Локализация транспортного белка гордеивируса в ядрышке и его взаимодействие с белками ядрышка и телец Кахаля

ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Показано, что транспортный белок ТБГ1 гордеивируса полулатентного вируса мятлика, слитый с зеленым флуоресцентным белком, способен локализоваться в ядрышке эпидермальных клеток N. benthamiana при индивидуальной экспрессии (в отсутствии других вирусных белков). Показано, что сигналы, необходимые для локализации белка ТБГ1 в ядре и ядрышке, картируются в составе неупорядоченного N-концевого домена… Читать ещё >

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Общая характеристика ядра и ядерных компартментов
- 1. 1. Ядро
- 1. 2. Ядрышко
  - 1. 2. 1. Фибриллари н
  - 1. 2. 2. Нуклеолин
  - 1. 2. 3. Белок В
  - 1. 2. 4. Дополнительные функции ядрышка
- 1. 3. Тельца Кахаля
2. Ядрышко и вирусная инфекция
- 2. 1. Взаимодействие вирусспецифических белков вирусов человека и животных с белками ядра и ядрышка
- 2. 2. Локализация вирусспецифических белков вирусов растений в ядрышке клеток
3. Сигналы ядерной и ядрышковой локализации в составе клеточных и вирусных белков
- 3. 1. Сигналы ядерной локализации
- 3. 2. Сигналы локализации в ядрышке
4. Вирусы растений, белки которых локализуются в ядрышках зараженных клеток
- 4. 1. Умбравирусы
- 4. 2. Вирусы с тройным блоком транспортных генов
- 4. 3. Потивирусы
- 4. 4. Другие белки вирусов растений, роль локализации которых в ядрышке не ясна
5. Особенности транспорта в растениях вирусов с тройным блоком транспортных генов на моделях гордеивирусов и помовирусов
- 5. 1. Характеристика гордеивирусов
- 5. 2. Характеристика помовирусов
- 5. 3. ТБГ гордеивирусного типа и транспорт вируса
- 5. 4. Свойства белков ТБГ1 гордеивирусного типа
- 5. 5. Транспортная форма гордеи-подобных вирусов
- 5. 6. Субклеточная локализация белков ТБГ
- 5. 7. Модель внутриклеточного и межклеточного транспорта вирусов с гордеи-подобным ТБГ
  - 5. 7. 1. Модель транспорта гордеивирусов
  - 5. 7. 2. Модель транспорта помовирусов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При индивидуальной экспрессии белок ТБГ1 ПЛВМ выявляется в ядрышках эпидермальных клеток растений N. benthamiana
Биоинформатический анализ аминокислотной последовательности белка ТБГ1 ПЛВМ
N-концевой домен отвечает за локализацию белка ТБГ1 ПЛВМ в ядрышке
Картирование сигнала ядерной локализации в кластере, А домена NTD
Картирование сигнала ядерного экспорта
GAR домен фибрилларина взаимодействует с NTD белка ТБГ1 ПЛВМ in vitro
Визуализация взаимодействия белка ТБГ1 и фибрилларина in vivo методом бимолекулярной флуоресцентной комплементации (БиФК)
N-концевой участок домена NTD отвечает за взаимодействие с фибрилларином
Транспортный белок ТБГ1 ПЛВМ способен взаимодействовать с коилином in vitro. Кластер, А NTD отвечает за связывание с коилином
Визуализация взаимодействия белка ТБГ1 и коилина in vivo методом бимолекулярной флуоресцентной комплементации (БиФК)
ВЫВОДЫ

