Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA): координатор клеточных функций в норме и патологии

Белки являются основными участниками почти всех клеточных процессов, поэтому их поведение на молекулярном уровне лежит в основе механизмов, определяющих процессы клеточной жизнедеятельности. Функции и механизмы работы белков внутри клетки напрямую зависят от их локализации, количества и качества. Под качеством подразумевается правильная (нативная) структура белков, а также возможность динамики этой структуры. Динамика обеспечивается различными механизмами, в первую очередь посттрансляционными модификациями и межмолекулярными взаимодействиями (белок-белок, белок-ДНК, белок-РНК и т. д.). Если раньше оценить масштаб этих динамических изменений не было технических возможностей, то с приходом эры протеомики появились его первые оценки. Последние данные показывают, что в среднем каждый белок подвержен 6−7 модификациям, а количество обнаруженных партнеров растет лавинообразно с повышением чувствительности методик их обнаружения (Xenarios, Rice et al. 2000; Bader, Betel et al. 2003: Mann and Jensen 2003; Walsh, Garneau-Tsodikova et al. 2005: Stumpf, Thorne et alt 2008). Вслед за термином «протеомика» для того, чтобы более детально манипулировать данными по белковым модификациям и их взаимодействиям, стали появляться такие термины, как «интерактомика», «фосфопротеомика», «гликопротеомика» и т. д. Непрерывно продуцируемый огромный объем информации привел к востребованности биоинформатики и многочисленных баз данных IXenarios, Rice et al. 2000; Bader, Betel et al. 2003), а в конечном итоге — к образованию новой научной дисциплины, системной биологии (Ideker, Galitski et al. 2001: Liu 2005). Центральным подходом в системной биологии является объединение взаимодействующих друг с другом клеточных компонентов (белков) в многочисленные сети, образующие функциональные модули, а вся совокупность этих взаимодействий, характерная для каждого объекта, носит название «интерактома» (-8апсЬег, Lachaize et al. 1999V.

Актуальность темы

.

Желание описать и вместить живой объект в рамки компьютерных технологий привело к созданию множества программ, различным образом манипулирующих с имеющейся информацией о белковых взаимодействиях и «визуализирующих» ее (Ju, Park et al. 2003; Batageli and Brandes 2005; Iragne, Nikolski et al. 2005; Klammer. Roopra et al. 2008; Minguez, Gotz et al. 2009; Fung, Wilkins et al. 2010). Возможность получения такой информации в большом объеме позволила создавать интерактомы даже на уровне целого организма (Ito, Tashiro et al. 2000; Uetz, Giot et al. 2000; D’Alessandro, Righetti et al. 2010). Некоторые белки отличаются особенно повышенным количеством партнеров и выглядят на картах интерактомики, как объединяющие центры или хабы (hubs). В зависимости от характера белок-белковых взаимодействий хабы подразделяются на две категории: «центры вечеринок» (party hubs), где взаимодействие происходит со многими партнерами одновременно, и «центры свиданий» (date hubs), когда взаимодействие с разными партнерами происходит в разных местах и в разное время (Han. Bertin et al. 2004). Так как для «центров вечеринок» характерно образование неких белковых комплексов, уровни их экспрессии и их партнеров должны коррелировать во времени тех процессов, где они задействованы. Наоборот, в случае «центров свиданий» такая корреляция отсутствует. Наиболее известными хабами являются, например, такие белки с разнообразными функциями, как актин, 14−3-3 или р53 CCollavin, Lunardi et al. 2010V Анализ последствий, вызванных нарушениями в сети белок-белкового взаимодействия, позволил предложить некую модель организации протеома из отдельных модулей или биологических процессов. Каждый модуль регулируется через «центр вечеринок», в то время как «центры свиданий» организовывают весь протеом, связывая отдельные модули. Например, в случае дрожжей, «центр свиданий» калмодулин связывает четыре разных биологических модуля: 1) катионовый гомеостаз, 2) упаковка и стабилизация белков, 3) отпочкование, полярность клеток и образование филаментов, 4) эндоплазматический ретикулум. А такие «центры вечеринок», как Sec 17, Sec22 и Vtil, все функционируют внутри модуля «эндоплазматический' ретикулум». Весь протеом является более чувствительным к нарушениям в работе date hubs, чем party hubs (Han, Bertin et al. 2004). Внутри модуля «репликация ДНК» особенно интересен ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA, proliferating cell nuclear antigen) (Рис.1). Этот белок долгое время был известен только как вспомогательный белок для ДНК полимераз. Однако развитие методов протеомики, возникновение интерактомики и системной биологии привели к расширению представлений о функционировании белков в общем, и PGNA в частности. Поэтому актуальной является задача по выяснению механизмов, регулирующих межбелковое взаимодействие и белковую полифункциональность. Для решения этой задачи необходимо привлечение не просто отдельных биохимических методов, а комплексный подход и системный взгляд на работу белков. Причем PCNA в этом смысле является чрезвычайно подходящим и своевременным объектом исследования. Как будет видно из дальнейшего изложения, РСЫА является хабом, причем хабом с широкими функциями, который может координировать не только отдельный модуль, но и взаимодействие многих модулей. Изучение такой координации позволит пролить свет не только на конкретные функции, в которые вовлечен данный белок, но и на общеклеточные механизмы в целом.

