Аномалии ядер и кариотическая стабильность клеток млекопитающих

К настоящему времени подавляющее большинство цитогенети-ческих исследований, направленных на выявление частот встречаемости хромосомных аберраций в клеточных популяциях, проводится с использованием методов" требующих предварительного культивирования клеток в условиях m vitro. Однако, частоты хромосомных аберраций" выявленные одним и тем же методом в клеточных популяциях in vitro и in vivo не совпадают (Бочков, 1971). Накопление знании о динамике возникновения кариотипических нарушений и распространения аберрантных клонов в клеточных популяциях in vivo (на Фоне несоизмеримо большего объема информации, накопленного с использованием методов in vitro) представляется на настоящем этапе развития биологии принципиально важным. Такая информация может быть получена путем изучения частот встречаемости клеток с определенными видами морфологических аномалий ядер, поскольку установлено, что значительная часть спектра хромосомных аберраций после завершения деления клеток приводит к Формированию морфологически измененных ядер (Алов, 1972). Наличие клеток с аномальными ядрами может указывать на тот Факт, что клетки, в которых возникли хромосомные аберрации, делятся и изменяют кариотипический профиль популяций. Следует сразу признать, что цитогенетические тесты m vivo, основанные на учете определенных морфологических изменений ядер, совсем не исключают классический метаФазный метод учета хромосомных аберраций, а наоборот могут дополнять его, облегчая выявление случаев с повышенными частотами хромосомных аберраций.

К наиболее информативным показателям, характеризующим морфологические аномалии ядер, которые возникают в результате кариотипиче ских нарушений, могут быть отнесены микроядра, хромосомные мосты и «хвостатые» ядра. Микроядра в клетках образуются в процессе деления из хромосомного материала, потерявшего контакт с веретеном митотического аппарата. Они включают в себя хроматин либо ацентрических Фрагментов, либо целых хромосом (хроматид). Частота встречаемости клеток с микроядрами свидетельствует о частоте возникновения клеток с измененными кариотипами и является базовым показателем в микроядерном тесте с Muiier, streffer, 1995}. Хромосомные аберрации дицентрического типа приводят к Формированию клеток с хромосомными мостами (Алов, 1972). Известно также, что дицентрические хромосомы, являясь маркерами радиационных воздействий, часто образуют хромосомные мосты, после разрыва которых в интерфазе Формируются клетки с полумостами или, говоря иначе, с «хвостатыми» ядрами (ПрокоФьева-Бельговская, 1981).

Для изучения аномалий ядер и установления их взаимосвязи с цитогенетическим гомеостазом в клеточных популяциях in vivo представляются интересными и перспективными программы селекции, направленные как на повышение, так и на понижение частот спонтанного образования клеток с аномальными ядрами. В ходе реализации таких селекционных программ должны проявиться причинно-следственные связи между кариотипической изменчивостью и Формированием аномальных ядер в клеточных популяциях, а данные о динамике отбора позволят определить вклад наследственных и средовых Факторов, обусловливающих кариотипиче скую изменчивость. Метод отбора на генетическую стабилизацию и дестабилизацию клеточных популяций имеет как практическое значение для биотехнологии, так и научный интерес, поскольку полученные в результате такой селекции сублинии, контрастные по признаку «частота клеток с аномальными ядрами», могут оказаться удобной моделью для Фундаментальных исследований мутационного процесса.

Изучение аномалий ядер в клеточных популяциях ±n vivo может представлять интерес в радиобиологических исследованиях, поскольку известно, что воздействие ионизирующей радиации на клеточные популяции приводит к появлению в них клеток с аномально измененными ядрами с Лаптева-Попова и др., 1959; Dienstbier et al. «1964; ГдуЗМЭН И Др., 1992). К НЗС~ тоящему времени известен достаточно широкий спектр морфологических типов ядерных аномалий, однако их классификация и полные сведения об их генезе отсутствуют. Большой интерес, на наш взгляд, вызывает такой вид аномалии, при которой ядро имеет достаточно длинный хроматиновый вырост в пространство цитоплазмы и выглядит внешне как «хвостатое» ядро. Возможно, что появление «хвостатых» ядер связано с возникновением дшдентрических хромосом и поэтому метод, основанный на определении частоты встречаемости клеток с «хвостатыми» ядрами, в перспективе может быть использован в радиационно-эпидемиологических исследованиях, так как опыт ликвидации последствий радиационных аварий показал необходимость разработки и внедрения краткосрочных информативных методов для обследования облученного контингента с Г. уськова, 1996э. Однако, для внедрения такого метода в практику требуется детальное изучение аномалий типа «хвостатых» ядер, включающее исследования возможных цитогенетических механизмов их образования, морфологических особенностей, а также определение фоновых частот встречаемости клеток с «хвостатыми» ядрами в популяциях человека и животных.

