Разработка технологий получения препаратов природных и рекомбинантных белков из прокариотических клеток

В современной биотехнологии проблемы получения функционально и химически чистых биологически активных веществ и анализ их биологических функций являются чрезвычайно актуальными на всех этапах разработки биопрепаратов, а отсутствие информации о физико-химических свойствах получаемых веществ и физиолого-биохимических особенностях микроорганизмов-продуцентов являются основным из сдерживающих факторов интенсификации микробиологического синтеза, выделения и применения биологически активных веществ. Изучение физиологии и биохимии продуцентов, как природного происхождения, так и рекомбинантных штаммов, необходимо для оптимизации питательных сред, условий культивирования и целенаправленного управления микробиологическим синтезом. Именно благодаря развитию и совершенствованию вышеперечисленного комплекса методов возможен дальнейший прогресс в развитии этой науки.

В последние годы, в связи с накоплением знаний по изучению связи между «архитектурой» и биохимическими свойствами белковых молекул, появилась возможность создания новых белков путем биосинтеза и клонирования искусственных генов. Наибольшие успехи достигнуты в работах с E. coli, которая стала центральным объектом исследований благодаря генетической изученности. Успешно для этих целей используются и другие микроорганизмы. Клетки микроорганизмов применяют, в частности, для биосинтеза и наработки таких важных полипептидов как цитокины, иммуномодуляторы, факторы роста, белки оболочек вирусов и многих других. Все эти микроорганизмы-продуценты созданы при помощи трансформации их рекомбинантными плазмидами, т. е. методами генетической инженерии.

Одним из основных моментов зарождения генетической инженерии было открытие сайт-специфических эндодезоксирибонуклеаз (эндонуклеаз рестрикции, рестриктаз). И дальнейшее развитие ведущих направлений биологической науки (молекулярно-генетических исследований и генетической инженерии, в частности) и ее прикладных аспектов, имеющих самое непосредственное отношение к решению биотехнологических проблем, во многом зависит от доступности широкого ассортимента рестриктаз различной субстратной специфичности.

Эндонуклеазы рестрикции являются одним из незаменимых инструментов при определении первичной структуры ДНК, создании рекомбинантных молекул ДНК, исследованиях генетического материала как природного, так и созданного искусственно.

Как при получении ферментов нуклеинового обмена (в частностиэндонуклеаз рестрикции), так и при получении биологически активных белков с использованием рекомбинантных ДНК, приходится решать комплекс проблем. С практической точки зрения процессы получения биологически активных веществ из прокариотических клеток можно разделить на ряд взаимосвязанных этапов: а) поиск, селекция, создание штаммов-продуцентов БАВ, разработка методов и способов повышения их продуктивности в ходе культивирования штаммов и наработки биомассб) разработка комплекса методов и способов извлечения целевых БАВ (в частности — белков) из клеток, выделения и очистки последних до необходимой степени чистоты (или до гомогенности) — в) характеристика получаемых препаратов по их функциональным свойствам.

Решение вопросов по каждому этапу, основанное на использовании последних достижений микробиологии, биохимии, генной инженерии и других наук, безусловно внесет существенный вклад в развитие биотехнологии и будет использовано для получения биологически активных веществ.

Сегодня биотехнология во всем мире рассматривается как самая перспективная с точки зрения практики область знаний. Проводятся опыты по созданию живых вакцин, создаются трансгенные животные, широко дискутируются вопросы о клонировании человека и т. д. Продолжающийся подъем биотехнологии постоянно требует устойчивого и полного обеспечения генно-инженерных, диагностических и др. работ ферментами обмена нуклеиновых кислот, и, в первую очередь, широким спектром эндонуклеаз рестрикции. Как следует из вышеописанного, они необходимы не только при создании генно-инженерных конструкций, но и для их дальнейшего контроля в ходе практического использования. Вследствие этого, поиск новых штаммов-продуцентов и разработка методов получения ферментов расширяют возможности вышеупомянутых работ.

Целью настоящей работы является выявление новых штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции, разработка комплекса приемов и методов, позволяющих получать из прокариотических клеток препараты белков как природного происхождения, так и рекомбинантных.

В задачу проведенных исследований входило развитие и оптимизация современных методов повышения уровня целевых белков в штаммах-продуцентах биологически активных веществ, процессов разделения и анализа биоорганических соединений. У.

На защиту выносится:

1.Выявление 21-ого нового штамма-продуцента эндонуклеаз рестрикции. Разработка методов повышения продуктивности штаммов.

2.Разработка способов выделения и очистки эндонуклеаз рестрикции. Разработка нового сорбента для их хроматографической очистки.

3.Изучение стабильности рекомбинантных штаммов-продуцентов факторов некроза опухолей и разработка комплекса методов, позволяющих повысить содержание целевых продуктов в биомассах.

4.Разработка технологий выделения и очистки рекомбинантных белков из растворимой фракции клеток: аналога фактора некроза опухолей-альфа и фактора некроза опухолей-бета.

5.Разработка способа выделения и очистки рекомбинантного белка из нерастворимой фракции клеток (телец включения): белка ТВ1 -кандидата в вакцины против Н1У-1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Получение препаратов белков из прокариотических клеток.

Получение ферментов (эндонуклеаз рестрикции).

Получение рекомбинантных белков путем биосинтеза их в прокариотических клетках стало возможным благодаря развитию методов генетической инженерии. Успешное же развитие молекулярной биологии и генетической инженерии и их прикладных направлений трудно себе представить без наличия необходимого энзимологического инструментария, способного специфически фрагментировать и модифицировать нуклеиновые кислоты. И одной из актуальных задач при этом является расширение спектра этих ферментов, в том числе — эндонуклеаз рестрикции II типа (рестриктаз, КФ 3.1.23.Х). Исследованиям по распространенности, функциям и прикладным аспектам эндонуклеаз рестрикции посвящено значительное количество обзоров [1−9 и др.]. Несмотря на то, что к настоящему времени открыто более 2500 ферментов, представленных 188 специфичностями [10], их поиск интенсивно продолжается [11−14]. В данном разделе обзора рассмотрены основные методологические аспекты получения рестриктаз.

Способы анализа микроорганизмов на наличие эндонуклеазной активности.

Для получения новых эндонуклеаз рестрикции на первом этапе, как правило, проводится поиск штаммов-продуцентов ферментов с новой специфичностью или же более технологичных продуцентов рестриктаз известной специфичности. Важное значение при этом имеет выбор способа, позволяющего быстро анализировать большое количество штаммов и имеющего высокую чувствительность. Биологические подходы, заключающиеся в ограничении размножения бактериофагов в исследуемых культурах [15−16], не нашли широкого применения в силу их громоздкости, длительности и низкой результативности. Суть их заключалась в том, что, имея набор различных фагов, размножающихся на представителях анализируемого рода или вида бактерий, и, наблюдая за ограничением развития фагов бактериями в зависимости от предшествующего хозяина, можно выявлять различные системы рестрикции-модификации, присущие данному таксону. Реализация этого метода в первую очередь зависит от наличия у исследователя фагов с широким кругом хозяев и набора идентифицированных бактериальных хозяев. Также следует учитывать, что фаги в процессе эволюции взаимоотношений вирус-клетка смогли выработать различные способы, предотвращающие деградацию своей ДНК при проникновении в бактериальную клетку [17−18]. Используемый фаг может и не иметь сайтов узнавания на своей ДНК для рестриктазы. Например, для вида Staphylococcus aureus известно существование так называемого сверхвирулентного фага Sb-1. Этот фаг развивается в бактериях данного вида независимо от наличия в них систем рестрикции-модификации. Исследование структуры ДНК фага не выявило ни одного сайта для разрезания рестриктазой Sau ЗА I [18]. Кроме того, биологическим методом трудно оценить продуктивность найденного штамма по рестриктазе. Попытки визуально оценить активность рестриктаз по темпам лизиса Bacillus globigii бактериофагом SP 50 показали, что эту оценку следует считать качественной [19].

