Анализ микроструктуры водных крахмальных систем методами электронной микроскопии

Крахмал является одним из наиболее распространенных веществ в растительном мире. Он является запасным веществом растений, участвующим в их метаболизме. Крахмал состоит из двух полисахаридов, разветвленных макромолекул амилопектина и линейных макромолекул амилозы, причем содержание последней в крахмалах обычно составляет 23−28% Предполагается, что в зависимости от соотношения полисахаридов крахмала, их тонкой структурной организации, а также морфологических особенностей нативных зерен крахмала, зависят сроки созревания растений и промышленное использование крахмала и крахмалосодержащего сырья.

Возобновляемость крахмала как промышленного сырья, его широкое распространение в природе, относительная легкость применения различных технологий для физической, химической, энзиматической, термогидромеханической модификации крахмала предопределило получение продуктов с различными физико-химическими, функциональными и потребительскими свойствами.

В настоящее время крахмал и крахмалосодержащее сырье широко используются в пищевой промышленности в качестве гелеобразователей, загустителей пен и эмульсий, его высокая водоудерживающая способность и способность образовывать комплексные соединения с ароматическими веществами определяют его использование в составе различных вареных колбас, улучшителей хлеба и хлебобулочных изделий, вкусоароматических пищевых добавок. Кроме того, крахмал широко используется в непищевых технологиях, в частности, при производстве кровезаменителей, биодегра-дируемых материалов, различных клеев и многих других материалов.

Крахмал играет решающую роль в определении структуры многих пищевых продуктов, очень важной как для потребителей, так и для производителей. Структура — это важнейший фактор, регулирующий вкусовые качества большей части пищевых продуктов. Желаемую структуру системы, содержащей крахмал, получают в результате тех изменений, которым подвергают крахмал в процессе технологических операций. Будущее производства крахмала зависит не только от усовершенствования оборудования для производства, но и в первую очередь от знаний о зерне крахмала, его строении и составе, физико-механических свойствах и коллоидном поведении компонентов зерна в водных системах, генетики и селекции сортов различного сырья, являющегося источником крахмала. .Понимание взаимосвязи между крахмалом и другими компонентами пищевых систем имеет большое значение для контроля свойств крахмалосодержалдах продуктов.

В последние годы в пищевой промышленности широко используются ароматизаторы, которые вносятся в пищевые продукты с целью улучшения их органолептических свойств. Представляет интерес изучить влияние ароматизаторов на структуру крахмальных систем. — В настоящее время для изучения структуры биополимерных систем эффективно используется электронная микроскопия. Особенностью метода электронной микроскопии является необходимость использования препаративной техники для подготовки объекта к исследованию.

При электронномикроскопическом исследовании систем биополимер-вода приходится учитывать то обстоятельство, что точные количественные методы анализа, используемые в современных приборах, ограничиваются неопределенностями, связанными с подготовкой объекта к анализу. Источником неопределенностей является методика приготовления образцовдействия, лежащие между естественным состоянием образца, и состоянием, в котором производится его анализ. Обычно препарирование биологического объекта включает в себя: изъятие образца из водной среды, перенос в высокий вакуум, разлом или разрез, обработку химическими соединениями. Кроме того образец в процессе исследования подвергается радиационному и термическому действию электронного пучка. При таком воздействии на образец различных факторов не должно происходить перераспределение или утрата материала в образце, в нем должны сохранятся первоначальные связи. Поэтому представляет интерес использовать не только один метод — электронно-микроскопический, но и привлекать другие методы исследования структуры. В настоящей работе при исследовании структуры криогет лей крахмала дополнительно привлекались методы ренгеновской фотоэлектт ронной спектроскопии и ренгенографии, а также метод термического анализа. Публикации, выполненные за достаточно большой период времени, показывают, что универсальной методики препарирования биополимеров не существует. Однако, авторы отмечают, что некоторые методы, связанные с замораживанием образца, приближаются к универсальным. Криометоды в настоящее время получили признание, но и они требуют большой осторожности при выборе условий препарирования. Кристаллизация растворителя в полимерной системе может явиться источником артефактов. В настоящей работе методическим вопросам криогенного препарирования уделяется большое внимание. Поэтому считаем необходимым посвятить литературный обзор вопросам подготовки объекта к исследованию в электронном микроскопе с использованием криотехники.

