Судебно-химическое исследование нитробензола и его основных метаболитов

Актуальность темы

Нитрои аминопроизводные бензола широко используются в синтезе органических красителей и некоторых сельскохозяйственных ядохимикатов.

В клинике интоксикаций данными соединениями характерными являются поражения нервной системы, красной крови с образованием метгемоглоби-на, развитие гемолитической анемии, гепатотоксическое и пефротоксическое действие.

Одним из представителей данной группы соединений является нитробензол. Известно применение нитробензола в качестве полупродукта органических синтезов, ароматизатора, реагента в аналитической практике, растворителя. Он обладает высокой токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку. Описаны случаи отравления нитробензолом, в том числе с летальным исходом. Отравления могут происходить при непосредственном контакте с веществом в процессе производства, хранения, применения, вследствие аварии, в условиях загрязнения объектов окружающей среды отходами химических производств, выбросами в атмосферу и сточными водами предприятий.

Летальная доза нитробензола для человека составляет 10 мг/кг, но смертельный исход может наступить уже от приема 1−2 мл или нескольких капель вещества.

Широкое применение нитробензола, его токсичность и токсичность ряда его основных метаболитов, наличие случаев смертельного отравления обусловливает необходимость изучения данного вещества в судебно-химическом отношении.

До настоящего времени условия изолирования нитробензола и его метаболитов из биологического материала, их очистки, идентификации и количественного определения недостаточно изучены. Отсутствует методика определения нитробензола при наличии его метаболитов в биологическом материале. В доступной литературе практически отсутствуют данные по сохраняемости нитробензола и его метаболитов в трупном материале в зависимости от ряда внешних факторов.

Исходя из вышеизложенного, разработка методики судебно-химического исследования нитробензола и его основных метаболитов является актуальной.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей диссертационной работы являлась разработка методики судебно-химического исследования нитробензола и его основных метаболитов: анилина, о-, м-, я-нитрофенолов, м-нитроанилина, о-, м-, я-аминофенолов, «-нитрокатехола. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Определить особенности хроматографического поведения нитробензола и его основных метаболитов в тонких слоях и колонках сорбентов, выявить оптимальные условия идентификации и количественного определения объектов исследования методами ТСХ и ВЭЖХ;

2. Изучить особенности взаимодействия исследуемых соединений с рядом цветореагентов, показать возможность применения отдельных реакций в условиях анализа биологического материала;

3. Провести изучение возможности применения различных видов экстракционных процессов для концентрирования и очистки объектов исследования;

4. Исследовать закономерности изолирования объектов исследования отдельными классами изолирующих жидкостей из биологического материала, разработать схему очистки извлечений;

5. Изучить особенности распределения нитробензола в организме теплокровных животных;

6. Определить сроки сохраняемости объектов исследования в трупном материале и исследовать зависимость скорости разложения анализируемых веществ в трупном материале от продолжительности и температурного режима сохранения.

Научная новизна исследований. Изучены особенности хроматографиче-ского поведения нитробензола и его основных метаболитов в сорбентах с гид-роксилироваиной поверхностью при использовании различных подвижных фаз. Расчитаны значения ряда величин, характеризующих хроматографическую подвижность веществ. Определены оптимальные условия хроматографическо-го рвзделения объектов исследования в тонких слоях и колонках сорбентов.

Разработаны унифицированные, хорошо воспроизводимые, высокочувствительные методики обнаружения и количественного определения нитробензола и его основных метаболитов.

Изучены особенности светопоглощения рассматриваемыми соединениями в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной областях спектра, рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров.

Определены оптимальные условия экстрагирования нитробензола и его основных метаболитов из водных растворов с учетом рН среды, насыщения экстрагентов водой и природы органических растворителей.

Впервые, применяя сочетание методов экстракции и хроматографической очистки, разработаны оригинальные методики определения объектов исследования в ткани трупных органов и биожидкостях, которые могут быть использованы как для исследования свежего, так и гнилостно-измененного трупного материала.