Применение биохимических методов (ультрацентрифугирование продуктов гидролиза субстратной ДНК в градиенте сахарозы и анализ продуктов гидролиза вискозиметрическим методом) для поиска и идентификации специфических эндонуклеаз завершилось открытием одной из первых рестриктаз II типа-Hind II [20]. Немногим ранее были обнаружены рестриктазы из штаммов Е. coli [21,22].

Предложенный в дальнейшем электрофоретический метод для разделения продуктов гидролиза ДНК [23,24] позволил проводить целенаправленный широкомасштабный поиск эндонуклеаз рестрикции.

В первых работах, посвященных поиску рестриктаз, авторы анализировали их активность в частично очищенных экстрактах клеток [25]. Было показано, что введение дополнительных стадий очистки рестриктаз или изменение существующих позволяет обнаружить новые штаммы-продуценты, дававшие отрицательный результат при первичной их проверке [26]. С расширением объема работ по поиску ферментов возникла необходимость в максимально упрощенных методах, позволяющих провести массовое тестирование проверяемых штаммов. В результате появились работы с описанием приемов экспресс-анализа небольших объемов исследуемых культур на наличие рестриктазной активности [27,28]. Соколов Н. Н. и соавт. [27] предложили для извлечения рестриктаз из клеток использовать обработку 1 мл суспензии клеток 0,1 мл толуола в течение 10 мин с последующим анализом водной фазы. В последующих работах они использовали этот метод для обнаружения рестриктазных штаммов [29,30]. Whitehead P.R. и Brown N.L. [28] использовали для анализа клетки, полученные из 4 мл культуры, которые они суспендировали в растворе, содержащем сахарозу, лизоцим и ЭДТА, затем к суспензии добавляли детергент Brij-58 и MgCb. После инкубации клетки удаляли, а полученную надосадочную жидкость использовали для анализа на наличие специфической эндонуклеазной активности.

Наиболее простым в настоящее время методом массового скрининга штаммов является способ, разработанный Белавиным П. А., Дедковым В. С. и Дегтяревым С. Х. [31]. Предложенный прием представляет собой упрощенный и усовершенствованный метод Whitehead P.R. и Brown N.L. [28]. Основным различием между ними, позволяющим значительно снизить трудоемкость, является использование в качестве исходного материала биомассы отдельных колоний, выращенных на агаризованной среде. Так же есть отличия и при разрушении клеток — в последнем случае разрушение проводится в один этап (15 мин при комнатной температуре) и клетки суспендируются в буферном растворе, содержащем в качестве пермеализующих агентов тритон Х-100 и лизоцим. Метод отличается большой чувствительностью. При его использовании обнаружено значительное число рестриктазных штаммов [32−35]. Среди проверенных культур положительные результаты были получены со штаммами, принадлежащими к родам Bacillus, Kurthia, Paracoccus, Vibrio, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Providencia, Flavobacterium и к ряду других, отрицательные со Streptomyces и Nocardia [31]. Поэтому авторы при исследовании штаммов Streptomyces и Nocardia для их пермеализации использовали более жесткие условиянеионный детергент NF-40 вместо тритона Х-100 и относительно высокие концентрации NaCl (до 1М) [36]. Репин В. Е. и Дегтярев С. Х. [37], используя метод анализа отдельных колоний, проанализировали ряд способов разрушения клеточных стенок. Сравнивались толуольный" [27], «сферопластный» [28] и «тритоновый» [31]. Методы анализа различались по чувствительности: наивысшая была отмечена для тритонового метода [31]. В дальнейшем, используя этот метод, авторы обнаружили ряд новых штаммов-продуцентов рестриктаз [9,38].

Следует отметить, что существует ряд причин, по которым имеющиеся в клетках специфические нуклеазы могут быть и не обнаружены. Среди них — отсутствие сайтов узнавания в субстратной ДНК, используемой в исследовании, имитация отсутствия сайтов узнавания природными модификациями субстратов в виде метилирования [26]. Рестриктазная активность также может маскироваться большой активностью неспецифических нуклеаз. Случаи отсутствия пермеализации могут быть идентифицированы визуально (например, по отсутствию в экстрактах клеточных нуклеиновых кислот) и клетки могут быть подвергнуты другим методам вскрытия [4].

Способы выделения и очистки эндонуклеаз рестрикции.

Для изучения субстратной специфичности рестриктаз в большинстве случаев необходимы их очищенные препараты. Для их практического использования в качестве аналитических реагентов требуется их высокая функциональная чистота, т. е. отсутствие примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз.

Основными этапами выделения любого внутриклеточного фермента, в том числе — рестриктаз, является получение экстракта клеток и собственно очистка целевого белка. Сам процесс очистки может быть разделен на этапы: а) удаление дебриса (обломков клеток, рибосом, липидов и др.) — б) удаление нуклеиновых кислот и «грубое» фракционирование белковв) получение фермента, пригодного для физического картирования удаление значительной части балластных белков) — г) получение высокоочищенного препарата фермента, пригодного для генно-инженерных работ (удаление микропримесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз);

Разрушение клеток для получения их экстракта можно проводить различными способами. Большое распространение для этой цели получила обработка клеточной массы ультразвуком [39−81], иногда клетки перед этим обрабатываются лизоцимом [19,41−43,67,68,72−79], лизостафином [43]. Некоторые авторы ограничивались только инкубацией клеток с лизоцимом [82], с лизоцимом и тритоном Х-100 [83].

В ряде случаев авторы для разрушения клеток использовали пресс Френча [84−87], реже — растирание клеток с селикагелем [88], смесью алюминия [89], разрушение при помощи стеклянных шариков [19,90], использовали осмотический шок [91], экстракцию органическими растворителями [27]. Mayer H. и Reichenbach H. сравнивали три различных метода разрушения клеток: ультразвуковую дезинтеграцию, осмотический шок и механический способ (при помощи гомогенизатора Поттера) [91]. Оказалось, что наиболее эффективным приемом в отношении выхода рестриктаз является обработка клеток ультразвуком. Осмотический шок и применение гомогенизатора Поттера дали выход соответственно на 40 — 60% и 20 — 40% ниже. Они пришли к выводу, что осмотический шок высвобождает рестриктазы только из грамотрицательных бактерий.

Следует также отметить, что добавление в буфер неионного детергента тритон Х-100 при разрушении клеток способствует переходу рестриктаз в раствор [31,37,92]. По данным Нетесова C.B. и Грачева С. А., добавление в процессе разрушения клеток тритона X-100 повышает выходы из клеток для различных рестриктаз в 2 — 12 раз [92].