Цель.

Целью работы являлось выяснение структурно-функциональных аспектов организации интерактомики на примере РСЫА, как хаба, обладающего широким спектром действия.

Основные задачи исследования.

1) выявление форм, которые может принимать РСЫА, подвергаясь посттрансляционным модификациям,.

2) изучение роли данных модификаций в механизмах работы РСЫА в качестве белка, взаимодействующего с множеством других белков,.

3) оценка аспектов, касающихся роли РСЫА в качестве онкогена и маркера пролиферации,.

4) анализ, систематизация и дополнительный поиск белков, взаимодействующих с РСЫА, с разработкой и использованием нетривиальных подходов,.

6) выяснение функций РСМА не только в ядре, но и в цитоплазме,.

7) прояснение деталей структурной организации PCNA, обеспечивающей выполнение его многообразных функций,.

8) разработка модели (моделей) функционирования РСЫА в качестве хаба широкого спектра действия.

Научная новизна.

Детальный анализ с помощью двумерного электрофореза высокого разрешения и чувствительности выявил наличие разнообразных форм у РСЫА млекопитающих (так называемый нанопротеом), вызванных посттрансляционными модификациями.

Впервые показано, что РСМА присутствует в клетке в виде двойного тримера. Более того, было доказано, что именно такая структура обеспечивает те свойства, которые делают РСЫА координирующим хабом широкого спектра действия. Была предложена модель работы РСЫА в качестве координатора процессов, происходящих на репликативной вилке ДНК при синтезе ДНК и сборке хроматина.

Систематический анализ белков, взаимодействующих с РСКА, привел к раскрытию совершенно новых сторон функционирования РСКА. Одна из этих сторон связана с его возможным участием в процессах гликолиза. В совокупности с тем фактом, что канцерогенез сопровождается увеличением как уровня гликолиза, так и экспрессии РСКА, это позволяет по-новому взлянуть на процессы канцерогенеза.

Основные положения, выносимые на защиту.

Имеет место широкий спектр взаимодействий PCNA, причем не только в ядре, но и в цитоплазме.

Обнаружено, что РСЫА присутствует в клетке в виде комплекса из двух колец, обеспечивающих одновременное взаимодействие с несколькими белками-партнерами.

Сформулирована модель координирующего действия РСИА на репликативной вилке ДНК.

Обнаружено взаимодействие PCNA с гликолитическими ферментами и предложена модель участия PCNA в гликолизе.

Показано наличие множественных посттрансляционных модификаций PCNA, которые участвуют в регуляции взаимодействия PCNA с другими белками.

Научно-практическая значимость.

