Клинико-диагностическое значение определения антител к дезоксирибонуклеазе I типа у больных системной красной волчанкой с использованием иммобилизированной гранулированной формы фермента

За пять десятилетий, минувших со времени появления концепции P. Klemperer о коллагенозах и последующего вхождения системной красной волчанки (СКВ) в круг ревматических заболеваний, достигнуты определенные успехи в диагностике и лечении этого тяжелого недуга. Создание В. А. Насоновой классификации и диагностических критериев СКВ существенно улучшило диагностику и определило основу для разработки лечебной тактики [52]. Широкое применение глюкокортикостероидов (ГКС) и цитостатических иммунодепрессантов в качестве основных элементов комплексной терапии расширило возможности воздействия на активность патологического процесса. В результате пятилетняя выживаемость при СКВ увеличилась с 40−50% в 1959 г. до 90% к концу XX векадвадцатилетняя выживаемость в настоящее время составляет около 70% [23, 24, 232, 257]. Вместе с тем в учении о СКВ всё ещё остаётся большое количество нерешенных проблем как теоретического, так и практического характера.

Установление диагноза СКВ часто является весьма сложной задачей даже для специалистов-ревматологов [34]. Основной причиной таких затруднений является недостаточная диагностическая значимость признаков, находимых при физикальном осмотре, рутинных лабораторных и инструментальных тестах. В частности, ни один отдельно взятый симптом не имеет одновременно и чувствительности и специфичности выше 60% [400]. Оценивая сочетание синдромов, широко используемые ныне диагностические критерии Американской коллегии ревматологии (ACR) 1997 года позволяют, по мнению авторов, добиться чувствительности 88%) и специфичности 95% для наличия четырех и более признаков [204]. Однако истинная чувствительность этих критериев, скорее всего, существенно меньше. Источником расхождения служат дебютные и хронические формы СКВ, манифестирующие преимущественно как монои олигосиндромные. Нередко встречаясь, они, как правило, ведутся под другими диагнозами на протяжении длительного времени вплоть до появления развернутой поли-синдромной клинической картины [24, 350]. Существующие параклинические тесты также не всегда могут служить достаточно прочной основой для диагноза СКВ. С учетом невысокой информативности инструментальных исследований [214], ведущее место в верификации диагноза СКВ принадлежит специализированным иммунологическим методам, в особенности — определению антинуклеарного фактора, антител к дсДНК, Sm-антигену и фосфолипидам. Требованиям клинической практики в большей степени отвечает тест на антитела к дсДНК, имеющий чувствительность 50−70% и специфичность 80−90% [192, 195, 338].

Несовершенство диагностики СКВ является одной из важнейших причин, затрудняющих разработку и внедрение новых, более избирательных методов коррекции аутоиммунного процесса. В настоящее время лечение СКВ основано на использовании ГКС, цитостатических иммуно-депрессантов, аминохинолиновых производных и некоторых экстракорпоральных методов — плазмафереза, гемои иммуносорбции [32, 33, 59, 62]. Подавление активности заболевания с помощью этих средств сопровождается частым возникновением опасных побочных эффектов [24]. О серьёзности данной проблемы свидетельствует изменение структуры летальности при СКВ. Если в 60−70-е годы XX века среди причин смерти лидировали люпус-нефрит и нейролюпус, то к началу XXI века на первый план наряду с кардиоваскулярной патологией вышли инфекционные осложнения [15, 23, 209, 279, 280]. Ввиду этого в последние годы активно ведется эмпирический поиск новых подходов к лечению СКВ [35, 65, 284, 287, 292, 399], что делает необходимость усовершенствования её диагностики ещё более актуальной.

Результативность разработки как более избирательных методов лечения, так и улучшенных способов иммунодиагностики СКВ, в значительной степени сдерживается недостаточной изученностью этиопатогенеза данного заболевания. К сожалению, до настоящего времени специфический для СКВ механизм активации аутоиммунитета достоверно не установлен [24]. Одним из наиболее перспективных направлений в этой области сейчас считается гипотеза о возможности взаимосвязи между индукцией иммунного ответа к аутоантигенам при СКВ и нарушением процессов апоп-тоза [43, 335]. Как удалось установить, важным условием поддержания толерантности к внутриклеточным молекулам, включая ДНК и нуклеопро-теиды, является эффективная элиминация апоптозного материала, осуществляемая в том числе с помощью дезоксирибонуклеазы I типа (далееДНКаза I) [176, 301].

