (Costas, Rodas. Lopez, 1991).

Вместе с тем, малоизученными остаются вопросы о роли гетерогенности культуры в процессах ее роста и развития. Не известно, какая часть клеток в популяции участвует в процессах размножения.

Целью настоящей работы являлась исследование структурных перестроек модельной популяции водоросли Scenedesmus quadricauda в норме и при токсическом воздействии.

Задачами работы служило следующее:

1. Разработка метода раздельного культивирования ценобиев водоросли Scenedesmus quadricauda и наблюдения за микрокультурами;

2. Исследование гетерогенности лабораторной популяции водорослей по выживаемости и способности отдельных клеток к делению;

3. Изучение влияния токсического воздействия на выживаемость и размножение водорослей в лабораторных популяциях;

4. Определение временив лизиса отмирающих клеток водорослей и оценка влияния на скорость лизиса присутствия токсиканта.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

1. Прием раздельного культивирования клеток водоросли Scenedesmus quadricauda, называемый нами методом микрокультур, позволил оценить жизнеспособность и активность клеток в макрокультуре водоросли. В частности в культуре удалось определить относительное и абсолютное число размножающихся, покоящихся и погибающих клеток.

2. Основную часть культуры составляли клетки, находящиеся в покоящемся состоянии, особенно увеличивалась их численность в стационарной фазе роста культуры.

3. В контроле доля размножающихся клеток была сравнительно невелика, их абсолютное количество возрастало первые недели, достигая максимума к 18 суткам, с последующим снижением, в результате чего уровни размножающихся и погибающих клеток становились близкими. Фракция погибающих клеток была меньше фракции размножающихся в период с 5 по 20 сутки. Изменение скорости прироста числа клеток в ходе развития культуры происходило за счет изменения показателей рождаемости на фоне относительно постоянной смертности.

4. Внесение меди на лаг — фазе и фазе экспоненциального роста оказывало угнетающее воздействие на общую численность клеток, в целом усиливающееся с увеличением концентрацией токсиканта. При внесении меди на стационарной фазе роста эффект угнетения отмечался при концентрациях меди 0,1 и 1,0 мгСи/л. При средних концентрациях- 0,001 и 0,01 мгСи/л, напротив, происходила стимуляция процессов размножения, так что снижения общей численности клеток в культуре не происходило.

5. Наиболее сильное влияние на фракционный состав культур медь оказывала при внесении ее на экспоненциальной фазе, когда в популяции был велик процент более чувствительных размножающихся клеток. В начале эксперимента при всех концентрациях здесь происходила полная остановка процессов размножения и некоторое усиление процессов отмирания и только через 2 недели было отмечено некоторое восстановление культуры.

6. При внесении меди на лаг-фазе и фазе стационарного роста хлорид меди, главным образом, оказывал угнетающее воздействие на процессы размножения клеток, а начиная с концентрации 0,001 мгСи/л происходило еще и увеличение смертности клеток.

7. Время лизиса клеток в контроле оказалось малым по сравнению с длительностью жизненного цикла клеток (2−3 часа), а при добавлении меди в концентрации 1,0 мгСи/л возрастало до 3−6 суток. Таким образом, высокие концентрации токсиканта вызывали накопление мертвых клеток в культуре, а высокая доля мертвых клеток в макрокультуре, определенная с помощью люминесцентных методов, была связана не только с возрастанием смертности клеток, но и с замедлением процессов их лизиса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Проведенные исследования продемонстрировали важную роль покоящихся клеток в жизни популяции Scenedesmus quadricauda. Оказалось, что в разные моменты существования культуры их доля составляет от 40 до 80%. Таким образом, рост и развитие культуры определяются достаточно небольшим количеством клеток ответственных за размножение, остальная же часть только поддерживает существование популяции. В отличие от бактерий и синезеленых водорослей, где покоящиеся клетки являются особыми устойчивыми формами с пониженной физиологической активностью и служат, главным образом, для выживания при наступлении неблагоприятных условий, у Scenedesmus quadricauda покоящиеся клетки достаточно активно фотосинтезируют. Это позволяет предположить, что их существование в культуре не связано исключительно с задачей выживания, а необходимо для развития культуры в нормальных условиях.

