Роль гена leg-arista-wing complex в процессе базовой и специфической транскрипции и формировании гонад у Drosophila melanogaster

Актуальность проблемы. Создание и совершенствование мощных технологий, позволяющих детализировать молекулярные процессы, регулирующие развитие, привело к тесному сплетению генетики, клеточной биологии и биологии развития, и многие гены, которые, считалось, выступают в роли регуляторов основных биологических функций клетки (гены домашнего хозяйства), оказалось, обладают специфическими регуляторными функциями в развитии. Поэтому изучение особенностей проявления генов, кодирующих эволюционно консервативные факторы транскрипции, является актуальной проблемой.

Инсерционная мутация leg-arista-wing complex (lawc) дрозофилы, нарушающая правильную экспрессию многих локусов, была обнаружена в 1992 году в лаборатории Т. И. Герасимовой (ИОГен РАН) (Симонова и др, 1992). Район исследуемой инсерции был клонирован и картирован. Позднее в 1999 году в лаборатории Тиджена (Tjan, США) у дрозофилы был открыт ген, гомологичный гену человека и кодирующий фактор базовой транскрипции ТВР related factor 2 (TRF2), который принадлежит к эволюционно консервативному семейству белков ТВР (TATA-box binding protein) (Rabenstein et al., 1999). Однако границы этого гена не были установлены. В первую очередь эти трудности обуславливались отсутствием мутаций, локализованных в этой области. И только к 2003 году, когда полностью расшифровали геном дрозофилы, стало ясно, что клонированная часть последовательности lawc лежит на расстоянии примерно 15 т.п.н. от открытой рамки считывания гена trf2. Открытие и клонирование инсерционной мутации lawif1 сыграло важную роль в установлении границ гена trf2, в частности, района начала его транскрипции (совместная работа лабораторий П. Г. Георгиева, Ю. В. Ильина, Л. И. Корочкина, ИБГ РАН) (Копытова и др., 2005). В результате оказалось, что с одной мРНК trfl могут синтезироваться две изоформы белка (полноразмерная и укороченная), отличающиеся N-концевыми последовательностями. 4.

Район локализации lawc (7Е район цитологической карты X-хромосомы дрозофилы) содержит блок нескольких летальных мутаций разной природы. Поэтому стало актуально изолировать аллели, нарушающие экспрессию конкретных изоформ TRF2.

Некоторые /от ус-мутации вызывают стерильность самок, другие аллели приводят к раннему старению организма. В настоящее время старение предположительно связывают с нарушением самовоспроизведения стволовых клеток в репродуктивной системе. Гаметогенез у дрозофилы исследован очень хорошо. Однако его генетический контроль изучен недостаточно. Например, неизвестно, каким образом происходит выбор ооцита среди шестнадцати клеток цисты, хотя уже ясно, что за его спецификацию отвечает недавно открытая цитоплазматическая структура, возникающая в стволовых клетках полового пути, названная фыосомой. Поэтому изучение генетической регуляции процессов идентификации ооцита и поддержания его статуса, а также самовоспроизведения стволовых герминативных клеток и старения предполагает исследование стерильных и слабофертильных мутантов у хорошо изученных модельных организмов.

Цель и задачи исследования

Основная цель работы состояла в идентификации мутаций leg-arista-wing complex, нарушающих экспрессию каждой из изоформ фактора транскрипции TRF2, и изучении их влияния на оогенез у Drosophila melanogaster.

В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1) провести серию генетических экспериментов по исследованию влияния трансгенных конструкций, экспрессирующих различные белковые изоформы гена trf2, на фенотип летальных мутаций, локализованных в районе lawc-trf2;

2) провести цитологический анализ ядра ооцита поздних и ранних стадий развития в поисках причин нерасхождения хромосом в мейозе у lawc-мутантов;

3) исследовать особенности распределения белка TRF2 на политенных хромосомах слюнных желёз личинок дрозофилы;

4) изучить функциональные особенности lawc/trf2 в репродуктивной системе самок дрозофилы с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания яичников стерильных и слабофертильных мутантов ооцитспецифичными и другими маркерами;

5) исследовать материнский эффект летальных аллелей lawc с помощью клонального анализа и флуоресцентного окрашивания.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые были изолированы летальные аллели lawc с нарушенной экспрессией полноразмерной и укороченной изоформ белка TRF2. Установлено, что эволюционно вариабельный N-концевой район полноразмерной изоформы TRF2 обладает самостоятельной функциональной нагрузкой. Обнаружено, что нерасхождение хромосом в мейозе у /awc-мутантов вызвано нарушением структуры хромоцентра и спаривания гомологичных хромосом ооцита ранних стадий развития. Впервые показано, что продукт ген lawc/trfl участвует в формировании клеточного цитоскелета и связанного с ним транспорта ооцитспецифичного белка Orb. Обнаружено влияние, уровня экспрессии lawc/trfl на организацию актина в эпителиальных клетках яичника. Установлено, что стерильность /Wc-мутантов вызвана нарушением механизма дифференцировки герминативных и соматических фолликулярных клеток. Обнаружено, что у мутантов с сокращенной продолжительностью жизни отсутствует самовоспроизведение герминативных стволовых клеток.