Принимая во внимание выявленное ранее снижение активности этого фермента при СКВ [79, 126], представляется актуальным уточнить возможную роль антител к ДНКазе I в генезе указанного феномена, а также перспективы их клинико-диагностического использования. Для достижения этой цели требуется одновременное измерение не только концентрации антител к ДНКазе I и активности сывороточной ДНКазы I, но и интенсивности ингибирования фермента актином (основным ингибитором ДНКазы I in vivo). С учетом низкой концентрации антител к другим ферментам в сыворотке крови больных СКВ [49, 63], для увеличения аналитической чувствительности непрямого иммуноферментного анализа представляется целесообразным модифицировать методику путем использования ДНКазы I, иммобилизированной на магнитоуправляемых гранулах [9].

Цель исследования.

Цель данного исследования — усовершенствование иммунологической диагностики системной красной волчанки с помощью антител к ДНКазе I, а также уточнение вклада аутоантител в ингибирование активности ДНКа-зы I при системной красной волчанке.

Основные задачи исследования.

1. Получить иммобилизированную форму ДНКазы I, определить оптимальные параметры проведения иммуноферментного анализа с ее использованием.

2. Применяя иммобилизированную форму энзима, изучить распространенность и концентрацию антител к ДНКазе I в сыворотках крови здоровых лиц, больных СКВ, а также контрольной группы, состоящей из пациентов с ревматоидным артритом, системной склеродермией, системными васку-литами, дерматомиозитом, болезнью Шегрена.

3. Исследовать активность ДНКазы I и интенсивность ингибирования фермента актином в сыворотках крови здоровых лиц, больных СКВ и пациентов контрольной группы.

4. Выявить наличие статистических взаимосвязей между клиническими особенностями СКВ и содержанием антител к ДНКазе I, активностью ДНКазы I, интенсивностью ингибирования фермента актином.

5. Количественно оценить эффективность использования антител к ДНКазе I для дифференциальной диагностики СКВ от других аутоиммунных ревматических заболеваний.

6. Используя метод множественного регрессионного анализа, охарактеризовать зависимость активности сывороточной ДНКазы I от влияния аутоантител и актина у больных СКВ в сравнении с пациентами контрольной группы.

Научная новизна.

1. Впервые продемонстрирована высокая эффективность определения сывороточных антител к ДНКазе I в ходе дифференциальной диагностики.

СКВ от других аутоиммунных ревматических заболеваний (ревматоидного артрита, системной склеродермии, системных васкулитов, дерматомиози-та, болезни Шегрена). Вычислены основные операционные характеристики данного теста (чувствительность, специфичность, прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов, отношение правдоподобия положительного и отрицательного результатов).

2. Впервые установлена доля больных СКВ со сниженной активностью сывороточной ДНКазы I. Кроме того, показана возможность не только снижения, но и повышения активности сывороточной ДНКазы I у пациентов с СКВ.

3. Впервые показано, что при СКВ активный люпус-нефрит и лимфо-аденопатия ассоциируются как с наличием сывороточных антител к ДНКазе I, так и с изменением активности сывороточной ДНКазы I. Для активного люпус-нефрита характерно повышение активности фермента, для лим-фоаденопатии — снижение.

4. Впервые выявлена связь между снижением активности сывороточной ДНКазы I при СКВ и совместным эффектом нескольких ингибирующих факторов, включая аутоантитела и актин.

Практическое значение.

Разработан доступный для применения в клинических лабораториях способ определения уровня сывороточных антител к ДНКазе I, являющийся модификацией иммуноферментного анализа. Главное отличие этого способа — использование иммобилизированного на магнитоуправляемых гранулах фермента в качестве антигена.

Получены доказательства эффективности данного теста при дифференциальной диагностике СКВ от других аутоиммунных ревматических заболеваний (ревматоидного артрита, системной склеродермии, системных васкулитов, дерматомиозита, болезни Шегрена). Определено пороговое значение и его операционные характеристики, позволяющие интерпретировать результат теста с позйций вероятности диагноза СКВ. Уточнена взаимосвязь клинико-иммунологических проявлений СКВ (активного люпус-нефрита, лимфоаденопатии, наличия антител к дсДНК) с наличием антител к ДНКазе I.