Следующим этапом в получении клеточных экстрактов является удаление дебриса (обломков клеток). Обычно для этой цели используется высокоскоростное центрифугирование (10 000 — 30 000 g ;

30 — 90 мин) или ультрацентрифугирование (100 000 g в течение 1−2 часов), позволяющее наряду с удалением клеточных обломков перевести в осадок и рибосомы [93]. Очистка от рибосом будет лучше, если эти стадии: центрифугирование (20 000 g) и ультрацентрифугирование (100 000 g) проводить последовательно [94].

Л |.

Присутствие ионов М^ в концентрации 5 — 10 мМ облегчает осаждение рибосом [93].

Далее следует этап удаления из экстракта нуклеиновых кислот и «грубое» фракционирование белков. Для отделения нуклеиновых кислот от рестриктаз используют их осаждение стрептомицинсульфатом (протаминсульфатом) или полиэтиленимином, двухфазные водные системы, гель-фильтрацию и другие методы.

Для осаждения нуклеиновых кислот стрептомицинсульфатом обычно использовали 1 — 2%-ный раствор антибиотика [40,41,43,46, 58,64,82,84,86,95,96]. К недостаткам этого способа следует отнести возможную потерю целевых белков, так как распределение нуклеиновых кислот и белков (в том числе нуклеаз, фосфатаз и рестриктаз) между осадком и раствором в каждом конкретном случае зависит от индивидуальных свойств этих компонентов и их проявления в условиях конкретного эксперимента. О подобного рода явлениях свидетельствует и разброс концентраций стрептомицинсульфата (0,5 — 4%) в экспериментах [95,96]. Комплекс стрептомицинсульфат-ДНК является неустойчивым в условиях повышенной ионной силы. Это его свойство ограничивает возможности вариации условий экспериментов по извлечению целевых ферментов из осадков растворами повышенной ионной силы.

Вышеуказанные ограничения стрептомицинсульфатного метода стимулировали поиск других способов удаления нуклеиновых кислот путем их осаждения, что, учитывая простоту и возможность масштабирования, оставалось привлекательным приемом. Внимание исследователей было обращено на успешное использование полиэтиленимина (ПЭИ) для перевода нуклеиновых кислот в осадок в работах, посвященных выделению ферментов обмена нуклеиновых кислот [97]. Следует заметить, что на основе фракционирования ПЭИ экстрактов клеток и в настоящее время разрабатываются комплексные технологии получения вышеупомянутых ферментов [98]. Комплекс ДНК-ПЭИ довольно устойчив в широком диапазоне ионной силы. В одной из первых работ [99], посвященных исследованию возможностей использования ПЭИ в опытах по выделению рестриктаз, было апробировано несколько вариантов его применения. Вюк1е Т.А. с сотр. [99] исследовали распределение 16-ти рестриктаз между осадком и 1%-ным раствором ПЭИ при низкой ионной силе (в, а отсутствии соли) и при ОД М NaCl. В последнем варианте во всех случаях в надосадочной жидкости была обнаружена рестриктазная активность. Bingham А.Н.А. с сотр. в работе [100] на примере очистки EcoR I показали, что в присутствии 0,025 М NaCl в растворе остается 0,1% от суммарной активности фермента. Повышение концентрации соли до 0,3 М позволяет обнаружить в надосадочной жидкости всю рестриктазную активность, а в случае 0,1 М — только 28%. При всех использованных концентрациях соли (0,025 М — 0,3 М) ДНК практически полностью переходит в осадок, а около одной трети белков и одной пятой РНК остается в растворе. В одновременно появившейся работе Sumegi J. с сотр. [101] провели аналогичный подбор условий осаждения EcoR I и нуклеиновых кислот полиэтиленимином с последующей элюцией целевого фермента из осадка. После появления первых, цитированных выше работ, полиэтиленимин нашел применение для очистки многих рестриктаз [29,50,51,65,70−73,75,77,78]. В этих опытах использовались как осаждение ДНК в ионной силе, когда рестриктазы остаются в растворе, так и осаждение ферментов в комплексе с ПЭИ-ДНК с последующей их элюцией из осадка при помощи повышения ионной силы раствора. Следует отметить такой недостаток этого способа — для дальнейшей очистки рестриктаз необходимо удаление ПЭИ из раствора, так как он препятствует проведению хроматографических стадий на ионообменных сорбентах. Для удаления ПЭИ используют иногда гель-фильтрацию [50], но значительно большее распространение получила стадия осаждения рестриктаз сульфатом аммония (CA) из полиэтилениминового раствора [29,51,65,70−73,75,77,78].

В литературе описаны способы иммобилизации ПЭИ на матрице с последующей хроматографией на полученном сорбенте. В частности, в работе [83] докладывается об успешном разделении рестриктаз Нра I и Нра II на иммобилизованном ПЭИ. Использование иммобилизованного ПЭИ соответственно не требует его дальнейшего удаления из раствора. Кроме того, позволяет фракционировать рестриктазы от примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз при элюции белков с колонки повышением ионной силы раствора.

Из литературы известен способ удаления нуклеиновых кислот из раствора при помощи внесения панкреатической ДНКазы [102]. Способ не нашел широкого распространения, так как от ДНКазы приходится дополнительно освобождаться.

Эффективным, давно известным способом разделения белков и нуклеиновых кислот, является использование двухфазных водных систем [ЮЗ], в частности: полиэтиленгликоль-декстран. Предварительные данные Schleif R. [104] указывают на то, что этот метод достаточно эффективен в отношении очистки эндонуклеаз рестрикции. Так, фракционирование неосветленных лизатов бактериальных продуцентов рестриктаз в системе 7%-ный полиэтиленгликоль — 2%-ный декстран в ряде случаев давало необходимую для тестирования этих ферментов очистку от неспецифических нуклеаз [104]. Примеры использования таких систем для очистки рестриктаз описаны в литературе [62,91, 98, 105 107].

Чикаев Н.А. и сотр. в работе [106] предлагают использовать метод фракционирования в двухфазной системе полиэтиленгликоль-декстран для тестирования эндонуклеаз рестрикции. Но так как для перехода в верхнюю фазу для каждого конкретного фермента необходим подбор ионной силы раствора, метод нельзя считать универсальным для скрининга штаммов бактерий. В то же время он перспективен для очистки рестриктаз.

Так, очистка по белку для Eco VIII при использовании этого метода составляла 4,6 раза [62] для BamH I — в 5,9 раза при выходе 80% [106]. В той же работе [106] авторы показали, что при использовании этого способа им удалось повысить выходы в процессе очистки для Msp I в 2, Pvu I в 7,4 и Pvu II в 4,8 раза соответственно. Кроме того, ПЭГ в отличие от ПЭИ не имеет заряда и не препятствует дальнейшей хроматографической очистке на ионообменных сорбентах.

