Получение, характеристика и биотехнологические аспекты применения поли-и моноклональных антител к антигенам Vibrio cholerae О1 Инаба и Огава

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Продолжающаяся более 40 лет седьмая пандемия холеры наносит серьезный социально-экономический ущерб многим странам мира, включая Россию (97, 105, 109, 111, 147, 169). Более того, прогноз по этой инфекции на ближайший период остается неблагоприятным в России и других странах СНГ в связи с реальной возможностью ее завоза из-за рубежа, ростом миграционной активности населения, связанной с туризмом, развитием рыночной экономики, увеличением трансграничных перевозок, а также участившихся случаев межнациональных конфликтов, стихийных бедствий, техногенных катастроф и террористических актов (98, 103, 105,112).

Возбудителями этой опасной инфекции являются токсигенные штаммы Vibrio cholerae Ol и 0139 серогрупп, последние из которых были обнаружены в начале 90-х гг. прошлого века в Индии и Бангладеш (162,163, 164, 227, 253). Однако, в настоящее время на эндемичных территориях эпидемиологическая ситуация характеризуется преобладанием заболеваний холерой, связанной с V. cholerae Ol (20, 37,96,169,188).

Средства вакцинопрофилактики и методы диагностики этой инфекции продолжают совершенствоваться. В последние годы разработан ряд современных высокоэффективных холерных коммерческих (45) и экспериментальных (30, 37, 38, 45, 91, 99, 113, 114, 147, 217, 234, 240) генодиагностических тест-систем и иммунодиагностических препаратов (1,2, 10, 72,279). Вместе с тем, коммерческие диагностические сыворотки для реакции агглютинации остаются по-прежнему востребованными практическими специалистами, в том числе, для контроля синтеза основных иммуногенов, входящих в состав холерной бивалентной химической таблетированной вакцины. Однако биотехнологические особенности их приготовления обуславливают все присущие поликлональным адсорбированным сывороткам недостатки, в первую очередь связанные с нестандартностью серий, значительным количеством фоновых неспецифических реакций, низкой активностью после проведения адсорбции и др.

Одним из путей улучшения качества таких препаратов, как и совершенствования технологии приготовления специфических иммунореагентов в целом, является разработка биотехнологических приемов получения поликлональных моноспецифических антител, менее гетерогенных по классу, подклассу, специфичности, титру и аффинности иммуноглобулинов по сравнению с адсорбированными сыворотками, путем иммунизации биопродуцентов химически изолированными антигенами (2, 141, 142, 172, 230). Среди известных в настоящее время антигенов наиболее перспективными с позиций специфичности представляются препараты липополисахарида (ЛПС), на вариабельности О-боковых цепей которого основана внутрии межвидовая классификация большинства грамотрицательных бактерий, в том числе возбудителя холеры (85, 254, 286, 265), что подтверждено и генетическими исследованиями (244). В то же время неясно — являются ли серологически идентичными субстанциями химически выделенные и термостабильные О-антигены V. cholerae Инаба и Огава, какие структурные компоненты последних обеспечивают кросс-реактивность гомологичных антител и вовлечены в дифференциацию холерных вибрионов на отдельные серотипы в иммуносерологических тестах, в том числе, реакции агглютинации. Вышеизложенное диктует необходимость более глубокого изучения антигенной структуры и иммунохимических свойств серотипоспецифических антигенов представителей V. cholerae 01 серогруппы на молекулярном уровне, что невозможно без применения в качестве тонкого инструмента панели разноэпитопных моноклональных антител (МКА), обладающих высокой активностью, строгой специфичностью и стандартностью (9, 13, 78, 102, 159, 202, 209, 214, 221, 280), в совокупности с современными методами иммунной биотехнологии, иммунодиагностики, молекулярной иммунологии и иммуноанализа (13, 14, 35, 78, 118, 136). Более того, применение гибридомной биотехнологии и технологии получения мышиных поликлональных моноспецифических антител, стандартность которых обеспечивается использованием в качестве биопродуцентов инбредных мышей определенного генотипа, снизит затраты, связанные с основными этапами производства профилактических и диагностических препаратов против холеры.

В РосНИПЧИ «Микроб» налажено производство холерной бивалентной химической таблетированной вакцины, одним из важных компонентов которой является О-антиген (42, 58, 59, 60). Однако контроль его биосинтеза и содержания в процессе производства осуществляется малочувствительными по современным представлениям методами — реакцией иммунодиффузии (РИД) (248) и реакцией непрямой гемагглютинации (РНГА) (76), не позволяющими в динамике определить уровень продукции этой антигенной субстанции, и, что очень важно, подтвердить сохранение эпитопной специфичности О-антигена в процессе производства и контроля активности холерной бивалентной химической таблетированной вакцины. Эту задачу можно решить с помощью технически простых, но высокочувствительных вариантов ТИФА с использованием МКА.