Локализация транспортного белка гордеивируса в ядрышке и его взаимодействие с белками ядрышка и телец Кахаля (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Взаимодействия между вирусом и клеткой растения-хозяина играют центральную роль в жизненном цикле вирусной инфекции. Анализ взаимодействий вирус-хозяин является критически важным для понимания механизмов вирусной инфекции и для развития новых стратегий противодействия вирусам. Вирусы являются облигатными внутриклеточными патогенами с геномом небольшого размера и, таким образом, основывают свою стратегию на обращении в свою пользу и эксплуатации клеточных функций и механизмов для обеспечения их собственной репликации. Клеточное ядро является одним из ключевых отличий эукариотической клетки от прокариотической. Это высоко динамичная, окруженная мембраной органелла, в которой происходят главнейшие события жизни клетки, включая репликацию ДНК, синтез и процессинг информационной РНК, а также биогенез субъединиц рибосом. Поскольку ядро играет ключевую роль в функционировании клетки растения-хозяина, неудивительно, что вирусы взаимодействуют с этой органеллой и ее компартментами, и что эти взаимодействия играют ключевую роль в цикле вирусной инфекции. Действительно, некоторые вирусы, включая ДНК-содержащие бегомовирусы растений, РНК-содержащие (с обратной транскрипцией) каулимовирусы и обладающие негативным РНК-геномом рабдовирусы реплицируются в ядре, и, таким образом, представляется логичным, что эти вирусы модифицируют структуру ядра с целью захвата некоторых функций ядра и обеспечения соответствующего окружения для собственной репликации. Напротив, вирусы с одноцепочечным РНК геномом положительной полярности реплицируются в цитоплазме. Цель взаимодействия подобных РНК-содержащих вирусов с ядром не столь очевидна. Однако все возрастающее количество сообщений свидетельствует, что цитоплазматические РНК-содержащие вирусы, включая вирусы растений, также могут локализоваться в ядре, конкретнее, в ядрышке. Стадия локализации в ядрышке является необходимой для успешного развития вирусной инфекции. Взаимодействие с белками ядрышка у различных вирусов требуется для обеспечения различных этапов жизненного цикла вирусов, в том числе для защиты от посттранскрипционного умолкания генов, репликации вирусного генома и распространения вируса в инфицированных растениях. Нарушая стадию локализации вирусных белков в ядрышке и их взаимодействие с белками ядрышка, можно влиять на эффективность вирусной инфекции.

Таким образом, исследования причин и путей, которыми РНК-содержащие вирусы растений взаимодействуют с ядрышком, преследуя свои собственные цели, позволяет не только лучше понять молекулярную биологию вирусов растений и ускорить разработку новых стратегий для контроля вирусных заболеваний. Эти исследования также могут прояснить фундаментальные принципы структуры и функционирования растительного ядрышка.

Объектом данной работы является транспортный белок, кодируемый первым геном специального транспортного модуля — тройного блока генов (ТБГ), гордеивируса полулатентного вируса мятлика (белок ТБГ1 ПЛВМ). Белок ТБГ1 гордеивирусов образует рибонуклеопротеидный (вРНП) комплекс с геномной и субгеномными РНК вируса для ближнего транспорта между соседними клетками растения и дальнего транспорта по проводящей системе растения флоэме. В составе М-концевого домена (ЫТХ)) белка ТБГ1 гордеивируса выявлены два кластера положительно заряженных аминокислотных остатков, ответственных за некооперативное связывание с РНК и дальний транспорт вирусной инфекции. Данные, полученные на помовирусе скручивания верхушек картофеля (ВСВК), акже свидетельствуют важной роли домена ЫТО белка ТБГ1 ВСВК в дальнем транспорте для вирусов с ТБГ гордеивирусного типа: делеция значительной части N11) сопровождалась блокированием дальнего, но не ближнего (межклеточного) транспорта вирусакроме того, было показано, что ЫТВ отвечает за локализацию белка ТБГ1 ВСВК в ядре/ядрышке растительной клетки.

Модели транспорта гордеивирусов и помовирусов во многом сходны, в связи с чем, цель данной работы состояла в выявлении предполагаемой локализации белка ТБГ1 ПЛВМ в ядре/ядрышке клеток растений табака Шсойапа ЬеШкат’шпа и изучении взаимодействия между белком ТБГ1 и основными белками ядрышка и телец Кахаля (ТК), субъядерной структуры, физически и функционально связанной с ядрышком.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

БАР1 4', 6-диамидино-2-фенилиндол.

ОАК глицин-аргинин богатый домен.

СЕР зеленый флуоресцирующий белок.

ОБТ глутатион-Б-трансфераза.

НЕЬО хеликазный/НТФазный домен.

1РТС (ИПТГ) изопропил-1 -тио-Р-Б-галактозид тИФ мономерный красный флуоресцирующий белок.

ЫЕБ сигнал ядерного экспорта.

— НТА Ыг' нитрилотриацетатная агароза.

N1,8 сигнал ядерной локализации.

Ь8 сигнал ядрышковой локализации.

ЫРС комплекс ядерной поры.

N10 М-концевой домен.

БУЕР разделенный желтый флуоресцирующий белок.

БиФК бимолекулярная флуоресцентная комплементация.