Научно-практическая значимость представленной работы состоит в первую очередь в существенном вкладе в дальнейшее понимание внутриклеточных процессов в общем и механизмов функционирования белковых сетей, то есть интерактомики, в частности. Такое понимание важно не только в общем плане познания, но и дает ключ к нашим возможностям при необходимости вмешиваться в эти процессы. Например, знание того, что раковая клетка, содержит значительно повышенное количество PCNA и очень чувствительна к нарушениям его четвертичной структуры, указывает на возможность получения фармакологических противораковых препаратов, нарушающих структуру PCNA и тем самым вызывающих апоптоз раковых клеток. А информация о белковых сетях, образованных взаимодействиями PCNA, может служить инструментом в диагностике заболеваний, выяснении механизма их возникновения и развития, эффективности тех или иных терапевтических подходов и разработке новых лекарственных препаратов.

Апробация работы.

Материалы данного исследования представлялись на 2 Всемирном конгрессе HUPO в Монреале, Канада (Montreal, QC, Canada) в 2003 году, на 4 Всемирном конгрессе HUPO в Мюнхене, Германия (Munich, Germany) в 2005 году, на 5 Всемирном конгрессе HUPO в Лонг Бич, США (Long Beach, USA) в 2006 году, на 7 Всемирном конгрессе HUPO в Амстердаме, Голландия (Amsterdam, Netherlands) в 2008 году, на 8 Всемирном конгрессе HUPO в Торонто, Канада (Toronto, Canada) в 2009 году, на конференциях Канадского Общества Протеомики в Лондоне (London, ON, Canada) (2004 год) и в Оттаве (Ottawa, ON, Canada) (2005 год), на конференциях Канадской Инициативы по Протеомике (Canadian Proteomics Initiative) в Ванкувере (Vancouver, ВС, Canada) (2003 год) в Монреале (Montreal, QC, Canada) (2004 год), в Торонто (Toronto, ON, Canada) (2005 год), в Оттаве (Ottawa, ON, Canada) (2007 год), на Конференциях по Двумерному Электрофорезу (2-D Electrophoresis Meeting, from Genome to Proteome) в Сиене, Италия (Siena, Italy) в 1996, в 1998, в 2000 и в 2002 годах, а также на Международной Конференции «Биокатализ-98» в Пущино в 1998 году и Всероссийской научной конференции «Медико-генетические проблемы онкологических заболеваний» (Стерлитамак, 2010 год). Кроме того, автор неоднократно выступал с докладами в Петербургском Институте Ядерной Физики РАН, Гатчина, Россия, Институте Биомедицинской Химии РАМН, Москва, Россия, в Лаврентьевском Университете в Садбери, Канада (Laurentian University, Sudbury, Canada) и в Раковом Центре при Региональном Госпитале в Садбери, Канада (Cancer Centre, Sudbury Regional Hospital, Canada).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 39 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, из которых 17 статей в рекомендованных ВАК РФ изданиях.

Структура и объем диссертации

.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 265 страницах, содержит 55 рисунков, 12 таблиц.

Список литературы

включает 434 источника.

выводы.

1) Показана многоплановая? роль РС^ТА, как одного из ключевых белков интерактомики. Имеется: несколько модулей (функциональных процессов), таких как репликация хроматина и репарация ДНК, где РСКА достоверно является координирующим хабом. Интригующим выглядит участие РСЫА в канцерогенезе и гликолизе.

2) Впервые показано существование многочисленных изоформ РСЫА, которые представлены на 2БЕ в виде набора пятен различной интенсивности (нанопротеома). Основная (мажорная) форма РОИА млекопитающих располагаетсяна 2ВЕ-карте в точке, соответствующей теоретическим физико-химическим параметрам РСЫА, и не модифицирована, а наличие множества минорных, модифицированных, форм РС^ТА указывает на то, что? модификации: РСИА являются очень динамичными и короткоживущими событиями, и/или очень малая часть'-РСМА вовлечена в процессы, где необходимы данные модификации РСЫЛ.

3) Определены некоторые модификацииРСЫА и их роль в его функционировании? Достоверно подтверждено убиквитинирование и ацетилирование РСЫА. Показано отсутствие фосфорилирования РСЫА 1п.

Ацетилирование РСЫА связано с репликацией ДНК и стабилизацией комплексов РСИА с другими белками, а неспсцифическое убиквитинирование. связано с метаболизмом (утилизацией) РСЫА.