Вышеизложенное определило цель и основные задачи настоящей работы.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ — разработка биотехнологических аспектов получения полии моноклональных антител к специфическим антигенам V. cholerae 01 серотипов Инаба и Огава и конструирование на их основе современных высокочувствительных вариантов ТИФА для контроля биосинтеза О-антигена на основных стадиях производства холерной бивалентной химической таблетированной вакцины.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Провести сравнительное изучение иммунохимических свойств диагностических агглютинирующих адсорбированных холерных сывороток Инаба и Огава, применяемых при серотипировании возбудителя холеры в реакции агглютинации, с использованием современных методов иммуноанализа для идентификации конкретных антигенных субстанций холерных вибрионов и термостабильных О-антигенов, обеспечивающих специфичность и кросс-реактивность указанных реагентов.

2. Разработать технологию получения препаративных количеств поликлональных моноспецифических антител с применением химически выделенных препаратов ЛПС V. cholerae 01 серотипов Инаба и Огава, пригодных для последующего конструирования на их основе экспериментальных иммуноглобулиновых тест-систем.

3. С помощью гибридомной биотехнологии получить стабильные антителопродуцирующие гибридные клеточные линии, синтезирующие MICA к отдельным эпитопам антигенов, ответственных за дифференциацию штаммов V. cholerae Ol на серотипы Инаба и Огава в иммуносерологических тестах.

4. Провести сравнительное исследование иммунохимических свойств препаратов химически выделенных и термостабильных О-антигенов V. cholerae 01 с использованием полии моноклональных антител.

5. На основе полученных полии моноклональных антител разработать варианты ТИФА, в том числе его дот-вариант, перспективные для применения в качестве современных высокочувствительных стандартных методов контроля биосинтеза О-антигена на основных стадиях производства холерной бивалентной химической таблетированной вакцины и провести сравнение их эффективности с регламентированными методами.

6. С помощью сконструированных в настоящем исследовании иммуноглобулиновых тест-систем провести изучение динамики синтеза О-антигена и ассоциированных с ним отдельных эпитопов на этапах глубинного культивирования производственных штаммов холерного вибриона 569 В и М-41, а также других стадиях приготовления холерной бивалентной химической таблетированной вакцины.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Получены стабильные линии гибридом, синтезирующие MICA к специфическим эпитопам V. cholerae 01 Инаба и Огава. С использованием оригинальной панели полии моноклональных антител впервые определена локализация и структура отдельных иммунореактивных компонентов препаратов химически выделенных и термостабильных О-антигенов V. cholerae 01 серотипов Инаба и Огава, выявлены конкретные антигенные детерминанты, определяющие серологическую дифференциацию вибрионов Ol серо группы на указанные серотипы. Изучены особенности антигенной композиции препаратов термостабильных О-антигенов V. cholerae Ol с выявлением специфических и кросс-реактивных компонентов. Впервые разработаны высокочувствительные иммунологические методы контроля, позволяющие в динамике на ранних этапах аппаратного культивирования производственных штаммов холерного вибриона количественно проводить оценку продукции О-антигена, а также осуществлять контроль качества конечного продукта холерной бивалентной химической таблетированной вакцины. Использование иммуноферментных тест-систем на основе разноэпитопных МКА впервые дало возможность осуществить мониторинг за синтезом О-антигена в процессе масштабируемого культивирования производственных штаммов V. cholerae 569 В и М-41 на уровне индивидуального эпитопа.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ состоит в создании на основе поликлональных антител к препаратам О-антигенов V. cholerae 01 Инаба и Огава и разноэпитопных МКА экспериментальной иммуноферментной тест-системы для быстрого и эффективного контроля в ТИФА и ДИА продукции О-антигенов на основных этапах приготовления холерной бивалентной химической таблетированной вакцины.

Разработанные экспериментальные иммуноферментные тест-системы апробированы в технологической линии производства холерной бивалентной химической таблетированной вакцины и находятся на стадии внедрения с оформлением изменений в соответствующую нормативную документацию.

По материалам диссертационного исследования составлены «Методические рекомендации по определению в дот-иммуноанализе содержания липополисахарида Vibrio cholerae 01 серогруппы на этапах экспериментального производства химической холерной вакцины», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 5 от 20 июня 1997 г.), утвержденные директором института.

Материалы диссертационного исследования используются при чтении лекций по общей микробиологии и лабораторной диагностике инфекционных болезней на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии, иммунологии и эпидемиологии при РосНИПЧИ «Микроб».