БСА бычий сывороточный альбумин.

ВКПЛ вирус кольцевой пятнистости лихниса.

ВЛБДК вирус латентной бледности душистого колоска.

ВНПЖС вирус некротического пожелтения жилок свеклы вом вирус огуречной мозаики.

ВРА вирус розетчатости арахиса вРНП вирусный рибонуклеопротеид.

ВСВК вирус курчавости верхушек картофеля.

ВШМЯ вирус штриховатой мозаики ячменя дсн додецилсульфат натрия дцРНК двучепочечная РНК мякРНК малые ядрышковые РНК мяРНК малые ядерные РНК.

НТФ Нуклеозидтрифосфат нц Нитроцеллюлоза.

ОРТ открытая рамка трансляции оцРНК одноцепочечная РНК.

ПААГ полиакриламидный гель.

ПЛВМ полу латентный вирус мятлика.

ПМСФ Фенилметансульфонилфторид пре-рРНК предшественник рибосомальной РНК.

ПТУГ посттранскрипционное умолкание генов.

ПЦР полимеразная цепная реакция сгРНК субгеномная РНК.

ТБ транспортный белок.

ТБГ тройной блок генов.

ТК тельце Кахаля.

ХВК Х-вирус картофеля.

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

1. Показано, что транспортный белок ТБГ1 гордеивируса полулатентного вируса мятлика, слитый с зеленым флуоресцентным белком, способен локализоваться в ядрышке эпидермальных клеток N. benthamiana при индивидуальной экспрессии (в отсутствии других вирусных белков).

2. Показано, что сигналы, необходимые для локализации белка ТБГ1 в ядре и ядрышке, картируются в составе неупорядоченного N-концевого домена (NTD) в пределах кластера, А 116KSKRKKKNKK125 и кластера В 175KKATKKESKKQTK187, соответственно.

3. Выявлено, что рекомбинантный белок ТБГ1 ПЛВМ взаимодействует in vitro с белком ядрышка фибрилларином (AtFib2 из Arabidopsis thaliana) и белком телец Кахаля коилином (Atcoilin из Arabidopsis thaliana). С глицин-аргинин-богатым (GAR) доменом фибрилларина связывается участок домена NTD, включающий первые 82 аминокислотных остатка белка ТБГ1. С молекулой коилина взаимодействует кластер, А домена NTD.

4. Взаимодействия между вирусным белком и белками ядрышка (белок ТБГ1 и фибрилларин) и (белок ТБГ1 и коилин) подтверждены опытами in vivo при ко-экспрессии в растениях N. benthamiana белка ТБГ1 или его делеционных мутантов и каждого из ядерных белков, слитых соответственно с различными половинами желтого флуоресцентного белка. Комплексы фибрилларин-белок ТБГ1 локализуются в ядрышках, тельцах Кахаля и включениях в цитоплазме эпидермальных клеток. Комплексы коилин-белок ТБГ1 локализуются в ядрышках и во включениях в нуклеоплазме.