Для удаления ДНК и части балластных белков из растворов ферментов используют также гель-фильтрацию на биогелях А-0,5 м, АсА 44 и ряде других [12,42,48,53,54,59,74,85,87,108−111]. Эта процедура применима практически во всех случаях без предварительного подбора условий проведения эксперимента. Используют также сефакрил S-200 [20,112], сефарозу 2 В [90] или 6 В [28,113]. Процесс может проводится как при концентрациях соли в буфере 0,2- 0,5 M [20,74,90] так и при 1 M [48,53,54,85]. Гель-фильтрация может использоваться для удаления стрептомицинсульфата, полиэтиленимина, сульфата аммония из препаратов рестриктаз после соответствующих стадий очистки [40,46,50,66,72−75,77,78,86]. Так как на колонки наносятся относительно большие объемы раствора ферментов, составляющие 48% [53,54,90] и больше 10% [20,108] от общего объема фракционирующего геля, то высоких степеней очистки авторы не добивались. Цель этих процедур — разделение нуклеиновых кислот и рестриктаз. В работе [85] отмечалось, что при узком сборе пика фермента можно достичь более высокой степени очистки от балластных белков (до 8−25), но выход ферментов при этом снижался (до 15%).

Гель-фильтрация имеет ряд недостатков: повышение ионной силы в растворах с целью диссоциации комплекса нуклеиновых кислот и рестриктаз приводит и к диссоциации неспецифических нуклеаз, которые могут загрязнять целевые ферменты. К тому же этот метод (гель-фильтрация) трудномасштабируем.

Для отделения нуклеиновых кислот от рестриктаз Smith Н.О. и Wilcox K.W. [20] использовали гидроксилапатит (ГАП), на который путем непродолжительного перемешивания с грубыми экстрактами ряда продуцентов из рода Haemophilus сорбировали рестриктазы и нуклеиновые кислоты. Фракционное промывание сорбента порциями элюирующих растворов повышающейся ионной силы позволило добиться отделения нуклеиновых кислот от целевых ферментов и достичь более чем десятикратной степени очистки последних по удельной активности. Однако, этот прием в дальнейшем не получил распространения, так как для решения обсуждаемой задачи были подобраны более удобные в работе сорбенты.

В качестве такого иногда используется анионит диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЕАЕ-целлюлоза). Она, аналогично ПЭИ, обладает положительным зарядом и также может использоваться в двух вариантах: 1) при значениях ионной силы, исключающих задерживание на сорбенте целевого фермента и не препятствующих сорбции на нем нуклеиновых кислот — в условиях, обеспечивающих разделение целевых ферментов и нуклеиновых кислот уже во время контакта грубых экстрактов с анионитом [49,114], 2) в условиях, когда оба компонента связываются с анионитом и их разделение осуществляется при последующей элюции с колонки [67,115,116]. В первом случае расход сорбента меньший, но требуется подбор ионной силы раствора в каждом конкретном случае. Второй вариант не требует подбора условий и более распространен. Следует отметить, что существует вероятность перекрывания профилей элюции рестриктаз и нуклеиновых кислот. Так, например, наблюдалась совместная десорбция с ДЕАЕ — целлюлозы рестриктазы EcoR I и нуклеиновых кислот при 0,65 М концентрации NaCl [100]. В той же работе [100] содержатся данные о том, что рестриктаза EcoR I, сорбированная на ДЕАЕ-целлюлозе из растворов, не содержащих нуклеиновых кислот, элюируется при 0,1 М концентрации NaCl. Таким образом, связанные с анионитом нуклеиновые кислоты могут влиять на ход хроматографического фракционирования рестриктаз. В общем случае, для проведения очистки рестриктаз хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе, желательно предварительное освобождение экстракта клеток от нуклеиновых кислот. Поэтому эта стадия не получила широкого распространения для удаления нуклеиновых кислот из грубых клеточных экстрактов.

Более значительное распространение для этих целей получили хроматографические процедуры на катионитах, которые в принципе не способны связывать нуклеиновые кислоты за счет электростатических взаимодействий. Одним из таких катионитов, используемых для совмещения стадии удаления нуклеиновых кислот и хроматографического фракционирования рестриктаз, является фосфоцеллюлоза P-II, впервые апробированная с этой целью Greene P.J. с сотр. 117]. На примере большой группы рестриктаз, выделяемых из 13-ти штаммов различных таксономических групп, этими авторами была продемонстрирована сорбция на фосфоцеллюлозе P-II всех исследованных ферментов из грубых экстрактов, содержащих 0,10,2 М NaCl. Применение ионной силы в этих опытах планировалось для диссоциации комплекса нуклеиновые кислоты-рестриктазы с целью дальнейшей сорбции ферментов на сорбенте. Последующая отмывка колонки исходным раствором давала гарантированное удаление нуклеиновых кислот, а элюция градиентом концентрации соли — эффективную очистку связанных ионитом целевых ферментов, в том числе — от значительного количества примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз. Этот способ (фракционирование грубого экстракта клеток при помощи хроматографии на фосфоцеллюлозе), совмещающий в себе удаление нуклеиновых кислот и освобождение от части примесных белков, нашел широкое применение для очистки рестриктаз [44,52,55,63,69,80,81]. Следует отметить, что хроматография на фосфоцеллюлозе P-II может использоваться не только как начальная стадия, она хорошо зарекомендовала себя и для доочистки ферментов [4042,44,46,49,53,54,70,86,98].

Близкими по свойствам (заряду) к фосфоцеллюлозе P-II являются сорбенты с иммобилизованным гепарином. Предпосылкой для использования гепарина в качестве лиганда для очистки специфических эндонуклеаз послужили сведения об его ингибирующем действии на ряд ферментов, взаимодействующих с ДНК. Первым в практику препаративной биохимии рестриктаз гепарин, связанный с сефарозой, ввел Bicle Т.А. с сотр. [99]. Они показали эффективность его применения в ходе выделения 16-ти ферментов. Гепарин-сефароза (ГС), по мнению авторов, обладает следующими положительными качествами: сорбент стабилен, легко регенерируется, может быть использован многократно, обладает хорошими проточными свойствами и высокой емкостью. Также авторы отметили, что часть неспецифических нуклеаз из экстрактов клеток, полученных после удаления нуклеиновых кислот, или не связывались с гепарин-сефарозой, или элюировались преимущественно при более низкой ионной силе, чем рестриктазы.

Гепарин-сефароза является одним из немногих «псевдоаффинных» сорбентов, для которого была исследована природа взаимодействия с рестриктазами. Из данных Imber Р. и Bicle Т.А. 118] и Hinsh В. с сотр. [119], которые установили, что рестриктазы Bgl II и BamH I конкурентно ингибируются гепарином, можно предположить, что ГС может использоваться для разделения двух и более рестриктаз из исходного экстракта. После появления статьи Bicle Т.А. с сотр. 99] гепарин-сефароза нашла широкое применение в схемах очистки многих рестриктаз [47,51,58,59,64,66,69,70,72−81,98].