С помощью разработанных методов изучены особенности распределения нитробензола в органах и биологических жидкостях теплокровных животных (кролики), отравленных нитробензолом.

Получены данные по сохраняемости объектов исследования в ткани трупных органов. Исследована зависимость скорости разложения веществ от продолжительности и температурного режима сохранения.

Предложена схема судебно-химического исследования нитробензола и ряда его основных метаболитов.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработана методика изолирования из биологического материала, очистки, идентификации и количественного определения нитробензола (информационное письмо «Определение нитробензола при судебно-химическом исследовании биологического материала» (№ 129 от 15. 03. 04- утверждено Российским центром судебно-медицинской экспертизы МЗ РФ. — М., 2004. — 26 с.).

Внедрение результатов работы:

• методика определения ряда метаболитов нитробензола методом ВЭЖХ (внедрена в научный процесс кафедры неорганической химии Курского государственного медицинского университета с 17.11.2003 г.- акт внедрения № 22 от 12.04.2005 г.);

• методика количественного определения нитробензола и его основных метаболитов методом спектрофотометрии (внедрена в научный процесс кафедры органической химии Курского государственного медицинского университета с 15.12.2003 г.- акт внедрения № 25 от 15.04.2005 г.);

• методика экстракционно-фотометрического определения метаболитов нитробензола в биологическом материале при совместном присутствии (внедрена в научный процесс кафедры фармацевтической химии Курского государственного медицинского университета с 22.01.2004 г.- акт внедрения № 20 от 06.04.2005 г.);

• методика идентификации нитробензола и его основных метаболитов в тонком слое силикагеля (пластины «Силуфол» иУ-254) (внедрена в научный процесс кафедры органической химии Курского государственного медицинского университета с 11.02.2004 г.- акт внедрения № 24 от 15.04.2005 г.);

• методики определения нитробензола и ряда его метаболитов на основе реакции с гидроксидом натрия (внедрена в научный процесс кафедры неорганической химии Курского государственного медицинского университета с 19.02.2004 г.- акт внедрения № 23 от 12.04.2005 г.) — и методика определения нитробензола и его метаболитов в биологическом материале методом ВЭЖХ (внедрена в научный процесс кафедры фармацевтической химии Курского государственного медицинского университета с 26.02.2004 г.- акт внедрения № 21 от 06.04.2005 г.).

Апробация работы. Основные положения работы представлены и доложены на X и XI Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва 2003, 2004 гг.), 67-й и 69-й межвузовских научных конференциях студентов и молодых ученых (Курск 2002, 2003 гг.), 67-й, 68-й и 69-й итоговых научных сессиях КГМУ и отделения медико-биологических наук ЦентральноЧерноземного научного центра РАМН (Курск 2002, 2003, 2004 гг.), 32-й вузовской научно-технической конференции студентов и аспирантов в области научных исследований.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета № 36 РАМН. Номер государственной регистрации 01. 200. 117 602.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Материалы диссертации изложены на 236 страницах машинописного текста, содержат 61 рисунок, 40 таблиц и 6 формул. Список цитируемой литературы включает 168 источников, из которых 54 на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

1. Изучена хроматографическая активность нитробензола и его основных метаболитов в тонких слоях и колонках нормальнофазных сорбентов при использовании элюентов различной полярности. Рассчитан ряд параметров хроматографирования. Установлено, что наиболее оптимальными подвижными фазами для селективного разделения объектов исследования методами ТСХ и ВЭЖХ являются соответственно системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2-ацетон (40:15:2:0,5) и гексан-диоксан-пропанол-2 (50:20:3).

2. Исследован характер поглощения веществами электромагнитного излучения в УФ-, видимой и ИК-областях спектра. Показана возможность идентификации рассматриваемых соединений методами электронной и колебательной спектрофотометрии.