4) Проанализирован аспект, касающийся РСКА, как онкогена и маркера пролиферации. Показано, что в раковых клетках значительно повышен общий уровень РСЫА без появления каких-либо его дополнительных изоформ этого белка. Причем, это повышение связано не с усилением пролиферации, а с иными причинами, скорее всего метаболизмом, в частности с активацией гликолиза.

5) Показано взаимодействие РСЫА с множеством белков, часть из которых участвует в процессах, происходящих за пределами хроматина и ядра, в цитоплазме. Среди этих белков большую группу составляют ферменты гликолиза. Кроме того, многие из этих белков связаны с канцерогенезом.

6) Показано присутствие РСКА не только в ядре, но и в цитоплазме, причем, это присутствие может быть весьма существенным. Получены данные, указывающие на то, что РСИА, локализованный в цитоплазме, играет стимулирующую роль в гликолизе.

7) Показано, что полная четвертичная структура РСИА имеет вид двойного кольца, в котором кольца (тримеры) взаимодействуют обратными сторонами. Таким образом, лицевые стороны остаются открытыми для взаимодействия с другими белками. Такая структура РСКА очень динамична и чувствительна к различным факторам, применяемым при выделении этого белка.

8) Предложена структурная модель, согласно которой PCNA играет роль хаб-белка с широкими функциями.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ.

ДИССЕРТАЦИИ.

1. Naryzhny S. N., Lee Н. Proliferating cell nuclear antigen in the cytoplasm interacts with components of glycolysis and cancer // FEBS Lett. 2010. V. 584(20). P. 4292−8.

2. Richard C., Lanner C., Naryzhny S.N., Sherman L., Lee H., Lambert P., Zehbe I. The immortalizing and transforming ability of two common human papillomavirus 16 E6 variants with different prevalences in cervical cancer // Oncogene. V. 29. P. 3435−3445.

3. Naryzhny S. N. Blue Dry Western: simple, economic, informative, and fast way of immunodetection//Anal. Biochem. 2009. V. 392(1). P. 90−5.

4. Naryzhny S. N. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a proteomics view (review) // Cell. Mol. Life Sci. 2008. V. 65(23). P. 3789−808.

5. Naryzhny S. N., Lee H. Characterization of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) isoforms in normal and cancer cells: There is no cancer-associated form of PCNA // FEBS Lett. 2007. V. 581(25). P. 4917−20.

6. Naryzhny S. N., DeSouza L.V., Siu K.W.M., Lee H. Characterization of the human proliferating nuclear antigen physico-chemical properties: aspects of double trimer stability // Biochemistry and Cell Biology 2006. V. 84(5). P. 669−676.

7. Lee H, Naryzhny S. N., Coordination of multiple cellular functions by PCNA: Implication of the PCNA double trimer model // in the book «PCNA» 2007. P. 163−180 (ed. H. Lee) Research Signpost, Kerala, India.

8. Naryzhny S. N., Zhao H., Lee H. Human proliferating cell nuclear antigen (PCNA) may function as a doublehomotrimer complex in the mammalian cell//J. Biol. Chem. 2005. V. 280(14). P. 13 888−13 894.

9. Naryzhny S. N., Lee H. The post-translational modifications of proliferating cell nuclear antigen (PCNA): acetylation, not phosphorylation, plays an important role in the regulation of its function // J. Biol. Chem. 2004. V. 279(19). P. 20 194−20 199.

10. Naryzhny S. N., Lee H. Observation of multiple isoforms and specific proteolysis patterns of PCNA in the context of cell-cycle compartments and sample preparations // Proteomics 2003. V. 3. P. 930−936.

11. Naryzhny S. N., Lee H. Protein profiles of the Chinese hamster ovary cells in the resting and proliferating stages // Electrophoresis 2001. V. 22. P. 1764−1775.

12. Naryzhny S.N., Levina V.V., Varfolomeeva E.Y., Drobchenko E.A., Filatov M.V. Active dissociation of the fluorescent dye Hoechst 33 342 from DNA in a living cell: Who could do it? // Electrophoresis 1999. V. 20. P. 1033−1038.