В качестве катионообменных лигандов для связывания рестриктаз были апробированы краситель цибакрон F3GA [45,98,120], содержащий три сульфо-группы, и сополимер пирана [120], представляющий собой дивиниловый эфир малеинового ангидрида, который в водных растворах гидролизуется с образованием соответствующей поликарбоксильной кислоты, иммобилизованные на агарозе. В работе [120] указывалось, что оба этих соединения ингибируют активность рестриктаз. Их структура (ароматические кольца, отрицательно заряженные группы) в какой-то мере может быть принята как имитирующая ДНК. С использованием этих сорбентов была продемонстрирована эффективная очистка ряда рестриктаз, сорбируемых непосредственно из неочищенных грубых экстрактов на голубой сефарозе [45] или на обоих обсуждаемых сорбентах после проведения стадии удаления нуклеиновых кислот [120]. К недостаткам голубой сефарозы и пирансефарозы следует отнести их относительно низкую емкость по отношению к целевым ферментам, содержащимся в неочищенных препаратах [120]. Тем не менее, на стадиях после удаления нуклеиновых кислот и частичной очистки хроматография на голубой сефарозе успешно применяется [55,70−73,7579,98]. В работе [98] авторы использовали вместо голубой сефарозы процион-силохром, обладающий повышенной устойчивостью к действию микрофлоры. Следует упомянуть о применении других красителей в качестве лигандов для очистки рестриктаз: красная сефароза, бордо сефароза, красно-коричневая сефароза [121]. Но так как очистка на них была значительно ниже, чем при использовании цибакрона F3GA, они не нашли широкого применения.

В литературе описаны методики очистки рестриктаз на таких катионообменных сорбентах как Bio-Rex 70 [63], сульфопропил-сефадексе [67,98,122,123]. Но так как емкость карбоксильных сорбентов по целевым белкам (рестриктазам) уступает емкости фосфоцеллюлозы, они не нашли такого же широкого применения. Сведения о использовании сульфокатионитов для очистки рестриктаз в литературе также встречаются значительно реже, чем о использовании для этих целей фосфоцеллюлозы.

Кроме ионообменных хроматографий некоторые авторы для очистки рестриктаз использовали гидрофобные, особенно после стадии осаждения сульфатом аммония [68]. В качестве гидрофобных сорбентов в случае получения гомогенного препарата Bgl I [124] и функционально очищенных препаратов ЕсоСК I [125] и Sso47 II [126] была использована фенил-сефароза. Элюция проводилась линейно понижающейся концентрацией сернокислого аммония. В работе [68] выход рестриктазы Sso II после проведения гидрофобной хроматографии был 3,6%. Примеров использования гидрофобных сорбентов немного [68,124−126].

Значительно большее распространение для доочистки рестриктаз имеет адсорбционная хроматография на гидроксилапатите [50,52,54,62,72,74−76,78,79,82,98]. Как было сказано выше, использование гидроксилапатита для фракционирования неочищенного экстракта клеток не получило широкого применения, но в случае отсутствия нуклеиновых кислот в наносимых растворах и при элюции с сорбента белков повышением ионной силы можно получать препараты рестриктаз, свободные от примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз [62,74,98]. К тому же, гидроксилапатит имеет большую емкость по белку, что позволяет сконцентрировать ферменты.

При поиске аффинных сорбентов для очистки рестриктаз, по вполне понятным причинам, внимание в первую очередь было обращено на субстрат рестриктаз — ДНК. В ряде случаев для очистки этих ферментов была использована колонка с однонитевой ДНК-агарозой, приготовленной смешиванием расплавленной горячей агарозы с денатурированной дезоксирибонуклеиновой кислотой тимуса теленка по методу Schaller Н. с сотр. [127]. Предполагалось, что с сорбентом будут преимущественно связываться неспецифические нуклеазы, а рестриктазы, субстратом которых является нативная ДНК, окажутся во фракции несорбировавшихся белков [1]. Для некоторых рестриктаз это предположение подтвердилось [1]. Другая часть рестриктаз достаточно прочно связывалась с однонитевой иммобилизованной ДНК и элюировалась в градиенте повышения ионной силы раствора. Как в первом, так и во втором случае наблюдалась значительная очистка этих ферментов от неспецифических нуклеаз [50,95]. В качестве сорбента для очистки рестриктаз нашла применение и нативная ДНК, иммобилизованная в полиакриламидном геле или целлюлозе [114,128]. Несмотря на все преимущества этого способа (хроматографии на иммобилизованной ДНК) достаточно широкого распространения он не получил в силу ряда причин: сорбент относительно дорогой и нестабильный в сравнении с фосфоцеллюлозой Р-П или гепарин-сефарозой, многократное использование которых не приводит к значительному снижению их емкости. Тем не менее, для очистки уникальных рестриктаз, известны способы проведения хроматографии, когда в качестве лиганда используется не природная ДНК, а специально синтезированные олигонуклеотиды. Таким образом были очищены рестриктазы Бок I, I, Ща I [130].

Хроматографическая очистка, основанная на истинной биоспецифической аффинности исключительно к выделяемому белку, достигается при помощи иммуносорбентов. В литературе описано применение такого сорбента для очистки рестриктазы ЕсоЛ I [131]. Авторы этой работы проводили сорбцию фермента на колонке с антителами к ЕсоЯ I, иммобилизованными на сефарозе 4 В, непосредственно из неочищенных экстрактов клеток. В результате последующей элюции в одну стадию им удалось получить гомогенный препарат фермента. Широкому применению иммуносорбентов препятствует то, что для иммунизации (для получения антител при создании сорбента) необходимо исходно располагать гомогенными препаратами рестриктаз, причем — в достаточно больших количествах [131,132].

Поскольку рестриктазы представляют в большей степени практический инструмент молекулярной биологии, то при их очистке в большинстве случаев не стремятся достичь гомогенности конечного препарата. К ним предъявляется основное требование: отсутствие в препаратах примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз, значительно затрудняющих проведение генно-инженерных работ. На ранних этапах экспериментов с рестриктазами их очищали в 50 -100 раз. Получаемые ферменты могли быть использованы для физического картирования молекул ДНК. В дальнейшем, с развитием генно-инженерных работ, требования к препаратам ферментов возросли, что привело к разработке более совершенных способов их очистки. Несмотря на общность схем очистки многих рестриктаз, она является в большей степени кажущейся, чем действительной. Это связано с тем, что в каждом конкретном случае необходим индивидуальный подход, выражающийся в подборе условий проведения той или иной стадии и выборе последовательности их проведения. Тем не менее, по мере накопления данных по выделению и совершенствованию способов очистки, ряд исследователей пытаются создать унифицированные схемы, пригодные для выделения многих рестриктаз без предварительного подбора условий проведения отдельных стадий и их последовательности. Первыми этот подход реализовали Вюк1е Т.А. с сотр. [99]. Их схема включала в себя обработку экстракта клеток полиэтиленимином в присутствии 0,1 М NaCl, последующее высаливание белков сульфатом аммония (70%-ой насышенности), диализ и хроматографическое фракционирование на гепарин-сефарозе. Применение такой процедуры, согласно утверждению авторов, позволило получить препараты большинства из 16-ти исследованных рестриктаз, по уровню функциональной чистоты пригодные для опытов по физическому картированию, а в некоторых случаях и для секвенирования ДНК. Эта схема очистки, с вариациями и введением дополнительных стадий широко используется [70,73,75,77,78].

В 1978 г. Greene P.J. с сотр. [123] предложил методику очистки рестриктаз, включающую последовательное хроматографическое фракционирование экстрактов клеток на фосфоцеллюлозе P-II и гидроксилапатите. Экстракт клеток на первый сорбент наносили без предварительного удаления нуклеиновых кислот. После проведения очистки по обсуждаемой схеме в 13-ти случаях из 16-ти испытанных были получены функционально очищенные препараты исследуемых ферментов, пригодных для использования в качестве аналитических реагентов. Для получения аналогичных препаратов трех остальных ферментов оказалось необходимым ввести дополнительную стадию очистки, заключающуюся в хроматографии на катионите Bio-Rex 70.