3. Разработаны методики количественного определения нитробензола и его основных метаболитов методами СФМ и ВЭЖХ. Относительная ошибка среднего результата не превышает соответственно ±1,3 и ±2,1%.

4. На основе изученных хромогенных реакций нитробензола и мононитрофе-нолов с гидроксидом натрия в среде ДМФА-вода разработаны методики идентификации и количественного определения рассматриваемых соединений. Относительная ошибка среднего результата при количественном определении не превышает ±1,5%.

5. Изучена экстрагируемость метаболитов нитробензола из водных растворов гидрофобными органическими растворителями в зависимости от природы экстрагента, рН среды, насыщения экстрагентов водой. Показано, что моно-нитрофенолы наиболее полно извлекаются хлороформом из водных растворов с рН 2,0, а анилин и моноаминофенолы — диэтиловым эфиром, насыще-ным водой и этилацетатом из водных растворов с рН 6,0−7,0. Предложены эффективные способы экстракционной и хроматографической очистки объектов исследования от соэкстрактивных веществ биологического материала.

6. Проведено сравнительное изолирование нитробензола и его основных метаболитов из биологического материала различными изолирующими агентами. Определены оптимальные условия изолирования анализируемых веществ толуолом (для нитробензола) и ацетоном (для метаболитов нитробензола).

7. Разработаны методики определения объектов исследования в тканях трупных органов и биожидкостях на основе изолирования оптимальными изолирующими агентами и последующей очистки извлечений методом хроматографии или сочетанием методов экстракции и хроматографии. Разработанные методики характеризуются достаточными для подобного рода исследований правильностью и воспроизводимостью.

8. Исследованы особенности распределения нитробензола в организме теплокровных животных (кролики) при введении отравляющего вещества через желудок. Установлено присутствие в органах и биожидкостях отравленных животных как нитробензола, так и ряда его метаболитов: ми п-нитрофенола, я-аминофенола.

Заключение

Обзор источников литературы по теме диссертации включает известные сведения о свойствах, применении, токсическом действии на организм нитробензола и ряда его метаболитов, а также о методах их обнаружения, количественного определения и способах изолирования из биоматериала и биожидкостей.

Идентификация объектов исследования основана, главным образом, на их способности образовывать окрашенные продукты с рядом цветореагентов. Имеющиеся методики определения характеризуются недостаточной селективностью, некоторые из них зачастую длительны по выполнению.

Для количественного определения рассматриваемых соединений в источниках литературы предложен ряд химических и физико-химических методов. Однако, в связи с тем, что информация носит отрывочный характер, отсутствуют способы определения объектов исследования при их возможном совместном присутствии в извлечениях, полученных из объектов биологического происхождения, адаптация данных методик к условиям судебно-химического анализа крайне затруднительна.

Недостаточно изучены вопросы изолирования и очистки рассматриваемых веществ. Многие известные методики изолирования нитробензола основаны на применении перегонки с водяным паром. Они, как правило, трудоемки и требуют использования громоздкой аппаратуры.

Имеющаяся информация не дает полного представления об особенностях распределения и сохраняемости рассматриваемых соединений в ткани трупных органов и биожидкостях в зависимости от ряда факторов окружающей среды.

На основании существующих данных источников литературы можно сделать заключение о необходимости изучения нитробензола и его основных метаболитов в судебно-химическом отношении и разработки унифицированной методики их определения в биологическом материале.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования:

1. Нитробензол ч. д. а. ТУ 6−09−99−120−78;

2. Анилин ч. д. а. или х. ч. ГОСТ 5819–78 (содержание основного вещества более 99,5%);

3. о-Нитрофенол ч. ТУ 6−09−11−1561−81;

4.^{-Нитрофенол} ч. д. а. ТУ 6−09−9915−74;

5. и-Нитрофенол ч. д. а. ТУ 6−09−3973−75;

6. о-Аминофенол ч. д. а. (фирма «АМисИ», Германиярегистрационный номер 935IXсодержание действующего вещества 99,9%);

7. лг-Аминофенол ч. д. а. (фирма «АШгюЬ», Германиярегистрационный номер 1024Хсодержание действующего вещества 99,9%);

8. и-Аминофенол ч. д. а. МРТУ 6−09−6035−69;

9. лг-Нитроанилин ч. д. а. ТУ 6−09−4181−76;

10. и-Нитрокатехол ч. д. а. (фирма «АМпсЬ», Германиярегистрационный номер 25 455−071- содержание действующего вещества 97,0%).