— 6.

В настоящей диссертационной работе ставились следующие задачи:

1) Изучение возможностей криостатов при исследовании водных суспензий и гелей биополимеров методами растровой и просвечивающей электронной микроскопии.

2) Изучение желатинизированных дисперсий крахмала методом, сканирующей туннельной микроскопии.

3) Изучение структуры криогелей кукурузного крахмала методом РЭМ с использованием криометодов.

Таким образом, при исследовании структуры водных крахмальных систем — набухших зерен крахмала, желатинизированных дисперсий крахмала, криогелей крахмала — нами использовались методы растровой и просвечивающей электронной микроскопии, а также сканирующей туннельной микроскопии.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые изучены методологические вопросы применения криоскопии в растровой электронной микроскопии систем биополимер-вода. Показано, что при исследовании водных биополимерных систем: дисперсий набухших зерен крахмала, дисперсий целлюлозы, гелей желатины с концентрацией полимера в системе менее 20% необходимо использовать криостат, позволяющий поддерживать температуру образца -140 — -130 С. В этом случае артефакты препарирования не возникают.

2. Методами электронной микроскопии, рентгенографии и термического анализа установлено, что биополимерные системы с концентрацией по-' лимера более 20% могут быть исследованы без артефактов, если используется стандартная препаративная техника замораживания-высушивания.

3. Показано, что при исследовании термочувствительных полимерных систем с металлосодержащими кластерами криостат позволяет защитить образец от локального нагрева и изменения структуры вследствие термического действия электронного пучка.

4. Впервые проведено исследование дисперсий клейстеризованного картофельного крахмала методом сканирующей туннельной микроскопии. Определены условия препарирования образцов и получения СТМ-изображения этих крахмальных систем.

5. Определены размеры кластеров конечной длины — около 500 нмдля дисперсий клейстеризованного картофельного крахмала. Данные сканирующей туннельной микроскопии коррелируют с данными просвечивающей электронной микроскопии.

6. Впервые методами растровой электронной микроскопии и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии исследована в водной среде сорбция ароматизаторов н-октилацетата, н-октанола, 2-деканона и н-бутила-цетата криогелями кукурузного крахмала. Показано, что в результате обработки поверхности криогеля соединениями с углеводородными заместителями н-С возникают надмолекулярные ассоциаты криогеля кукурузного крахмала с ароматообразующими соединениями размером 0,3 — 0,5 мкм, которые в случае н-октилацетата занимают 25% площади стенок криогеля и 10 — 13% в случае н-октанола и н-октилметилкетона.. Результаты свидетельствуют о гидрофобном характере сорбции органических веществ криогелями крахмала. Показано, что ароматообразующие соединения не улетучиваются из образца в условиях высокого вакуума.

7. Методом СТМ определен этап получения криогеля крахмала, на ко.

— 88 тором происходит процесс разрыхления структуры.

8. Рентгенографическим методом определена степень кристалличности зерен кукурузного и картофельного крахмала, а также криогелей кукурузного крахмала без обработки и с обработкой н-октилацетатом. Для исходного криогеля степень кристалличности составляет 5−8%, для криогеля с н-октилацетатом 2−5%, для зерен кукурузного и картофельного крахмала 25% и 20% соответственно.

9. Впервые рентгенографическим методом определена продолжительность индукционного периода криогелей кукурузного крахмала, исходного и содержащего н-октилацетат, в процессе ретроградации. Показано, что добавление ароматообразующей добавки увеличивает индукционный период с 5−7 суток до 8 — 10 суток.

10. Изучена сорбция физиологически активных ионов железа с с кри-огелями кукурузного крахмала. Средняя поверхностная концентрация, определенная методом РФЭС, в исходном и модифицированном криогеле составляет 2 ат.%, что совпадает с данными электронной микроскопии. Показано, что химическое взаимодействие между металлосодержащими частицами и крахмалом не происходит.