К попыткам создания унифицированной схемы очистки рестриктаз можно отнести и работу Baksi К. с сотр. [45], в которой используется прямое фракционирование экстрактов клеток четырех продуцентов рестриктаз различной таксономической принадлежности на голубой сефарозе. Этот метод, с дополнительными стадиями очистки, использовался в последующем и другими авторами [47,76,79].

Анализ литературных данных позволил выявить еще ряд схем очистки, которые применялись с незначительными вариациями условий проведения отдельных стадий. Одной такой схемой является гельфильтрация клеточного экстракта на биогеле А-0,5 м с последующими хроматографиями на ДЕАЕ-целлюлозе и фосфоцеллюлозе P-II [108,133]. В аналогичной другой схеме был изменен порядок использования вышеуказанных ионитов. По этой схеме (гельфильтрация на биогеле и последовательные хроматографии на фосфоцеллюлозе P-II и ДЕАЕ-целлюлозе также была очищена часть рестриктаз [134,135].

При выборе схем очистки рестриктаз важную роль играет компановка (последовательность) стадий и применяемых сорбентов в каждом конкретном случае. И актуальным является вопрос о путях и способах их подбора. Несмотря на относительно большой объем публикаций, посвященных вопросам выделения и очистки tS рестриктаз, данные о том как были подобраны схемы очистки в них практически отсутствуют.

В работе [136] Янулайтис A.A. с сотр. описали подход к выбору последовательности применяемых хроматографических стадий, который заключается в изучении взаимодействия ферментов с сорбентами в статических условиях. Авторы утверждают, что применение статического метода позволяет за короткое время апробировать ряд сорбентов, выбрать среди них наилучшие и спрогнозировать условия элюции в режиме колоночной хроматографии. В более поздней работе [121] эти же авторы, используя статический метод, продемонстрировали выбор сорбентов и их последовательность применения для успешной очистки ряда рестриктаз, в частности — Eco 1301.

Как было отмечено выше, целью очистки рестриктаз в большинстве случаев является получение функционально чистых препаратов ферментов. Основными загрязняющими примесями для рестриктаз являются неспецифические эндои экзонуклеазы и фосфатазы. Для анализа чистоты препаратов существует ряд методик. Наличие примесей эндонуклеаз в препаратах ферментов определяется относительно легко, по изменению канонической картины гидролиза ДНК, наблюдаемой при гель-электрофорезе [137]. Анализ препаратов на примеси экзонуклеаз и фосфатаз является более трудоемким. Для их определения в основном используют тест: рестрикция — лигирование образовавшихся фрагментов ДНК-лигазой — повторная рестрикция [137].

Фермент считается свободным от примесей, если после обработки смеси его рестриктов ДНК-лигазой происходит достаточно полная сшивка фрагментов ДНК с исчезновением канонической картины рестрикции, которая полностью восстанавливается после обработки сшитых фрагментов анализируемым препаратом рестриктазы.

Большинство авторов для анализа получаемых рестриктаз используют вышеперечисленные методы. В литературе существуют описания способов определения примесей в препаратах рестриктаз с использованием радиоактивномеченых фрагментов ДНК. Так, в работе [138] Дегтярев С. Х. и Речкунова Н. И. докладывали о применении олигонуклеотидов, меченых радиоактивным фосфором, для тестирования экзонуклеазной и фосфатазной активности. Авторы утверждают, что предлагаемый ими метод применим для анализа любых рестриктазных препаратов.

Естественно, перед тем как определять количество примесей в препаратах рестриктаз, необходимо определить активность последних. В ряде случаев активность ферментов можно определить уже в грубых экстрактах клеток, но так как в этих экстрактах, как правило, присутствуют неспецифические нуклеазы, точность количественного определения относительна. Большинство авторов определяют точные количества ферментов в частично очищенных образцах рестриктаз и в конечных препаратах. Поэтому раздел описания определения активности ферментов помещен после раздела описания их очистки.

Способы исследования субстратной специфичности ферментных препаратов.

Определение активности препаратов рестриктаз, в свою очередь, претерпело свое историческое развитие. Ряд предложенных и апробированных для определения активности этих ферментов методов в настоящее время не используется. В первую очередь это относится к биологическим методам [129,139], которые трудоемки, имеют низкую точность и большую продолжительность. Был разработан более простой и более информативный биохимический способ определения активности рестриктаз, основанный на разделении продуктов реакции (фрагментов ДНК), различающихся по длине, электрофорезом в агарозных гелях. В первых вариантах применения этого метода визуализацию разделенных фрагментов ДНК проводили авторадиографией [140] или путем окрашивания акридиновым оранжевым [139].

Апробация для окраски этидиума бромистого, дающего при освещении гелей ультрафиолетовым светом флуоресцирующие зоны ДНК, Sharp Р.А. с сотр. [23] продемонстрировала высокую чувствительность детекции ДНК и способствовала повсеместному применению электрофоретического метода для оценки активности рестриктаз.

В качестве субстратов для определения активности были апробированы различные ДНК: Col EI [95], вируса OB 40 [141], кольцевые молекулы фага лямбда (кольца Херши) [142] и другие. В литературе описан и спектрофотометрический метод определения активности рестриктаз, нашедший применение в экспериментах по очистке этих ферментов [121,136]. В качестве субстрата в этом случае используется нативная ДНК, иммобилизованная на целлюлозе. Под действием рестриктаз ДНК высвобождается с матрицы и ее количество замеряется в растворе при длине волны 260 нм спектрофотометрическим способом в условных единицах.

В настоящее время в мировой практике общепринято за единицу активности считать минимальное количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага X (или другой субстратной ДНК) за 1ч инкубации в соответствующей реакционной смеси и температуре, оптимальной для проявления ферментативной активности исследуемой рестриктазы [137,143−145].

Для различных рестриктаз используются различные реакционные смеси, варьирующие по величине ионной силы, значениям рН и т. д. Для большинства часто используемых рестриктаз в настоящее время подобраны оптимальные составы, позволяющие проявлять ферментам свою максимальную активность [137,143−145].

Основной характеристикой рестриктаз является их субстратная специфичность. Определение ее обычно проводится в два этапа: на первом определяют сайт узнавания, а затем — устанавливают место расщепления ДНК. Сайт узнавания можно определить и у частично очищенного фермента (даже на стадии грубого экстракта клеток), тогда как для определения места расщепления ДНК, необходим высокоочищенный препарат. При определении субстратной специфичности первых обнаруженных рестриктаз в основном применялись только прямые биохимические методы анализа. Задача определения специфичности тогда сводилась в один экспериментопределение первичной структуры концевых участков по месту расщепления субстрата [146−148].

С расширением спектра ферментов появились косвенные методы определения сайтовой специфичности. В их развитии основную роль сыграло:

1)появление большого числа охарактеризованных рестриктаз и накопление данных об основных типах построения узнаваемых участков;

2)установление первичной структуры ДНК ряда небольших вирусов и плазмид;

3)использование вычислительной техники.