Исходя из сказанного выше, изучение аномальных ядер в клеточных популяциях m vivo представляется актуальным. Новые знания о мутационном процессе могут быть получены путем проведения клонального анализа и селекции по признакам, маниФестирующим аномалии ядер. Вместе с тем, очевидно, что наряду с общепризнанным методом учета аномалий ядермикроядерным тестом, существует перспектива для развития новых методов, основанных на учете других Форм аномалий ядра.

Поэтому целью настоящей работы явилось изучение морфологических аномалий ядер, указывающих на сдвиги цитогенети-ческого гомеостаза в популяциях нормальных и злокачественных клеток млекопитающих. Основное внимание предполагалось уделить селекции клеточных популяций m vivo по признаку «частота встречаемости клеток с аномальными ядрами» и разработке нового метода, основанного на определении «хвостатых» ядер

В КЛеТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ ir" vivo.

При этом были поставлены следующие задачи:

1. Изучить Фенотипическую и наследственную гетерогенность клонов перевивной рабдомиосаркомы РА-2 крыс по признакам «частота клеток с микроядрами» и «частота клеток с хромосомными мостами» .

2. Провести искусственный отбор клонов клеток перевивной рабдомиосаркомы РА-2 крыс и оцухолевых узлов миеломы sp г/о мышей с повышенными и с пониженными частотами встречаемости клеток с микроядрами и с хромосомными мостами. Определить коэффициент реализованной наследуемости признаков «частота клеток с микроядрами» и «частота клеток с хромосомными мостами» в исследованных клеточных популяциях.

3. Провести сравнительный анализ показателей кариотипи-ческой изменчивости в клеточных популяциях, отселектирован-ных как на повышенную, так и на пониженую частоту клеток с микроядрами и с хромосомными мостами.

4. Определить степень злокачественности по показателю «метастатический потенциал» популяций клеток с повышенной и с пониженной в результате отбора частотами клеток с микроядрами и с хромосомными мостами.

8. Определить основные морфологические типы «хвостатых» ядер лимфоцитов человека и животных и предложить их классификацию. Изучить гетерохроматин и ядрышки в «хвостатых» ядрах. Установить радиочувствительность показателя «частота клеток с „хвостатыми“ ядрами» и выяснить характер дозовой зависимости. Определить связь между частотой встречаемости клеток с «хвостатыми» ядрами и частотами дицентриков, ана-и телоФаз с хромосомными мостами, интерфазных клеток с хромосомными мостами, клеток с микроядрами в клеточных популяциях 1п.

VI УО .

8. Определить частоты встречаемости лимфоцитов с «хвостатыми» ядрами, микроядрами и хромосомными мостами, а также эритроцитов с микро ядрами в периферической крови у здоровых доноров и у облученных пациентов.

9. Определить частоты встречаемости эритроцитов с микроядрами в периферической крови в популяциях крупного рогатого скота.

10. Изучить частоты встречаемости лимфоцитов с аномальными ядрами у больных лейкозом коров.

Научнаяновиз^.

Продемонстрирована Фенотипическая и наследственная гетерогенность клонов опухолевых клеток m vivo по признакам, указывающим на ядерные аномалии.

Впервые проведены искусственные отборы в популяциях соматических клеток in vivo, направленные на повышение и на снижение частот встречаемости клеток с аномальными ядрами. Показано, что спонтанная нестабильность кариотипа клеток в значительной степени зависит от Факторов внешней среды при несомненной роли наследственных Факторов. В результате проведенной селекции установлена взаимосвязь между различными видами аномалий ядер и показателями, характеризующими кариотипическую нестабильность.