По мере роста культуры и перехода ее в стационарную фазу доля покоящихся клеток в ней возрастает. При этом при пересадке ценобия в камеру количество среды и света, приходящееся на один ценобий, увеличивается, однако, это не приводит к усилению размножения. Это свидетельствует о том, что торможение процессов деления клеток в этот момент связано не с автозатенением, а с какими-то метаболическими процессами в самих клетках или накоплением метаболитов в среде. Следует отметить, что в опытах с микроколониями хлореллы (Аникеева, Ваулина, Шевченко, 1964), где при переносе клеток на агар полностью снималось влияние накопленных в среде метаболитов, доля покоящихся клеток не превышала 5%. Это может являться косвенным свидетельством важной роли веществ, накапливаемых в среде, в переходе клеток к состоянию покоя.

Покоящиеся клетки не являются глубоко законсервированной системой. При слабых неблагоприятных воздействиях, когда возможность восстановление культуры зависит от скорости нарастания численности клеток в ней, они способны перейти к размножению. Примером такой ситуации может служить двукратное увеличение доли размножающихся клеток по сравнению с контролем в стационарной фазе при внесении средних концентраций хлорида меди (0,001 и 0,01 мгСи/л).

Существование культуры и ее рост при небольшой доле размножающихся клеток возможны только на фоне медленно текущих процессов отмирания. В экспериментах было продемонстрировано, что в контроле количество отмирающих клеток не превышает 10% в сутки (в периоды активного роста культуры около этот показатель опускается до 3%).

Метод микрокультур позволил разделить и рассмотреть отдельно три процесса, которые определяют общую численность клеток в культуре в конкретный момент времени: размножение, отмирание и лизис отмерших клеток.

Оказалось, что в контроле смертность клеток остается примерно на одном уровне в ходе всего роста культуры. Это означает, что главным процессом, определяющим динамику развития популяции, является размножение, а изменение скорости прироста популяции связано с изменениями в процессах рождаемости. В стационарной фазе, когда рост культуры замедляется, происходит ослабление процессов размножения, а не усиление гибели клеток.

Возможность раздельного рассмотрения процессов размножения и отмирания клеток особо важна при оценках токсичности загрязняющих веществ. Дело в том, что угнетение культуры и более низкая численность клеток по сравнению с контролем может быть связана, как с усилением процесса гибели клеток, так и с подавлением размножения.

Исследования показали, что первой реакцией культуры на токсикант является, обычно, снижение доли размножающихся клеток и их переход в покоящееся состояние. И лишь при усилении уровня токсического воздействия происходит возрастание смертности клеток. В опытах с длительной экспозицией показано, что при восстановлении культуры, в первую очередь, таюке происходит снижение смертности клеток и лишь при низких концентрациях токсичных веществ идет некоторое восстановление процессов размножения. Это свидетельствует о том, что размножение является наиболее чувствительным к неблагоприятным воздействиям процессом. Вероятно, именно с этим связана более низкая устойчивость культуры в фазе экспоненциального роста, отмеченная в наших экспериментах, когда процесс размножения в момент внесения токсиканта шел наиболее активно.

При оценке смертности клеток в культуре встает вопрос о времени лизиса отмерших клеток. Дело в том, что количество погибших клеток, оцениваемое с помощью люминесцентной микроскопии, зависит от того за какой период проходит их разрушение. При условии высокой скорости лизиса (порядка нескольких часов), которое наблюдается в контроле и при низких дозах хлорида меди, процессы отмирания и разрушения клеток оказываются сбалансированными и доля мертвых клеток остается на одном невысоком уровне. При замедлении лизиса в присутствии высоких доз хлорида меди (1 мгСи/л) количество погибших клеток в культуре постоянно возрастает, достигая к концу эксперимента 65% от общей численности клеток. При этом реальная смертность клеток в культуре не увеличивается, и к концу эксперимента соответствует контрольным значениям. Причиной замедления лизиса может быть ингибирование процесса автолизиса, так и угнетение активности сопутствующей микрофлоры, обеспечивающей утилизацию погибших клеток.

Таким образом, метод микрокультур позволил рассмотреть популяционные процессы связанные с гибелью и размножением клеток в процессе роста культуры в норме и при воздействии хлорида меди.