Суть самого простого из косвенных методов, так называемого метода визуального сравнения, заключается в сопоставлении результатов расщепления одних и тех же субстратов известной и исследуемой рестриктазами. Для подтверждения предполагаемой субстратной специфичности применяют совместную обработку субстрата исследуемым ферментом и предполагаемым прототипом (в случае доступности). Этот метод широко применяется для установления специфичности вновь найденных рестриктаз.

Параллельно и в дополнение к методу визуального сравнения широко используется метод картирования ДНК [4]. Этот метод, широко используемый в молекулярной генетике, нашел свое применение в исследованиях специфичности рестриктаз благодаря определению первичной структуры ряда ДНК-стандартов — небольших фагов и плазмид [149−152]. Если на этапе сравнения экспериментально полученной рестриктограммы с картинами каталога [143] или расчетными иллюстрациями, сделано предположение о сайтовой специфичности исследуемого фермента, то для его подтверждения может быть использован метод картирования. В этом случае предполагаемые координаты расщепления субстрата исследуемой рестриктазой бывают известны и поэтому величины и число фрагментов совместного расщепления с какой-либо известной рестриктазой можно получить расчетным путем. Совпадение расчетных и экспериментальных данных будет указывать на правильность предварительного вывода.

Fuchs С. с сотр. [153,154] были разработаны таблицы частоты встречаемости палиндромных тетрануклеотидных-гексануклеотидных последовательностей в ДНК некоторых вирусов, фагов и плазмид, при помощи которых при экспериментальном определении частоты расщепления исследуемым ферментом нескольких стандартных ДНК можно предсказать сайтовую специфичность используемого фермента.

Несколько позже аналогичные таблицы для ДНК плазмиды pBR 322 были разработаны Мазановым А. Л. с сотр. [155]. После того, как была установлена первичная структура ДНК фага X [151], большим подспорьем в таких экспериментах явились таблицы, составленные для этого субстрата.

С применением косвенных методов удается определить только первичную структуру узнаваемой последовательности. Для того чтобы установить место расщепления фосфодиэфирной связи, необходимо использовать прямые методы структурного анализа ДНК. Для определения субстратной специфичности первой открытой рестриктазы II типа — Hind II [147] было использовано введение метки в 5'-концы рестриктов ДНК при помощи полинуклеотидкиназы фага Т4 с последующим анализом их структуры. Меченые фрагменты обрабатывали ферментами (фосфодиэстеразой змеиного яда, панкреатической ДНКазой) до мононуклеотидов, ди-, три-, тетра-олигонуклеотидов и определяли первичную структуру каждого. Анализ 3'-концевого динуклеозидмонофосфата, полученного гидролизом равномерномеченых ДНК-рестриктов микрококковой нуклеазой, позволил установить З'-концевую структуру Hind II фрагментов. На основе совокупности полученных данных оказалось возможным определить последовательность нуклеотидов, узнаваемую исследуемым ферментом, и также место расщепления субстрата. Аналогично была определена субстратная специфичность рестриктаз EcoR I, Hind III, EcoR II и ряда других. Рассмотренные выше аналитические приемы отличались громоздкостью и трудоемкостью.

Разработке метода «отпечатков пальцев» (fingerprint) способствовало появление и накопление данных о поведении коротких олигонуклеотидов в различных условиях тонкослойной хроматографии и электрофореза. Суть этого метода заключается в последовательном двумерном разделении продуктов статистического эндонуклеазного гидролиза исследуемого олигонуклеотида, содержащего концевую изотопную метку, при помощи сначала электрофореза, потоманионообменной хроматографии в тонком слое ДЕАЕ-целлюлозы. Перед этим ДНК расщепляют исследуемой рестриктазой и вводят в образовавшиеся концы фрагментов изотопную метку. После авторадиографии, по относительному расположению радиоактивных пятен и с учетом правил интерпретации сдвигов продуктов гидролиза определяется первичная структура исследуемого олигонуклеотида.

Благодаря простоте исполнения и информативности, метод фингерпринтирования широко применялся для анализа специфичности рестриктаз: Alu I [156], Bal I [41], BamH I [157], Mbo I [158], Sal I [42], Sau3AI[43], Slal[46] и др.

В последние годы при исследовании мест расщепления ДНК рестриктазами используют метод секвенирования. Одной из первых рестриктаз, для определения места расщепления которой был применен этот подход, следует считать рестриктазу Pst I [159]. Тогда был использован метод, разработанный Sanger F. и Coulson A.R. [150], адаптированный для применения в отношении определения места расщепления рестриктаз Brown N.L. и Smith M. [159]. В основе метода заложена стратегия, позволяющая получать меченые продукты матричного копирования исследуемого ДНК-фрагмента в лимитирующих условиях (плюс-минус реакция). Этот метод и в настоящее время не утратил свое значение [72−75], хотя и уступил свои позиции более простым и эффективным методам секвенирования. Был разработан метод «терминирующих аналогов» трифосфатов (метод Сенгера) [160]. Другой метод секвенирования, основанный на химической модификации ДНК, был разработан, в основном, благодаря усилиям Maxam Е.М. и Gilbert W. [161]. Оба эти метода незамедлительно стали применяться и для изучения специфичности рестриктаз. Принципиально они отличаются только способами получения статистического набора меченых фрагментов, последующее разделение которых в полиакриламидном геле в конечном итоге приводит к образованию «структурной лесенки». Перед этим при помощи рестриктаз вырезали из молекулы ДНК фрагмент длиной 50−300 пар нуклеотидов, содержащий сайт расщепления для исследуемого фермента, и затем проводили его структурный анализ с параллельным гидролизом рестриктазой. При наложении вновь образовавшихся фрагментов на структуру исходного вычисляли нуклеотиды, остающиеся на их концах, т. е. места расщепления [80,81]. При помощи этих методов была определена специфичность многих рестриктаз [69−79].

В дальнейшем способы определения мест разрезания подвергались некоторым модификациям. Одна из них [162] заключается в использовании фрагмента Кленова вместо ДНК-полимеразы фага Т4 для введения изотопной метки в фрагмент ДНК, содержащий участок расщепления для исследуемой рестриктазы, который затем обрабатывали по Максаму-Гилберту. По утверждению авторов, преимущество данного метода состоит в наглядности результатов и в том, что для определения места расщепления достаточно следовой активности фермента. В литературе также описаны способы, когда фрагмент ДНК, содержащий участок разрезания исследуемой рестриктазы, синтезируется искусственно, а не вырезается из исходной [163,164]. Этот способ, основанный на использовании синтетических субстратов, используется относительно редко.

Для полноты обзора следует отметить, что в литературе описаны способы клонирования генов, ответственных за биосинтез ферментов систем рестрикции-модификации [117,123,165−167]. Это примеры получения чужеродных для реципиентных прокариотических клеток белков «прокариотической» природы. Клонирование генов систем рестрикции-модификации используется для создания штаммов-суперпродуцентов данных ферментов, для замены патогенных штаммов-продуцентов на непатогенные продуцирующие клетки.

Таким образом, в представленном разделе обзора, на примере получения ферментов прокариотических клеток — эндонуклеаз рестрикции, рассмотрены основные приемы выявления ферментативной активности при поиске штаммов — продуцентов биологически активных веществ, способы очистки целевых белков и методы их характеризации по функциональной чистоте и специфичности, т. е. по свойствам, важным для практического применения.