Приборы:

1. Спектрофотометр СФ-46 (производственное объединение «ЛОМО», г. Ленинград);

2. Спектрофотометр СФ-56 (производственное объединение «ЛОМО», г. СПб);

3. Спектрофотометр СФ-2000 (г. Москва);

4. ИК-Фурье спектрофотометр «№ко1е1 Magna-750» (США);

5. Жидкостный хроматограф «Милихром» (производственное объединение «Научприбор», г. Орел);

6. Ультрафиолетовый облучатель Л-80;

7. Потенциометр ЭВ-74;

8. Термостат ТС-80 М-2;

9. Вакуумный испаритель;

10. Водяная баня;

11. Электроплитка.

Реактивы:

1. Ацетон о. с. ч. ТУ 6−09−3513−86;

2. Ацетонитрил ч. ТУ 6−09−8534−87;

3. Борная кислота х. ч. ГОСТ 9656–75;

4. Гексан ч. д. а. ТУ 261 -003−5 807 999−98;

5. Гидроксид натрия х. ч. ГОСТ 4328–77;

6. 1, 4-Диоксан ч. д. а. ГОСТ 10 455–80;

7. И, Ыдиметилформамид (ДМФА) ч. ГОСТ 20 289;

8. Диэтиловый эфир ОСТ 82−2006;88;

9. Нитрат калия ч. д. а. ГОСТ 4217–77;

10. Пропанол-2 х. ч. ТУ 6−09−402−87;

11. Серная кислота х. ч. ГОСТ 4204–77;

12. Сульфат натрия безводный х. ч. ГОСТ 4166–76;

13. Тетрахлорметан ч. д. а. ГОСТ 20 288–74;

14. Толуол ч. д. а. ГОСТ 5789–78;

15. Уксусная кислота х. ч. ГОСТ 61–75;

16. Фосфорная кислота ч. д. а. ГОСТ 6552–80;

17. Хлорид 2,3,5-трифенилтетразолия ч. д. а. ТУ 6−09−07−1646−87;

18. Хлороводородная кислота х. ч. ГОСТ 3118–77;

19. Хлороформ ч. д. а. ТУ 2631−020−11 291 058−96;

20. Этанол 95%;

21. Этилацетат х. ч. ГОСТ 22 300–76.

Материалы:

1. Бумага индикаторная универсальная ПНД 50−975−84 («Lachema», Чехия);

2. Колонки хроматографические КАХ-1 и КАХ-3 размерами 64×2 мм для жидкостного хроматографа, заполненные сорбентом «Силасорб-600»;

3. Силикагель L 40/100/z («Lachema», Чехия);

4. Хроматографические пластины типа «Силуфол» UV-254;

5. Фильтры бумажные.

Посуда:

1. Бюретки стеклянные градуированные на 25 мл;

2. Воронки делительные вместимостью 25, 50 и 100 мл;

3. Колбы мерные на 10, 25 и 50 мл;

4. Колбы конические на 100 и 200 мл;

5. Камеры хроматографические цилиндрические стеклянные (внутренний объем около 600 см);

6. Пробирки стеклянные вместимостью 20 мл;

7. Пипетки градуированные на 0,2, 1, 2, 5 и 10 мл;

8. Стеклянные фильтры № 4 (диаметром 2 см);

9. Цилиндры мерные градуированные на 10, 50, 100 и 250 мл;

10. Чашки выпарительные фарфоровые вместимостью 50, 100 и 250 мл.