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Кросс-реактивность и относительно низкая специфичность диагностических холерных адсорбированных сывороток связана с их гетерогенностью и присутствием антител к белкам наружной мембраны с м.м. 30±2 — 93±2 кДа, общих для холерных вибрионов 01 серогруппы серотипов Инаба и Огава биоваров классического и Эль Тор.

2. Препараты химически выделенных и полученных кипячением термостабильных О-антигенов не являются идентичными антигенными субстанциями за счет принципиальной разницы в структурной композиции составляющих их полипептидных и углеводных компонентов.

3. Применение в качестве иммунизирующего агента выделенных регламентированными методами О-антигенов V. cholerae Ol серотипов Инаба и Огава обеспечивает выработку у инбредных мышей линии BALB/c поликлональных моноспецифических антител в высоких титрах, превосходящих по специфичности и активности коммерческие диагностические холерные адсорбированные сыворотки.

4. Разработаны и оптимизированы основные биотехнологические аспекты получения препаративных количеств мышиных полии моноклональных типоспецифических антител, перспективных для конструирования на их основе современных высокочувствительных иммуноферментных тест-систем для выявления О-антигена — не менее 0,01−0,15 мг/мл в полуфабрикате независимо от модификации иммуноанализа, 0,06−0,25 мг/мл (в ДИА) и 0,3−0,5 мкг/мл (в ТИФА) в готовой лекарственной форме, соответственно.

5. Экспериментальные иммуноферментные тест-системы на основе мышиных полии моноклональных антител дают возможность более эффективно, чем регламентированные методы контроля (РИД и РИГА с холерной адсорбированной О-сывороткой) определять содержание и активность О-антигена на всех основных стадиях производства и приготовления холерной бивалентной химической таблетированной вакцины, что указывает на перспективу их применения в качестве современных высокочувствительных методов контроля биосинтеза данного антигена и позволит снизить себестоимость выпускаемой продукции за счет большей рентабельности и технологичности процесса приготовления указанных тест-систем.

6. Созданные моноклональные типоспецифические иммуноферментные тест-системы пригодны для мониторинга за активностью и экспрессией основных протективных эпитопов О-антигена, одного из компонентов выпускаемого в РосНИПЧИ «Микроб» профилактического препарата против холеры, с целью повышения его содержания в готовой лекарственной форме и, следовательно, улучшения качества холерной бивалентной химической таблетированной вакцины.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертационной работы были представлены на:

Международной конференции Академии Естествознания «Гомеостаз и инфекционный процесс», Саратов, 1996;

4-ой Международной конференции молодых ученых и студентов, Бишкек, Кыргызстан, 1997;

Научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России, Саратов, 1997;

Юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии Минобороны России, Киров, 1998;

Второй Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс», Саратов, 1998;

Совещании проблемной комиссии по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ «Холера и патогенные для человека вибрионы», Ростов-на-Дону, 2002;

VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера», Ростов-на-Дону, 2003;

4-ой межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней», Саратов, 2003;

Итоговых научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов, 2003,.

2004;

VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях», Волгоград, 2005.

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и списка литературы, включающего 289 источников, из них зарубежных — 133. Объем диссертации составляет 156 страниц машинописного текста, включая 13 таблиц и 17 рисунков.

выводы.

1. Установлено, что диагностические холерные типоспецифические адсорбированные сыворотки гетерогенны по специфичности и содержат антитела.

1 к нескольким антигенам с м.м. 30±2 — 93±2 кДа преимущественно белковой щ природы, общим для холерных вибрионов независимо от серотипоили биоваропринадлежности. Это обеспечивает относительно низкую специфичность этих сывороток в современных иммуносерологических тестах.

2. Разработаны новые технологические приемы получения препаративных количеств высокоактивных типоспецифических холерных поликлональных моноспецифических антител, не требующих адсорбции клетками гетерологичных микроорганизмов, основанные на сочетанном применении в качестве иммуногенов препаратов О-антигенов, химически выделенных из производственных штаммов V. cholerae 569 В Инаба и М-41 Огава, и инбредных мышей линии BALB/c как продуцентов иммуноасцитической жидкости, превосходящей по содержанию специфических иммуноглобулинов адсорбированные лошадиные холерные сыворотки в 7,3−22,6 раза.

3. С использованием диагностических холерных адсорбированных сывороток и мышиных поликлональных моноспецифических антител к химически выделенным О-антигенам Инаба и Огава продемонстрированы иммунохимические различия в структуре и антигенной специфичности последних и препаратов термостабильных О-антигенов, полученных регламентированным методом путем 2-часового кипячения взвеси референтных штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы.