11. Основным результатом данной работы является научно-экспериментальное обоснование применения современных форм электронно-микроскопического метода водно-полимерных систем в интересах пищевой промышленности и науки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

При исследовании структуры сухих зерен крахмала методом РЭМ вопросы препаративной техники для таких объектов не возникают. Этим, по-видимому, можно объяснить то обстоятельство, что большинство работ по электронной микроскопии крахмальных систем посвящено изучению структуры нативных ненабухших зерен крахмала. Однако водные системы крахмала представляют большой научный и практический интерес. Поэтому разработка препаративной техники в растровой электронной микроскопии водных крахмальных систем является весьма актуальной задачей. В настоящей работе показано, что трудности, связанные с препарированием этих систем, могут быть преодолены при использовании криогенной электронной микроскопии.

В ранних работах, посвященных электронномикроскопическому исследованию набухших зерен крахмала, растворов и гелей крахмала, препарирование образцов проводилось криометодами в условиях, разработанных Моором для биологических объектов (127,128). Отсутствие методологически обоснованной препаративной криотехники для систем биополимер-вода не позволило в этих работах избежать артефактов, вызванных препарированием образца. Проведенная нами работа на ряде биополимерных систем позволила определить условия препарирования криометодами, позволяющими исключить артефакты. Показано, что в зависимости от локальной концентрации полимера в системе используется тот или иной препаративный метод. Если локальная концентрация полимера высокая, то можно использовать метод замораживания-высушивания. Этот метод также пригоден и для сильно разбавленных растворов.

При исследовании водосодержащих образцов с концентрацией полимера ниже 20% использование криостатов позволяет получить информацию о реальной структуре растворов, гелей, суспензий биополимеров. В этом случае нет необходимости повышать скорость замораживания, применяя сложные приемы, описанные в литературе. Другим аспектом применения криостатов является возможность защитить органический объект от радиационного и термического действия электронного пучка. Литературные данные и полученные нами результаты показывают, что для термочувствительных полимерных систем применение криостатов весьма эффективно при исследовании объектов методами ПЭМ, РЭМ и РСМА.' Что касается сканирующей туннельной микроскопии, то образец в процессе исследования в СТМ не изменяет свою структуру. В работе изучены условия препарирования дисперсий клейстеризованного крахмала, которые могут быть использованы в эксперименте комбинированного растрового электронного микроскопа, сочетающего возможности РЭМ и СТМ.

На примере криогелей кукурузного крахмала показаны возможности криогенной электронной микроскопии. В работе проведено исследование структуры криогелей кукурузного крахмала, содержащих различные арома-тообразующие соединения. Показано, что характер надмолекулярной организации модифицированной поверхности криогеля крахмала зависит от природы ароматообразующих соединений. Наибольшее влияние на структуру криогеля крахмала оказывает н-октиладетат, наименьшее — н-бутилацетат. Привлечение других структурных методов — рентгенографии, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии — позволило сопоставить данные электронной микроскопии с результатами этих методов. Это позволило получить информацию о реальной структуре исходного и модифицированного криогеля кукурузного крахмала. Показано, что структура модифицированного криогеля крахмала сохраняется в течение длительного времени хранения в холодильнике, ароматообразующее вещество не улетучивается в условиях высокого вакуума. Полученные данные могут представлять интерес при разработке технологий для пищевой промышленности.

Необходимо отметить две концепции, касающиеся перспектив развития криотехники в электронной микроскопии водосодержащих объектов. Первая — это увеличение скорости замораживания микрообъекта. Этой концепции в основном придерживались зарубежные исследователи в ранних работах. Вторая концепция касается условий препарирования замороженного объекта. Отдельные работы последних лет и наши исследования показывают, что использование криостатов, поддерживающих температуру образца в диапазоне -130−150″. С в процессе препаративных операций, позволяет избежать артефактов и выявить реальную структуру водных биополимерных систем. Использование криостатов в электронной микроскопии может также рассматриваться как способ защиты органического объекта от радиационного и термического действия электронного пучка.

В настоящее время имеются определенные трудности при использовании криогенной электронной микроскопии (129,130). Решение технических проблем позволит в дальнейшем использовать криометоды при исследовании широкого круга объектов.