Полученные данные являются основой для дальнейшего изучения функции гена lawc/trfl, а также помогут решить ряд спорных вопросов, касающихся взаимосвязей сигнальных путей в оогенезе у дрозофилы. Учитывая, что у позвоночных, в том числе у млекопитающих и человека, присутствуют гомологичные гены, то можно предположить, что полученные данные будут иметь универсальное значение.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на XIV школе по биологии развития (Звенигород, 2005), VI международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород,.

2005), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва,.

2006), международном семинаре «Генетика репродукции насекомых и её практическое применение» (Москва, 2006), на всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007), международной молодёжной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), на конференции молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2007) и на 46-й, 47-й и 49-й Ежегодных исследовательских конференциях по дрозофиле (Сан-Диего, 2005; Хьюстон, 2006; Сан-Диего, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, их них 3 статьи в рецензируемых журналах и 9 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (91 источник). Содержит 21 рисунок и 10 таблиц.

Выводы.

1. Показано, что большинство летальных мутаций lawc являются аллелями гена tr?, кодирующего фактор базовой транскрипции. Идентифицированы 10 летальных мутаций lawc, которые вызваны снижением экспрессии укороченной изоформы TRF2, и три летальные мутации lawc, вызванные снижением экспрессии полноразмерной изоформы TRF2. Обнаружено, что эволюционно вариабельный N-концевой домен TRF2 D. melanogaster обладает самостоятельной функциональной активностью.

2. Впервые показано, что во время мейоза у самок /mvc-мутантов происходит нерасхождение половых хромосом. Установлено, что причиной нерасхождения является нарушение структуры хромоцентра и спаривания гомологичных хромосом ооцита. Преимущественная локализация TRF2 в хромоцен-тре подтверждает его специфическую функцию в организации структуры хромоцентра.

3. Установлено, что продукт гена lawc/tr? участвует в организации актино-вых филаментов фолликулярного эпителиального слоя яичников и герминативных клеток цисты.

4. Показано, что нарушение дифференцировки ооцитов у слабофертильных самок /ан'с-мутантов происходит из-за аномальных структур цитоскелета, обеспечивающих транспорт ооцитспецифичного белка Orb.

5. Было установлено, что большинство аномалий, выявленных в оогенезе при помощи клонального анализа, затрагивают регуляцию клеточного цикла и связаны с пониженной экспрессией укороченной изоформы TRF2, однако, в эндомитозе трофоцитов могут участвовать обе изоформы, и при нехватке одной из них другая может её компенсировать.

6. Впервые обнаружено, что сильные мутации гена lawc/tr? могут нарушать циклическое деление герминативных стволовых клеток и соматических фолликулярных стволовых клеток репродуктивной системы самок дрозофилы.

ГЛАВА 4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Из литературных данных известно, что укороченная изоформа TRF2 входит в состав макромолекулярного комплекса, включающего в себя DREF (DNA-replication-related element factor), и может контролировать транскрипцию генов клеточного цикла, клеточной пролиферации и генов, ответственных за репликацию ДНК, например, гена PCNA (the proliferating cell nuclear antigen) и гена, кодирующего а-субъединицу ДНК-пол имеразы (Hochheimer et al., 2002). Для полноразмерной изоформы подобной информации нет. К тому же, мало известно о конкретных генах-мишенях фактора транскрипции TRF2, функция которого исследовалась в основном биохимическими методами, и до последнего времени не было известно ни одной гипоморфной мутации этого гена.

В результате проделанной работы мы показали, что большинство мутаций lawc являются аллелями trf2, т.к. мутанты восстанавливают фенотип на фоне дополнительной экспрессии TRF2. Мы изолировали и исследовали ги-поморфные летальные аллели lawdtrfl с нарушенной экспрессией каждого из его продуктов. Впервые было обнаружено, что эволюционно вариабельный N-концевой район полноразмерной изоформы TRF2 обладает самостоятельной функциональной нагрузкой. Исследование фенотипа погибших эмбрионов из линии с пониженной экспрессией N-концевого района выявил у них недоразвитие трахейной системы, связанное с нарушением финальных этапов её формирования: слияния трахейных ветвей в единую сеть (Симонова, Бур дина, в печати). Природа этих мутаций в настоящее время исследуется.