4. Генерирована панель из 15 гибридом, стабильно продуцирующих MICA in vivo и in vitro к различным иммунореактивным эпитопам компонентов наружной мембраны холерных вибрионов 01 серогруппы, в том числе, трем типоспецифическим (двум Инаба и одному Огава) и общему для обоих серотипов. С помощью иммунохимического анализа изучены основные свойства комплементарных им лигандов, природа, особенности конформации и молекулярной организации эпитопов, ответственных за серологическую дифференциацию штаммов V. cholerae на серотипы Инаба и Огава.

5. На основе полученных полии моноклональных антител сконструированы и успешно апробированы на основных стадиях производства холерной бивалентной химической таблетированной вакцины экспериментальные иммуноферментные иммуноглобулиновые тест-системы, позволяющие исследовать содержание и активность О-антигена и основных специфических для вибрионов 01 Инаба и Огава иммунореактивных эпитопов при глубинном культивировании производственных штаммов 569 В и М-41 в полуфабрикатах и готовой лекарственной форме даже при относительно низкой концентрации анализируемых субстанций в образцах и неэффективности регламентированных способов их определения (РИД и РИГА с адсорбированной О-сывороткой).

6. Оптимальными вариантами выявления О-антигена являются непрямые модификации ТИФА в 96-луночных планшетах и ДИА на НЦМ, регистрирующие в сухих фракциях холерной бивалентной химической таблетированной вакцины 0,01−0,15 мг/мл гомологичного антигена, а в готовой лекарственной форме — 0,060,25 мг/мл (в ДИА) и 0,3−0,5 мкг/мл (в ТИФА) независимо от наличия кислотоустойчивого покрытия.

7. Экспериментально доказаны преимущества применения разработанных вариантов ТИФА, включая ДИА, на основе мышиных моноспецифических антител к препаратам химически выделенных типоспецифических О-антигенов V. cholerae Ol в качестве современных высокочувствительных методов контроля их биосинтеза при производстве бивалентной химической холерной таблетированной вакцины за счет большей рентабельности и технологичности процесса приготовления экспериментальных иммуноглобулиновых тест-систем.

8. Внедрение разработанных экспериментальных иммуноферментных тест-систем в производство бивалентной химической холерной таблетированной вакцины позволит управлять качеством как полуфабрикатов на этапах приготовления препарата, так и его готовой лекарственной формы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Одним из способов предупреждения эпидемических вспышек холеры является совершенствование вакцинопрофилактики и методов диагностики этой инфекции. В РосНИПЧИ «Микроб» производится холерная бивалентная химическая таблетированная вакцина, основу которой составляют протективные антигены холерного вибриона, в частности, О-антиген (40,58,60). Контроль его биосинтеза и содержания в процессе производства осуществляется малочувствительными по современным представлениям методами (реакцией иммунодиффузии (248) и реакцией непрямой гемагглютинации (76) с использованием диагностических холерных адсорбированных сывороток для реакции агглютинации (122). Однако биотехнологические особенности приготовления последних обеспечивают все присущие поликлональным адсорбированным реагентам недостатки, в первую очередь, связанные с нестандартностью серий, значительным количеством фоновых неспецифических реакций, низкой активностью после проведения адсорбции и др. Более того, указанные препараты получены путем иммунизации аутбредных биомоделей (лошадей) убитыми кипячением клетками холерных вибрионов и предназначены для идентификации и серотипирования штаммов V. cholerae 01 серогруппы, а не химически выделенного О-антигена (122). Это не позволяет в динамике определить уровень продукции данной антигенной субстанции и подтвердить сохранение эпитопной специфичности О-антигена в процессе производства и контроля активности холерной бивалентной химической таблетированной вакцины в отличие от XT, для характеристики биосинтеза которого используется гомологичная антитоксическая сыворотка (122, 123). Альтернативным подходом является разработка биотехнологических аспектов получения гомологичных поликлональных моноспецифических антител, менее гетерогенных по классу, подклассу, специфичности, титру и аффинности иммуноглобулинов путем иммунизации биопродуцентов препаратами соответствующих химически выделенных антигенов (2, 141, 142, 172, 230) или генерирование стабильных гибридных клонов — продуцентов МКА.

Вышеизложенное послужило основанием для проведения настоящего исследования, целью которого явилось конструирование с использованием панели полии моноклональных антител к О-антигену V. cholerae Ol различных вариантов ТИФА для контроля его биосинтеза на основных этапах производства холерной бивалентной химической таблетированной вакцины.