Методы исследования Были использованы методы хроматографии в тонком слое сорбента, жидкостной колоночной хроматографии низкого давления, спектрофотометрии в УФ-, ИКи видимой областях спектра, высоко-эффективной жидкостной хроматографии.

Статистическая обработка данных Методики количественного определения были разработаны на модельных смесях с известным содержанием определяемого вещества. Обработка результатов проводилась в соответствии с установленными требованиями и с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel» .

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ НИТРОБЕНЗОЛА И ЕГО ОСНОВНЫХ МЕТАБОЛИТОВ.

2.1. Идентификация хроматографическими методами 2.1.1.Идентификация в тонких слоях нормальнофазного сорбента Изучена хроматографическая подвижность нитробензола и его основных метаболитов в тонком слое силикагеля с гидроксилированной поверхностью (пластины «Силуфол» иУ-254).

В процессе исследования на линию старта хроматографической пластины размером 6×10 см наносили по 5 мкг каждого из анализируемых веществ в виде 0,02% этанольного раствора. Для хроматографического разделения объектов исследования использовали стеклянные камеры с внутренним объемом около 600 см. Перемещение подвижной фазы в слое сорбента происходило восходящим методом под действием капиллярных сил. Детекцию хроматограмм осуществляли в УФ-свете. Наблюдали появление темных пятен анализируемых веществ на более светлом общем фоне пластины. В УФ-свете пятна нитробензола и нитрофенолов имели фиолетовую окраску, а анилина, аминофенолов и я-нитрокатехола — светло-желтую, усиливающуюся при обработке пластины парами аммиака.

Хроматографическая активность рассматриваемых соединений обусловлена различными типами взаимодействий, основные из которых приводят к образованию водородных связей. Данные связи образуются при взаимодействии силанольных групп адсорбента, имеющего гидроксилированную поверхность, и отдельными группами атомов в молекулах адсорбата. Кроме возникающих связей между адсорбатом и адсорбентом на хроматографическую подвижность соединений влияют взаимодействия, которые возникают между поверхностью адсорбента и подвижной фазой, а также подвижной фазой и адсорбатом.

В работе рассмотрена возможность применения однои двухкомпонент-ных подвижных фаз при изучении хроматографической активности объектов исследования. В качестве подобных фаз использовались растворители с различной полярностью. Низшие предельные алифатические углеводороды (гек-сан, гептан), обладающие наименьшей диэлектрической проницаемостью, обусловливали наименьшую хроматографическую подвижность рассматриваемых веществ. При этом фенольный гидроксил, нитрои аминогруппы взаимодействовали с гидроксилированной поверхностью силикагеля с образованием различного рода связей, в том числе водородных. В этом случае пятна веществ на хроматограмме обнаруживались вблизи линии старта. Рост хроматографической подвижности анализируемых веществ наблюдался при увеличении диэлектрической проницаемости элементов систем. Наибольшие значения подвижности объектов исследования достигались в сильнополярных элюентах. Объяснить это можно тем, что полярные растворители обладают достаточным сродством к анализируемым веществам и способны конкурировать с ними при образовании связей с силанольными группами сорбента. В данных условиях взаимодействие активных групп объектов исследования с поверхностью сорбента ослабляется и происходит увеличение скорости продвижения веществ вместе с подвижной фазой.

По данным результатов хроматографирования нитробензола и его основных метаболитов при использовании однои двухкомпонентных подвижных фаз составлялись элюенты из трех или четырех компонентов. В каждую из таких систем включали неполярный или малополярный растворитель и один или два растворителя со средней или сильной полярностью в различных объемных соотношениях. Многокомпонентные подвижные фазы позволили подобрать оптимальные условия хроматографического разделения анализируемых объектов. Результаты хроматографирования нитробензола и его основных метаболитов с использованием трехи четырехкомпонентных элюентов представлены в таблице 1.

Для оценки поведения исследуемых структур при хроматографировании нами был рассчитан ряд величин: (относительно стандартного вещества.