13. Naryzhny S.N. «Active» two-dimensional electrophoresis of rat liver DNA-polymerase alpha//Electrophoresis 1997. V. 18. P. 553−556.

14. Нарыжный C.H. Выделение каталитически активной субъединицы протеинкиназы из комплексной формы ДНК-полимеразы альфа печени крысы методом электрофракционирования в денатурирующих условиях // Мол.Биол. 1996. Т. 30. № 6(2). С. 1403−1408.

14а. Naryzhny S.N. Purification of protein kinase catalytic subunit from the complex form of rat liver DNA polymerase alpha by denaturing electrofractionation // Mol. Biol. 1996. V. 30. No 6(2). P. 845−849.

15. Naryzhny S.N. Upside-down stopped flow electrofractionation of complex protein mixtures // Anal. Biochem. 1996. V. 238. P. 50−53.

16. Шевелев И. В., Нарыжный С. Н., Крутяков В. М. Выделение протеинфосфокиназы из комплексной формы ДНК-полимеразы альфа печени крысы // Мол.Биол. 1993. Т. 27. № 3. С. 531−537.

16а. Shevelev I.V., Naryzhny S.N., Krutyakov V.M. Isolation of a proteinphosphokinase from the complex form of rat liver DNA polymerase alpha//Mol. Biol. 1993. V. 27. No 3. P. 531−537.

17. Нарыжный C.H. Обнаружение ДНК-связывающих белков в полиакриламидном геле после денатурирующего электрофореза // Мол.Биол. 1992. Т.26. № 2. С. 307−314.

17а. Naryzhny S.N. Detection of DNA-binding proteins in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis //Mol.Biol. 1992. V. 26. No 2. P. 307−314.

18. Нарыжный C.H., Крутяков В. М. Анализ белков нормальной и регенерирующей печени крысы методом двумерного электрофореза // Биохимия 1989. Т. 54. № 12. С.2030;2036.

18а. Naryzhny S.N., Krutyakov V.M. The analysis of normal and regenerating rat liver proteins by two-dimensional gel electrophoresis // Biochemistry 1989. V. 54. No 12. P. 2030;2036.

Тезисы конференций, сборники и др.

1. Нарыжный С. Н. К вопросу об онкомаркерах: о чем нам может рассказать PCNA? // Материалы Всероссийской научной конференции «Медико-генетические проблемы онкологических заболеваний». — 2010. — Стерлитамак. — Креативная Хирургия и Онкология. — 2010. — N2.4 -Приложение. — САЗ.

2. Naryzhny S. N., Lee Н. Role of PCNA Interactions in cancer: proteomics view // Materials of the HUPO 8th Annual World Congress. ~ 2009. ~ Toronto, Canada. — Clinical Proteomics. — 2009. — V.5- SI. — P. 72.

3. Naryzhny S. N., Lee H. Proteomics of PCNA: cell transformation is accompanied by up-regulation of PCNA without post-translational modifications // Materials of the HUPO 7th Annual World Congress. — 2008. — Amsterdam, NL. — P. 85.

4. Naryzhny S. N., Lee H. Cell transformation is accompanied by up-regulated level of PCNA without post-translational modifications // Materials of CPI (Canadian Proteomic Initiative) Conference. — 2007. — Ottawa, Canada. -P. 56.

5. Naryzhny S.N. Coordination of multiple cellular functions by proliferating cell nuclear antigen (PCNA): Structure-functional aspect // Бреслеровские чтения. -2007. — Гатчина. — С. 168−177.

6. Naryzhny S.N., Lee H. The high level of PCNA may result in genetic instability // Materials of the HUPO 5th Annual World Congress.- 2006. ~ Long Beach, USA. — Molecular & Celular Proteomics. — 2006. — V.5. -No.10.-S.76.

7. Naryzhny S.N., Lee H. Analysis of PCNA Structure and functions by proteomics approach // Materials of the CPS (Canadian Proteomic Society) Conference. -2005. — Ottawa, Canada. — P.44.