Очевидно, что создание новых экспериментальных тест-систем или усовершенствование существующих методов контроля невозможно без четкого представления об иммунореактивных структурах холерных вибрионов в целом, идентификации и характеристики антигенов, ответственных за дифференциацию бактерий V. cholerae 01 на основные серотипы, а также выявления перекрестно-реагирующих с другими микроорганизмами антигенных субстанций. До настоящего времени оставался неясным вопрос — являются ли химически изолированные и термостабильные О-антигены V. cholerae Ol Инаба и Огава серологически идентичными или это принципиально различные субстанции, а также какие структурные компоненты последних обеспечивают кросс-реактивность гомологичных антител и типоспецифичность холерных вибрионов. В литературе имелись данные разных исследователей об обнаружении у холерных вибрионов Ol типоспецифических эпитопов на О-специфических полисахаридах химически выделенных препаратов ЛПС, белках наружной мембраны, термостабильных и термолабильных полипептидных и углеводных субстанциях (231, 279). В связи с этим, приоритетным явилось более глубокое изучение антигенной структуры и иммунохимических свойств серотипоспецифических антигенов представителей V. cholerae Ol серогруппы на молекулярном уровне с применением в качестве тонкого инструмента панели разноэпитопных МКА, обладающих высокой активностью, строгой специфичностью и стандартностью (9, 13, 78, 102, 159,202,209, 213,221,280), в совокупности с современными методами иммунной биотехнологии, иммунодиагностики, молекулярной иммунологии и иммуноанализа (35).

Поэтому предварительно было проведено сравнительное исследование специфичности диагностических холерных агглютинирующих сывороток Инаба и Огава и экспериментальных моноспецифических сывороток к препаратам О-антигена обоих серотипов с использованы современных иммунохимических методов иммуноанализа—ТИФА, ДИА и иммуноблота (35,125,138, 145).

Оказалось, что коммерческие холерные сыворотки обладали низкой специфической активностью в ТИФА и реагировали с клетками вибрионов штаммов гомологичных серотипов обоих биоваров. При этом сыворотка Огава содержала большее количество иммунореактивных антител, почти в 8 раз превышающее таковое в сыворотке Инаба. В то же время взаимодействие с клетками V. cholerae 01 серогруппы гомологичных серотипов регистрировалось в значительно больших титрах, чем с вибрионами гетерологичного серотипа независимо от биоваропринадлежности использованных в работе штаммов бактерий. Эти данные указывали на принципиальную возможность применения диагностических холерных сывороток в ТИФА, более чувствительном иммуносерологическом методе по сравнению с РА (14, 125). Отличительной особенностью коммерческой О-сыворотки явилась способность взаимодействовать с вибрионами обоих серотипов и биоваров практически в сходных титрах. Аналогичные результаты были получены при постановке ДИА с использованием взвесей убитых цельных клеток V. cholerae OI, 0139 и не 01 серогрупп.

Для выявления конкретных антигенных иммунореактивных структур холерных вибрионов OI, обеспечивающих взаимодействие сывороточных антител диагностических холерных сывороток после адсорбции, был использован метод иммуноблота, где в качестве лигандов использовали нативные цельноклеточные лизаты штаммов холерного вибриона серотипов Инаба и Огава обоих биоваров, предварительно фракционированные в ПААГ-SDS (225) и перенесенные на НЦМ. В результате исследований было установлено, что холерные адсорбированные типоспецифические сыворотки гетерогенны по специфичности и содержат, подобно другим поликлональным реагентам (13), антитела к нескольким антигенам, в том числе, термостабильным, преимущественно белковой и/или гликопептидной природы, обнаруживающимся в профилях холерных вибрионов независимо от серотипоили биоваропринадлежности, т. е. являющихся «общими» для указанных бактерий. Очевидно, что присутствие антител к последним обеспечивает кросс-реактивность поликлональных адсорбированных сывороток. Для подтверждения полученных данных проводили сравнительный анализ в ПААГ-SDS по методу U. Laemmli (225) препаратов термостабильных О-антигенов референтных штаммов V. cholerae 01, приготовленных регламентированными методами и используемыми согласно биотехнологическому процессу для иммунизации лошадей — биопродуцентов биологического сырья для приготовления диагностических холерных сывороток (120). На электрофореграмме, окрашенной для проявления белковых реплик, во всех трех препаратах О-антигенов, используемых для иммунизации лошадей, были обнаружены как общие, так и специфические антигены белковой природы.

На следующем этапе были получены поликлональные моноспецифические сыворотки к препаратам выделенного насыщенным раствором сульфата аммония О-антигена V. cholerae ОХ серотипов Инаба и Огава (58), компонентов холерной бивалентной химической таблетированной вакцины. В качестве биомоделей использовали генетически однородных мышей инбредной линии BALB/c, которые характеризуются минимальной вариабельностью иммунного ответа на антигенное воздействие, обеспечивая тем самым высокую воспроизводимость результатов иммунизации (16, 22, 39, 141). Варьируя дозы антигена, кратность прививок и интервал между ними, нам удалось получить поликлональные мышиные антитела к каждому из указанных препаратов О-антигенов, вступающие в реакцию с гомологичными антигенами в ТИФА в титрах, в 16,8 — 134,4 раза превышающих таковые у диагностических холерных адсорбированных типоспецифических сывороток. При изучении иммунологической реактивности экспериментальных мышиных сывороток оказалось, что они в высоком титре реагировали с гомологичными препаратами О-антигенов и в очень низком титре (практически на уровне отрицательного контроля) вступали в перекрестные реакции с гетерологичными антигенами, что может быть связано с клональной гетерогенностью мышиных сывороточных иммуноглобулинов и демаскировкой кросс-реактивных эпитопов кора и/или липида, А углеводных компонентов О-антигенов (85, 86, 87,156).