Основные положения, выносимые на защиту.

Наличие сывороточных антител к ДНКазе I — признак, часто встречающийся при СКВ, в особенности у больных с активным люпус-нефритом, лимфоаденопатией и наличием сывороточных антител к дсДНК.

Результат определения сывороточных антител к ДНКазе I может быть использован для дифференциальной диагностики СКВ от других аутоиммунных ревматических заболеваний (ревматоидного артрита, системной склеродермии, системных васкулитов, дерматомиозита, болезни Шегрена).

Антитела к ДНКазе I способны ингибировать сывороточный фермент, являясь одной из причин снижения активности энзима, наблюдаемого у части больных СКВ.

Внедрение в практику.

Методы определения активности ДНКазы I, антител к ДНКазе I с помощью иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами внедрены в практику работы муниципального учреждения здравоохранения «Городская клиническая больница скорой медицинской помощи № 25» города Волгограда.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из которых 4 -в центральной печати и 6 — в местной печати.

Апробация работы.

Основные положения диссертации были представлены на итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (2004;2008 гг.), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004 г), XII и XIV Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2005 г., 2007 г), научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Волгоградской области и современные медицинские технологии его коррекции» (Волгоград, 2005 г), I Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2006 г). Первичная экспертиза диссертации была проведена на совместном заседании Ученого совета ГУ НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН и кафедры госпитальной терапии ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» 16 июня 2008 года (протокол № 3).

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 182 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением использованных методов исследования, клинической характеристики пациентов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и приложений. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 25 таблицами, содержит 2 выписки из истории болезни. Библиографический указатель включает 407 источников, в том числе 73 — на русском языке и 334 — на иностранных языках.

126 Выводы.

1. При использовании иммуноферментного анализа с иммобилизирован-ной гранулированной формой ДНКазы I антитела к этому ферменту в сыворотках крови больных системной красной волчанкой выявляются значительно чаще (64,81%), чем в среднем при других аутоиммунных ревматических заболеваниях: ревматоидном артрите, системной склеродермии, системных васкулитах, дерматомиозите, болезни Шегрена (15,38%). У здоровых лиц антитела к ДНКазе I в сыворотке крови отсутствуют.

2. Измерение содержания сывороточных антител к ДНКазе I позволяет дифференцировать системную красную волчанку от других аутоиммунных ревматических заболеваний с высокой эффективностью, не уступающей определению антител к дсДНК. Чувствительность диагностики системной красной волчанки увеличивается при одновременном тестировании как антител к дсДНК, так и антител к ДНКазе I.

3. У больных системной красной волчанкой наличие сывороточных антител к ДНКазе I ассоциируется с присутствием сывороточных антител к дсДНК, активным люпус-нефритом, лимфоаденопатией. С двумя последними проявлениями системной красной волчанки также ассоциируется изменение активности сывороточной ДНКазы I. Для активного люпус-нефрита характерно повышение активности фермента, для лимфоадено-патии — снижение.

4. Изменение активности сывороточной ДНКазы I при системной красной волчанке имеет двойственный характер. С одной стороны, крайне низкие значения активности фермента встречаются при системной красной волчанке значительно чаще (29,63%), чем у здоровых лиц (9,09%) и больных другими аутоиммунными ревматическими заболеваниями (5,77%). С другой стороны, у основной части (70,37%) больных системной красной волчанкой средняя активность ДНКазы I выше, чем у здоровых лиц и больных другими аутоиммунными ревматическими заболеваниями.

5. Снижение активности сывороточной ДНКазы I при системной красной волчанке обусловлено совместным влиянием нескольких факторов. Преимущественный эффект аутоантител и/или актина показан для 50% случаев крайне низкой активности фермента. У другой половины главная роль принадлежит неидентифицированному ингибитору ДНКазы I, действие которого усиливается при нарастании активности системной красной волчанки. У больных другими аутоиммунными заболеваниями признаков наличия такого ингибитора не отмечено.