При том, что плейотропный эффект /awe-мутаций уже хорошо описан, нам удалось обнаружить его новое проявление: нерасхождение хромосом, вызванное, очевидно, нарушением компактной структуры хромоцентра. Локализация белка TRF2 в хромоцентре подтверждает выдвинутую другими авторами гипотезу о том, что этот белок может не только участвовать в транскрипции, но и может также выполнять структурные функции в организации хроматина.

Исследуя репродуктивную систему мозаичных самок, мы обнаружили, что снижение экспрессии каждой из двух изоформ lavc/trf2 в соматических фолликулярных клетках приводит к нарушению структурированности их эпителиального слоя, вызванного неправильной организацией актиновых микрофиламентов. Этот факт стал для нас неожиданным, т.к., ранее было показано, что этот белок локализуется преимущественно в ядрах герминативных, а не соматических фолликулярных клеток.

Важным компонентом, контролирующим организацию актина в различных видах эпителия, включая фолликулярные клетки яичника, является киназа Abelson (Abi) (Grevengoed Е.Е. et al. 2001). По нашим данным гапло-копия гена АЫ способна усиливать фенотип lawc-мутантов, что говорит о взаимодействие этих генов (Модестова, Симонова, не опубл.). Свидетельством взаимодействия lawc/trf2 с компонентами цитоскелета могут служить и другие наши генетические данные: жизнеспособные /т^оаллели гибнут на фоне гетерозиготных делеций генов lamininA, laminin у, Paramyosin, ответственного за формирование миофибрилл, и rliea, кодирующего талин — компонент цитоскелета, необходимый для прикрепления актина к плазматической мембране и связывания интегринов (Модестова, Симонова, не опубл.).

Исследование мутантных клонов обнаружило участие короткой изоформы lawdtrfl в контроле циклического деления стволовых соматических клеток, дающих начало фолликулярному эпителию, так как снижение экспрессии этой изоформы приводило к полному отсутствию фолликулярного слоя и формированию «длинных» гермариев. Низкая экспрессии этой изоформы также вызывала нарушение самовоспроизведения стволовых герминативных клеток, о чём свидетельствуют «пустые» гермарии и отсутствие ранних цист. Анализируя яичники слабофертильных мутантов мы впервые показали, что отсутствие дифференцировки ооцита в гермарии сопровождается аномальной структурой кольцевых каналов и вызывается нарушением ооцитспецифичного транспорта, обеспечивающего ооциту его статус. Аномальные кольцевые каналы, нарушающие рост и созревание ооцита, были характерны и более зрелым мутантным яйцевым камерам, исследованным нами в ходе клонального анализа.

У мутантных клонов было выявлено много нарушений, связанных с регуляцией клеточного цикла. В основном они были в линиях с пониженной экспрессией укороченной изоформы TRF2. Однако лишний раунд деления и формирование 32-клеточных цист был характерен и для клонов линий с пониженной экспрессией полноразмерной изоформы.

Интересно проявил себя факт разноплоидности трофоцитов. Этот признак возникал при снижении экспрессии укороченной изоформы, но только при повышенной температуре развития мозаиков, и при снижении экспрессии полноразмерной изоформы, но в условиях пониженной температуры развития. Возможно, контролируя данный процесс, обе изоформы могут заменять друг друга.

В настоящее время известно несколько мутаций {Hii-li tai shao, Dynein, a-spectrin и др.), нарушающих формирование фьюсомы и ооцита. Результаты последних исследований показали, что дифференцировку ооцита также контролируют гены-регуляторы клеточного цикла {encore, stonewall, string/cdc25, tribbless и др.), так как единственная клетка, которая проходит мейоз полностью, — это ооцит, а остальные (трофоциты) подвергаются поли-плоидизации в процессе эндомитоза. Другая группа генов — гены веретена {spindle, obra, aubergine, vasa, armitage и др.) — нарушают формирование ан-териопостериальных и дорзовентральных осей и останавливают дифференцировку ооцита путём ареста формирования кариосомы, мислокализации ооцита, неспособности удерживать цитоплазматические компоненты на заднем полюсе ооцита и дифференцировки второго проооцита в ооцит. Эта группа генов участвует либо в репарации двуцепочечных разрывов ДНК, либо в регуляции трансляционного сайленсинга при помощи микро-РНК и.

РНК-интерференции. Обнаружено, что поляризацию могут контролировать ряд нейроспецифических генов (Notch, Delta, neuralized, big brain, mastermind и др.). Кроме того, известно, что при контакте ооцита с соматическими фолликулярными клетками происходит его реполяризация (ген Dystroglycan).

Эти процессы были исследованы благодаря наличию мутаций в контролирующих их генах, постановке иммунохимических экспериментов и клонального анализа клеток полового пути.

Результаты данной работы лягут в основу для дальнейшего исследования функциональных особенностей сложно устроенного генного комплекса lawc-trf2, чтобы установить, какую группу генов в сложной иерархии процесса регуляции гаметогенеза дрозофилы он контролирует.