Используя поликлональные сыворотки, даже моноспецифические, т. е. содержащие антитела к одному антигену (13), невозможно проводить тонкие исследования эпитопного строения антигенов, поэтому изучение продукции серотипоспецифических эпитопов V. cholerae 01 проводили с помощью современных методов гибридомной биотехнологии, позволяющей генерировать идентичные молекулы антител, продуцируемых одним гибридным клоном и способных избирательно реагировать с конкретным эпитопом комплементарного антигена (13, 102, 118, 125). Более того, применение МКА позволяет изучать особенности биосинтеза соответствующей антигенной субстанции на уровне индивидуального эпитопа для более полной характеристики и подтверждения сохранения серологической специфичности, молекулярной организации и нативной конфигурации протективных и диагностически значимых детерминант в процессе культивирования штаммов бактерий (35). Поэтому следующим этапом настоящей работы стало получение панели МКА к иммунореактивным видои типоспецифическим эпитопам холерных вибрионов Ol серогруппы с учетом ранее полученных данных о корреляции протективных и специфических свойств химически выделенных препаратов О-антигенов Инаба и Огава.

В результате проведенной гибридизации спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных убитыми цельными клетками производственных штаммов V. cholerae Ol, и клеток сингенной миеломной линии Sp. 2/0-Ag.8 были получены 18 клонов гибридом, три из которых не были способны к культивированию in vivo и потеряли опухолеродность после первого пассажа. Из оставшихся 15 клонов были отобраны четыре, обладавшие наилучшими показателями опухолеродности in vivo и необходимой для решения задач настоящего исследования эпитопной специфичностью. Так, МКА двух из них были направлены к специфическим детерминантам Инаба, одно — Огава и последнее узнавало общий для обоих серотипов эпитоп.

Антителопродуцирующую способность этих гибридом оценивали в ТИФА и ДИА. Оказалось, что все клоны стабильно синтезировали МКА в достаточно высоком титре вплоть до четвертого пассажа (срок наблюдения). При этом, у большинства клонов титр специфических антител в асцитических жидкостях мышей несколько снижался ко второму пассажу, видимо, из-за наличия в пуле инокулированных клеток определенного количества гибридом, потерявших опухолеродность в результате длительного пассирования in vitro в процессе получения, селекции, клонирования и наращивания клеточных линий, а у клонов A86G3, В85В2 и Вю5В2 даже увеличивался к IV пассажу, видимо, за счет селекции в организме биомоделей клеток гибридом с повышенной опухолеродностью. При изучении природы антигенных детерминант, узнаваемых генерированными МКА в.

ДИА удалось установить, что два МКА, A26G3 и В85В2, утрачивали способность взаимодействовать с бактериальными клетками после их протеолиза, что указывает на полипептидную или гликопептидную природу узнаваемых ими антигенных детерминант. Два других МКА, A86G3 и Вю5В2, сохранили способность реагировать с клеточными лизатами после их депротеинизации и, следовательно, были направлены к более сложно организованному эпитопу гликопептидной или углеводной природы.

Для подтверждения и уточнения этих результатов иммунореактивность МКА клонов A26G3, A86G3, В85В2 и Bj05B2 изучали другим, более тонким современным методом молекулярной биотехнологии — иммуноблотом. При этом, удалось установить, что МКА A26G3 (реагировало с клетками серотипа Инаба) узнавало конформационный эпитоп, в образовании которого участвовали антигены белковой и углеводной природы. МКА A86G3 было комплементарно другому специфическому для серотипа Инаба эпитопу, имеющему углеводную природу. МКА Вю5В2 (специфично для серотипа Огава) выявляло детерминанту гликопептидной природы, в организации которого участвовали как термостабильные, так и термолабильные компоненты, в том числе, О-антигена. Также удалось установить белковую природу эпитопа, узнаваемого МКА В85В2 (направлено к общей для Инаба и Огава детерминанте), что согласуется с данными других исследователей о продукции холерными вибрионами 01 серогруппы видоспецифических или общих для серотипов Инаба и Огава антигенных детерминант белковой природы (9,213).