Зарегистрирована отрицательная корреляция между показателями, характеризующими кариотипическую нестабильность опухолевых клеток и их злокачественность. Показано, что искусственный отбор на повышение спонтанной частоты клеток с микроядрами и искусственный отбор на повышение спонтанной частоты клеток с хромомосомными мостами приводит в конце концов к репродуктивной гибели популяций клеток.

Представлена классификация основных морфологических типов «хвостатых» ядер и показана их видовая специфичность. Изучены свойства хроматина «хвостов» ядер лимфоцитов.

Определены Фоновые показатели частот встречаемости лимфоцитов с «хвостатыми» ядрами в периферической крови у мужчин, женщин и детей. Выявлены повышенные частоты встречавмости клеток с аномальными ядрами в периферической крови у пациентов, облученных 8−10 лет назад. Показатель «частота встречаемости лимфоцитов с „хвостатыми“ ядрами» впервые был использован в цитогенетическом прескрининге.

В популяциях крупного рогатого скота определены частоты встречаемости эритроцитов с микроядрами и выявлено повышение частоты встречаемости лимфоцитов с «хвостатыми» ядрами в периферической крови in vivo у коров больных лейкозом.

Шэ^^1ескаяценностьработа. Разработанные и апробированные способы селекции клеточных популяций на стабильность генома могут быть использованы в промышленной биотехнологии {Госпатент РФ su isoei95 аз cia ni5/00 5/00, 1992; по заявке n 95 111 988 от 11.07. 1995 принято положительное решение о выдаче патента). Количественный и качественный учет исследованных Форм аномалий ядер в клеточных популяциях in vivo может в перспективе использоваться для экспресс-оценки цитогенетического гомеостаза в онкологической практике и в цитогенетическом прескрининге облученного контингента (получена приоритетная справка cia n 5/00 s/oe в 1997 г). Метод учета аномалий ядер в соматических клетках может использоваться в популяциях сельскохозяйственных животных в экспертизе экологической чистоты сельхозпродукции.

Апробацияработы. Материалы диссертационной работы были представлены на 1-м Всесоюзном съезде радиобиологов (Москва, 1989), Всесоюзной конференции «Генетика соматических клеток» (Звенигород, 1989), на Международной конференции «Митоз и расхождение хромосом» (Ленинград, 1990), Международной конференции «Биотехнология-1994″ (С-Петербург, 1994), Международном симпозиуме по молекулярной генетике и биотехнологии в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных с С.-Петербург» Пушкин, 1994э, 16-м Международном конгрессе по проблемам канцерогенеза (Нью-Дели, 1994), Международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве (Боровск, 1995), 3-м Международном симпозиуме по хромосомным аберрациям {Эссен, 1995), Конференции по детской гематологии «От науки к практике» (Санкт-Петербург, 1995), Международной конференции ВОЗ «Последствия для здоровья после Чернобыльской катастрофы (Женева, 1995), Конференции ЕАЖ (Лилиехаммер, 1996), 24-м съезде Международного гематологического общества (Дюссельдорф, 1996), Международном конгрессе по клинической химии (Лондон, 1996), Международной конференции «Радиация и здоровье» (Бир Шива, Израиль, 1996), 1-ом Европейском цитогенетическом конгрессе (Афины, 1997), 3-м съезде по радиационным исследованиям (Москва, 1997), Международной конференции «Малые дозы радиации: биологические эффекты и контроль регуляции» с Севилья, 1997э, Международной конференции «Стратегия экологической безопасности» с С.-Петербург, 1997э, Научно—практической конференции «Ме дико-социальные аспекты проблем ветерановатомщжов и пути их решения» (С.-Петербург, 1997), Международном конгрессе по проблемам метастазирования (Хьюстон, 1997), 8-й и 9-й конференциях германского общества медицинских генетиков сГеттинген, 1996, Инсбрук, 1997).

Цу&Шсации. По результатам исследований опубликовано 45 печатных работ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

КОЕ — колониеобразуюпще единицы.

МП — метастатический потенциал.

ЧКМ — частота клеток с микроядрами.

ЧКМс — частота клеток с хромосомными мостами.

ЧЭМ — частота эритроцитов с микроядрами в/в — внутривенно в/б — внутрибрюшинно.

1. литературный обзор