8. Naryzhny S.N., Zhao H., Lee H «The Lord of the Rings: PCNA can coordinate multiple cellular functions due to symmetrical double ring structure // Materials of the CPI (Canadian Proteomic Initiative) Conference. — 2005. — Toronto, Canada. — P. 65.

9. Naryzhny S.N., Lee H. Human proliferating cell nuclear antigen (PCNA) may function as a double-homotrimer complex in the mammalian cell // Materials of the HUPO 4th Annual World Congress. — 2005. Munich, Germany. — Molecular & Cellular Proteomics. — 2005. — V.4. — No.8. — S.50.

10. Naryzhny S.N., Zhao H., Lee H. Mammalian proliferating cell nuclear antigen (PCNA) has a double homotrimer structure. Can it be molecular Janus? //Materials of the CPS (Canadian Proteomic Society) Conference. -2004. — London, Canada. -P.55.

11. Naryzhny S.N., Lee H. Post-translational modifications of proliferating cell nuclear antigen (PCNA): Acetylation, not phosphorylation, plays an important role in the regulation of PCNA function // Materials of the CPI (Canadian Proteomic Initiative) Conference. -2004. — Montreal, Canada. -P.61.

12. Naryzhny S.N., Lee H. Heterogeneity (micro-proteome) of proliferating cell nuclear antigen — where is a bottom? // Materials of the CPI (Canadian Proteomic Initiative) Conference. —2003. — Vancouver, Canada. — P. 18.

13. Naryzhny S. N and Lee H. PCNA Turnover in Cell Cycle and Involvement in DNA Repair is Linked to Modification by Ubiquitin // Materials of the HUPO 2ncl Annual & IUBMB XIX World Congress. 2003. — Montreal. -Molecular & Cellular Proteomics. -2003. -V.2. ~No9. — P. 746.

14. Naryzhny S.N., Lee H. About multiple forms of PCNA, or proteomics (microproteomics) approach to PCNA heterogeneity // Materials of the -5th Siena 2-D Electrophoresis Meeting, (from Genome to Proteome. — 2002. -Siena, Italy. -P.281.

15. Naryzhny S.N., Lee H. Protein profiles of the Chinese hamster ovary cells in the resting and proliferating stages // Materials of the 4th Siena 2-D Electrophoresis Meeting, (from Genome to Proteome). — 2000. — Siena, Italy. -P. 402. •.

16. Naryzhny S.N., Becker E.G., Sinitsyn A.P. Detection and study of cellulases and other proteins from Chaetomium cellulolyticum: 2D-electrophoresis maps of secreted proteins from different fungal strains // Materials of the.

International Conference «Biocatalysis-98, Fundamentals and Applications». — 1998. -Pushchino, Russia. — P.47.

17. Нарыжный C.H.- Прибор для препаративного электрофракционирования ДНК и белков: Свидетельство № 4533, Российская Федерация, МПК С12Р19/00. № 95 111 359, заявл. 03.07.1995, опубл. 16.07.1997, Бюл. № 7.

18. Нарыжный С.Н.- Метод препаративного электрофракционирования ДНК и белков: Патент № 2 104 082, Российская Федерация, МПК B01D57/02, G01N27/28. № 95 111 365, заявл. 03.07.1995, опубл. 10.02.1998, Бюл. № 4.

19. Naryzhny S.N. Discrete preparative electro fractionation of complex protein mixture // PNPI Research Report 1994;1995. — 1996. — Gatchina. — P.215−217.

20. Naryzhny S.N., Levina V.V., Varfolomeeva E.Y., Drobchenko E.A., Filatov M.V. Active dissociation of the fluorescent dye Hoechst 33 342 from DNA in a living cell: Who could do it? // Materials of the 3th Siena 2-D Electrophoresis Meeting, (from Genome to Proteome). — 1998. — Siena, Italy. -P.259. •.

21. Naryzhny S.N. «Active» two-dimensional electrophoresis of rat liver DNA-polymerase alpha // Materials of the 2th Siena 2-D Electrophoresis Meeting, (from Genome to Proteome). — 1996. — Siena, Italy. — P. 116,.