Уникальные свойства полученных нами полии моноклональных антител различной эпитопной направленности предопределили попытку их использования в качестве основы при конструировании экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем для контроля синтеза О-антигена в процессе производства холерной бивалентной химической таблетированной вакцины.

Первоначально изучалась возможность применения ДИА для контроля синтеза О-антигена производственными штаммами V. cholerae 569 В Инаба, КМ-76 Инаба и М-41 Огава при их реакторном выращивании. Присутствие гомологичных антигенов и ассоциированных с ними основных иммунореактивных комплементарных эпитопов определяли в ПБК через 5,6,7, 8,9, 10 и 11 ч от начала выращивания. В эксперименте использовали три серии реакторных проб: необеззараженные (нативные), обеззараженные добавлением до 2% формальдегида и лиофилизированные. На первом этапе ПБК производственных штаммов были изучены в непрямом ДИА с коммерческими диагностическими холерными сыворотками Инаба и Огава, поскольку они используются в регламентированных методах контроля продукции О-антигена (122). При этом удалось установить, что обе сыворотки вступали в перекрестную реакцию с ПБК штаммов гетерологичного серовара, хотя и в меньшем титре. В то же время их применение в ДИА позволило выявлять О-антиген на ранних этапах выращивания производственных штаммов в отличие от РИД, значительно более низкая чувствительность которой дает возможность регистрировать присутствие указанной антигенной субстанции только в самом конце выращивания — в 9−10 — часовой ПБК (40,144).

Выраженный серологический перекрест при использовании в ДИА коммерческих сывороток Инаба и Огава предопределил попытку применения поликлональных мышиных антител к выделенным химическим способом О-антигенам V. cholerae Инаба и Огава. Как показали наши исследования, полученные поликлональные мышиные антитела обладали большей активностью и специфичностью по сравнению с соответствующими коммерческими холерными сыворотками, что позволило на ранних стадиях определять не только присутствие О-антигена в ПБК, но и выявить особенности его биосинтеза на разных стадиях глубинного культивирования каждым из вышеуказанных штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы. Поэтому дальнейшее использование полученных нами антител в ДИА представлялось более перспективным.

При изучении обеззараженных формалином ПБК штаммов V. cholerae 569 В и КМ-76 с поликлональными мышиными антителами к О-антигену Огава и Инаба прослеживались те же закономерности количественного изменения содержания иммуногенов, что и в нативных пробах, взятых в процессе выращивания из биореактора, но специфические титры были значительно ниже, чем нативные, что свидетельствовало о снижении содержания иммунологически активных компонентов в пробах в процессе их обработки формалином и хранения.

Экспериментальное исследование содержания О-антигена в лиофилизованных пробах, взятых через 6 и 10 ч от начала культивирования производственных штаммов 569 В и М-41 и через 6 и 11 ч — штамма V. cholerae КМ-76, О-антиген удалось обнаружить только в 10−11 — часовой ПБК, где, по данным литературы (40, 58, 60, 144) и результатам настоящего исследования, его содержание максимально.

Таким образом, во всех случаях использование ДИА оказалось более эффективным по сравнению с регламентированными методами для определения содержания О-антигена V. cholerae как в нативных почасовых ПБК при глубинном культивировании производственных штаммов, так и при тестировании обеззараженных формалином и лиофилизованных образцов. Очевидно, что внедрение ДИА, обладающего наряду с высокой чувствительностью, специфичностью и экспрессностью такими преимуществами как простота постановки, экономичность, документированность и возможность длительного хранения НЦМ с результатами анализа, будет, несомненно, способствовать совершенствованию технологии производства и повышению качества выпускаемой холерной бивалентной химической таблетированной вакцины.

Несомненный интерес представляла разработка ДИА на основе МКА, способных специфически распознавать основные иммунореактивные видои типоспецифические эпитопы сложноорганизованной молекулы О-антигена V. cholerae 01. Поэтому целью дальнейшего этапа исследований стало изучение возможности динамического наблюдения в ДИА за продукцией отдельных иммунологически активных антигенных детерминант V. cholerae 01 в процессе глубинного культивирования производственных штаммов холерных вибрионов с использованием четырех разноэпитопных МКА.

В ходе проведенных экспериментов оказалось, что все МКА были высокоактивными и пригодными для контроля синтеза основных эпитопов О-антигена V. cholerae 01, позволяя выявлять динамику изменения их концентрации в процессе выращивания производственных штаммов, начиная с 5 ч выращивания. В целом можно отметить, что эпитопы, комплементарые полученным МКА, синтезировались холерными вибрионами серотипа Огава позже, чем серотипа Инаба и имели иные закономерности синтеза. В ДИА все МКА продемонстировали строгую специфичность и высокую активность, несравнимо превышающую по этим и другим параметрам коммерческие диагностические холерные сыворотки.