•, и-нитрофенола), В, ЯГвеличина, которая представляет собой отношение средних скоростей перемещения вещества и фронта подвижной фазы за время получения хрома-тограммы.

• величина, которая определяется как отношение ИТ анализируемого и стандартного вещества.

В — условное удерживание в тонком слое сорбента, рассчитаное по формуле:

В=1/ИГ (1).

Рк • - относительный коэффициент емкости тонкого слоя, определяемый по формуле:

К, = ш. <-' где 1Уа — значение КГ анализируемого вещества, ИД — значение КГ «базовой структуры» (л*-нитрофенола).

А (ЛО) — относительное изменение свободной энергии при адсорбции (по отношению к льнитрофенолу), найденное по формуле:

Л (ЛО)=-К-Т-1пРк. (3).

Значения рассчитанных величин представлены в таблице 1.

Как свидетельствуют полученные данные, величина хроматографической активности (относительно изменения свободной энергии при адсорбции) рассматриваемых соединений, при использовании малополярных элюентов, содержащих преимущественно гексан, возрастает в ряду л/-аминофенол —> п-нитрокатехол —" о-аминофенол —" я-аминофенол —> и-нитрофенол —" м-нитроанилин —> лг-нитрофенол —> анилин —> о-нитрофенол—> нитробензол.

Наиболее подвижным на пластинах «Силуфол» ЦУ-254 является нитробензол, который в своей структуре имеет нитрогруппу, практически не способную к образованию водородных связей с поверхностью силикагеля. Нитрофе-нолы в своей структуре кроме нитрогруппы содержат в орто-, метаили пара-положении гидроксильную группу, обладающую большей способностью, чем нитрогруппа, взаимодействовать с поверхностью сорбента. Образование внутримолекулярной водородной связи между нитрогруппой и фенольным гидро-ксилом происходит у о-нитрофенола в большей степени, чем у .и-нитрофенола и и-нитрофенола, поэтому значение относительного изменения свободной энергии при адсорбции для и-нитрофенола оказывается меньшим, чем для о-нитрофенола, что проявляется меньшей хроматографической подвижностью п-нитрофенола по сравнению с о-нитрофенолом.

Аминогруппа в структуре анилина имеет возможность более активно взаимодействовать с гидроксилированной поверхностью силикагеля, по сравнению с нитрогруппой, уменьшая тем самым хроматографическую подвижность вещества.

Хроматографическую активность моноаминофенолов характеризует наличие фенольного гидроксила и аминогруппы в структуре веществ. При этом элюент, основу которого составляет неполярный растворитель, оказывает влияние на подвижность исследуемых объектов. и-Аминофенол в большей степени, чем ои д/-аминофенол, способен взаимодействовать с полярным компонентом подвижной фазы — диоксаном, что уменьшает возможность взаимодействия вещества с гидроксилированной поверхностью сорбента и увеличивает его хроматографическую подвижность.

Наличие нитрои аминогруппы в структуре, и-нитроанштина способствует увеличению возможности конкурентного взаимодействия данных групп с поверхностью сорбента. Следовательно, хроматографическая подвижность м-нитроанилина будет меньше подвижности анилина и, соответственно, нитробензола.

Наименее подвижным на пластинах «Силуфол» иУ-254 является м-аминофенол, который в своей структуре имеет гидроксильную группу и аминогруппу в положении «3». Из-за незначительного внутримолекулярного взаимодействия фенольного гидроксила и первичной аминогруппы увеличивается возможность более активного взаимодействия данных групп с гидроксилиро-ванной поверхностью силикагеля. При этом хроматографическая подвижность вещества уменьшается и значение относительного изменения свободной энергии при адсорбции будет минимальным.

Введение

в состав подвижной фазы сильнополярного компонента — ацетона не меняет порядок продвижения веществ по пластине, но изменяет хрома-тографическую подвижность каждого из анализируемых веществ.