Показать весь текст

Список литературы

Agranovsky A.A., Karasev A.V., Novikov V.K., Lunina N.A., Loginov S., Tyulkina L.G. Poa semilatent virus, a hordeivirus having no internal polydisperse poly (A) in the 3' non-coding region of the UNA genome// J Gen Virol. 1992, v. 73 (Pt 8), 2085−92.
Ahmad Y., Boisvert F.M., Gregor P., Cobley A., Lamond A.I. NOPdb: Nucleolar Proteome Database-2008 update// Nucleic Acids Res. 2009, v. 37, Database issue, p. D181−4.
Anandalakshmi R., Pruss G.J., Ge X., Marathe R., Mallory A.C., Smith T.H., Vance V.B. A viral suppressor of gene silencing in plants// Proc Natl Acad Sci USA. 1998, v. 95, 22, p. 13 079−84.
Andersen J.S., Lam Y.W., Leung A.K., Ong S.E., Lyon C.E., Lamond A.I., Mann M. Nucleolar proteome dynamics// Nature. 2005, v. 433, 7021, p. 77−83.
Andersen J.S., Lyon C.E., Fox A.H., Leung A.K., Lam Y.W., Steen H., Mann M., Lamond A.I. Directed proteomic analysis of the human nucleolus// Curr Biol. 2002, v. 12, l, p. 1−11.
Bailey-Serres J., Sorenson R., Juntawong P. Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complexes//Trends Plant Sci. 2009, v. 14, 8, p. 443−53.
Barneche F., Steinmetz F., Echeverria M. Fibrillarin genes encode both a conserved nucleolar protein and a novel small nucleolar RNA involved in ribosomal RNA methylation in Arabidopsis thaliana// J Biol Chem. 2000, v. 275, 35, p. 27 212−20.
Baunoch D.A., Das P., Browning M.E., Hari V. A temporal study of the expression of the capsid, cytoplasmic inclusion and nuclear inclusion proteins of tobacco etch potyvirus in infected plants//J Gen Virol. 1991, v. 72 (Pt 3), 487−92.
Boisvert F.M., van Koningsbruggen S., Navascues J., Lamond A.I. The multifunctional nucleolus// Nat Rev Mol Cell Biol. 2007, v. 8, 7, p. 574−85.
Boulon S., Westman B.J., Hutten S., Boisvert F.M., Lamond A.I. The nucleolus under stress// Mol Cell. 2010, v: 40, 2, p. 216−27.
Bragg J.N. L.H.S., Jackson A.O. Hordeiviruses. Encyclopedia of Virology. 3rd ed, ed. B Mahy, Mvan Regenmortel.// Oxford: Elsevier Ltd., 2008, v. 2, 459−67.
Brakke M.K., and Langenberg, W. G. Experience with Soil-borne Wheat Mosaic Virus in North America and Elsewhere.// Association of Applied Biologists, New York., 1988, v.
Brigneti G., Voinnet O., Li W.X., Ji L.H., Ding S.W., Baulcombe D.C. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana// EMBO J. 1998, v. 17, 22, p. 6739−46.
Brown J.W., Shaw P.J. Small nucleolar RNAs and pre-rRNA processing in plants// Plant Cell. 1998, v. 10, 5, p. 649−57.
Bureau M., Leh V., Haas M., Geldreich A., Ryabova L., Yot P., Keller M. P6 protein of Cauliflower mosaic virus, a translation reinitiator, interacts with ribosomal protein L13 from Arabidopsis thalianaIIJ Gen Virol. 2004, v. 85, Pt 12, p. 3765−75.
Canetta E., Kim S.H., Kalinina N.O., Shaw J., Adya A.K., Gillespie T., Brown J.W., Taliansky M. A plant virus movement protein forms ringlike complexes with the major nucleolar protein, fibrillarin, in vitro// J Mol Biol. 2008, v. 376, 4, p. 932−7.
Carmo-Fonseca M., Mendes-Soares L., Campos I. To be or not to be in the nucleolus// Nat Cell Biol. 2000, v. 2, 6, p. E107−12.
Carrero Z.I., Velma V., Douglas H-E., Hebert M.D. Coilin phosphomutants disrupt Cajal body formation, reduce cell proliferation and produce a distinct coilin degradation product//PLoS One. 2011, v. 6, 10, p. e25743.
Carrington J.C. RNA silencing. Moving targets// Nature. 2000, v. 408, 6809, p. 150−1.
Chang B.Y., Lin N.S., Liou D.Y., Chen J.P., Liou G.G., Hsu Y.H. Subcellular localization of the 28 kDa protein of the triple-gene-block of bamboo mosaic potexvirus// J Gen Virol. 1997, v. 78 (Pt 5), 1175−9.
Chook Y.M., Blobel G. Karyopherins and nuclear import// Curr Opin Struct Biol. 2001, v. 11, 6, p. 703−15.
Chu M., Lopez-Moya J.J., Llave-Correas C., Pirone T.P. Two separate regions in the genome of the tobacco etch virus contain determinants of the wilting response of Tabasco pepper//Mol Plant Microbe.Interact. 1997, v. 10, 4, p. 472−80.
Cioce M., Lamond A.I. Cajal bodies: a long history of discovery// Annu Rev Cell Dev Biol. 2005, v. 21, 105−31.
Collier S., Pendle A., Boudonck K., van Rij T., Dolan L., Shaw P. A distant coilin homologue is required for the formation of cajal bodies in Arabidopsis// Mol Biol Cell. 2006, v. 17, 7, p. 2942−51.
Conti E., Kuriyan J. Crystallographic analysis of the specific yet versatile recognition of distinct nuclear localization signals by karyopherin alpha// Structure. 2000, v. 8, 3, p. 329−38.26

Заполнить форму текущей работой