Полученные данные указывают на перспективы дальнейшего использования полученных нами МКА как потенциальных диагностических реагентов для разработки на их основе современных чувствительных моноклональных иммуноглобулиновых иммуноферментных тест-систем. При этом применение МКА Bg5B2 имеет некоторое преимущество, связанное с возможностью более раннего выявления узнаваемого им эпитопа, динамическое увеличение продукции которого наблюдается в течение всего периода выращивания. Также этот клон продуцировал in vivo МКА в высоких титрах в асцитической жидкости и обладал хорошими пролиферативными свойствами в организме сингенных животных. Поэтому его использовали для более детальной характеристики при дальнейшем пассировании до VII пассажа, а асцитическую жидкость подвергали лиофильному высушиванию для последующего хранения. Этот клон может быть рекомендован как наиболее перспективный при разработке моноклональной иммуноферментной тест-системы, позволяющей осуществлять контроль биосинтеза видоспецифического эпитопа О-антигена V. cholerae 01 в процессе масштабируемого культивирования производственных штаммов холерного вибриона.

В отдельных экспериментах оценивали возможность применения разработанных нами экспериментальных полии моноклональных иммуноферментных тест-систем для проведения ТИФА в 96-луночных планшетах и ДИА с целью определения содержания О-антигена на других важных стадиях производственного процесса приготовления холерной бивалентной химической таблетированной вакцины — в полуфабрикате и готовой лекарственной форме. Проведенные эксперименты подтвердили перспективу использования сконструированных нами вариантов ТИФА и ДИА в качестве методов контроля активности указанного компонента холерной бивалентной химической таблетированной вакцины. Так, независимо от типа носителей оба варианта иммуноанализа за счет высокой чувствительности позволяли выявлять в полуфабрикатах 0,01−0,15 мг/мл иммунореактивной антигенной субстанции, что в пересчете на пробу соответствовало 10−150 нг О-антигена, а в готовой ЛФ — 0,06−0,25 мг/мл (в ДИА) и 0,3−0,5 мкг/мл (в ТИФА) или 30−50 нг в анализируемой пробе независимо от наличия кислотоустойчивого покрытия. Таким образом, сконструированные нами экспериментальные иммуноферментные тест-системы по чувствительности не уступали уровню молекулярных методов диагностики (35). Не менее важные данные были получены при изучении содержания О-антигена в ЛФ, прошедших переконтроль по истечении срока годности. Во-первых, нам удалось зарегистрировать факт снижения активности всех исследуемых препаратов, во-вторых, в отличие от РНГА, определить количественное содержание О-антигена— 0,31−0,63 мг/мл в ДИА на НЦМ и 0,02−0,5 мг/мл в ТИФА в 96-луночных планшетах. Следует отметить, что регламентированный метод контроля, РНГА с диагностическими холерными сыворотками, во всех случаях был малоэффективен для решения поставленной задачи.

При сравнительной характеристике использования в качестве биологического сырья полии моноклональных антител, полученных от линейных инбредных мышей BALB/c, и сывороток лошадей, иммунизированных взвесями кипяченых клеток холерных вибрионов, показаны преимущества применения первых из них ввиду большей экономичности за счет сокращения сроков иммунизации с 3−5 лет до 2−3-х месяцев, соответственно, расходов на содержание животных, потребности небольших доз иммуногенов, отсутствия необходимости использования адсорбентов и, следовательно, масштабированного выращивания соответствующих бактериальных штаммов для проведения адсорбции поликлональных лошадиных сывороток. Полученные моноспецифические или моноклональные ингредиенты могут быть также использованы для конструирования современных высокочувствительных и специфичных иммуноглобулиновых тест-систем таких как ТИФА и его дот-вариант. Как известно, проведение последних требует микрограммовых количеств как основных компонентов диагностической тест-системы, так и анализируемого образца. Следовательно, использование в качестве источника получения препаративных количеств полии моноклональных антител лабораторных инбредных мышей линии BALB/c позволит намного снизить материальные затраты при проведении контроля синтеза протективных антигенов в процессе производства и контроля конечного продукта бивалентной химической холерной таблетированной вакцины за счет большей рентабельности и технологичности процесса приготовления экспериментальных иммуноглобулиновых тест-систем. Внедрение ДИА на основе мышиных моноспецифических антител к препаратам типоспецифических О-антигенов, обладающего наряду с высокой чувствительностью, специфичностью и экспрессностью такими преимуществами как простота постановки, экономичность и документированность за счет возможности длительного хранения НЦМ с результатами анализа без потери окрашивания цветного сигнала, будет, несомненно, способствовать совершенствованию технологии производства и повышению качества выпускаемой холерной бивалентной химической таблетированной вакцины.