Так как развитие генно-инженерных работ требует постоянного расширения спектра доступных ферментов, методы получения последних постоянно совершенствуются и проводится поиск новых перспективных штаммов-продуцентов.

Очевидно, что создание истинно универсальных схем, пригодных для выделения и очистки многих рестриктаз, является малореальной задачей. Однако, работы по апробации схем очистки, пригодных хотя бы для групп рестриктаз, следует отнести к прогрессивным тенденциям препаративной биохимии этих ферментов [4]. Их разработка и применение призвано способствовать выбору схем очистки новых рестриктаз, выявлению общностей и различий в хроматографическом поведении этих ферментов, что имеет не только практическое, но и теоретическое значение. у.

Получение рекомбинантных белков.

Развитие работ в области рекомбинантных ДНК, в значительной мере обусловленное разработками методов получения препаратов сайт-специфических эндодезоксирибонуклеаз, открыло принципиально новые возможности в производстве прокариотических и эукариотических белков. Особенно важное значение это имеет при создании биологически активных веществ медицинского назначениялекарственных препаратов нового поколения, генно-инженерных вакцин и др.

Способы создания штаммов-продуцентов рекомбинантных белков.

В отличие от природных продуцентов прокариотических белков, способы и методы выявления которых рассмотрены в предыдущей главе на примере обнаружения штаммов — продуцентов эндонуклеаз рестрикции, штаммы для биосинтеза эукариотических белков создаются искусственно, путем трансформации компетентных клеток специально сконструированными плазмидами, содержащими гены, кодирующие биосинтез целевых белков. Как отмечалось выше, создание таких рекомбинантных плазмид во многом обязано открытию ферментов — эндонуклеаз рестрикции, способы получения которых рассмотрены выше. Конструированию плазмид, содержащих клонируемые гены, посвящено большое количество работ, основы и техника их создания описаны в ряде обзоров и практических руководств [2,168−174].

Темпы роста создания штаммов — продуцентов белков значительно опережают завершение разработок технологии выделения целевых продуктов. По некоторым оценкам, разработка эффективной технологии выделения и очистки целевого продукта, получаемого микробным синтезом, составляет до 90% его коммерческой стоимости [175].

К сожалению, в работах по созданию плазмид, содержащих клонируемые гены, и по созданию штаммов-продуцентов белков, мало внимания уделяется изучению стабильности созданных плазмид и рекомбинантных штаммов. Известно, что плазмиды могут подвергаться процессам мутационной изменчивости, делециям и просто элиминации из клеток [173]. В работе [176] авторы отмечали, что при культивировании продуцентов гибридных белков, состоящих из фактора некроза опухолей-альфа и тимозина а-1, наблюдалось появление плазмид, уменьшенных по размеру. В результате этого продукция по целевому белку в клетках значительно снижалась. При сегрегационной нестабильности (при элиминации плазмид), безплазмидные клетки имеют селективное преимущество в скорости размножения, результатом чего является также снижение продуктивности клеточной массы [173,176,177].

Сегрегационная стабильность определяется способностью клеток правильно распределять плазмиды между дочерними клетками в процессе деления. При нарушении механизма распределения может происходить потеря целых плазмид [177]. При культивировании штаммов, содержащих рекомбинантные плазмиды, следует учитывать как сегрегационную, так и структурную стабильность. Стабильность рекомбинантных плазмид в популяции зависит от многих факторов: генетического контроля репликации и сегрегации, несовместимости, скорости роста клеток, условий культивирования [177]. Как было сказано выше, клетки, утратившие плазмиды, при размножении вскоре опережают в росте клетки, содержащие плазмиды.

Высокий уровень накопления «чужеродного продукта» в клетках — хозяевах часто обуславливается инициацией транскрипции сильным промотором и наличием в каждой клетке большого числа копий гетерологичного гена. Также важна контролируемость экспрессии гена, поскольку синтез рекомбинантных продуктов является метаболической нагрузкой для клеток. В работе [178] при клонировании гена метилазы BspR I под контролем PtaC промотора авторы отметили, что после индукции промотора продукция по метилазе составляла 2−4% от суммарного клеточного белка, но рост клеток прекращался.

Строгий контроль экспрессии позволяет сначала получить большую биомассу клеток, не экспрессирующих гетерологичный ген, с последующим появлением небольшого числа поколений со включенной экспрессией этого гена.

В первых экспрессирующих плазмидах для запуска транскрипции использовали сильные метаболические trpили lac-промоторы, а рекомбинантный ген встраивали за участком промотор-оператор. Однако, при использовании систем метаболической регуляции, контролирующих работу этих оперонов, было обнаружено, что экспрессия плазмидных генов была скорее конститутивной, чем контролируемой [179], и в результате при выращивании клеток плазмиды утрачивались. В настоящее время для контроля транскрипции используются различные промоторы, в том числе: тандем промоторов А2 и A3 фага Т7 [180,181], триптофановый промотор [182] или тандем триптофановых промоторов [183,184]. В работах [176,180,181] под контроль тандема промоторов А2 и A3 фага Т7 встраивали гены, кодирующие биосинтез ФНО-альфа и ФНО-бета и наблюдали хорошую экспрессию рекомбинантных белков. В работе [182] авторы встраивали ген ФНО-альфа под контроль триптофанового промотора и, после трансформации клеток штамма E. coli НВ 101 и индукции промотора индолилакриловой кислотой, наблюдали продукцию целевого белка до 10% от суммы растворимых клеточных белков. В работе [184] ген, кодирующий биосинтез ФНО-альфа, был встроен под контроль тандема триптофановых промоторов и получена экспрессия ФНО-альфа до 8 мг с 1 л культуры. Аналогичная ситуация представлена в работе [183] при клонировании гена, кодирующего биосинтез интерферона альфа-2.

Известны подходы, когда использовались плазмиды с терморегулируемой системой репликации [177,179], с использованием промоторов Pr и Pi фага X. Особенность этих векторов состоит в том, что они содержат две точки начала репликации: при начале репликации с одной из точек (при температуре ниже 34 °С) образуется низкое число копий плазмиды, при начале репликации с другой (при подъеме температуры до 38−42 °С) — большое число копий [185]. Таким образом, существует возможность нарастить большое количество биомассы клеток, затем «включить» экспрессию чужеродного гена.

Выбор используемых промоторов для экспрессии встроенных генов определяется как теоретическими предпосылками [186−189], так и возможностями и традициями коллективов, создающих конструкции рекомбинантных плазмид, и в каждом конкретном случае подбирается индивидуально [177,179]. В целом число работ по изучению конструирования генов и содержащих их плазмид, значительно превалирует над числом работ по изучению стабильности создаваемых рекомбинантных штаммов-продуцентов. Обусловлено это, вероятно, в большей степени постановкой задачи по расшифровке структуры клонируемых генов и изучению способов их проявления. Прикладные аспекты по созданию стабильных штаммов-продуцентов и изучению условий их культивирования в литературе описаны в меньшей степени. В том небольшом количестве работ, где описывается культивирование штаммов-продуцентов, в частности указывается, что для наработки целевых белков желательно использовать полные (не лимитированные по составу) среды. В работе [190] авторы рекомендуют для повышения продуктивности клеток по биосинтезу интерферона альфа-2 в конце культивирования лимитировать рост клеток понижением температуры ферментации до 20° С.

Способы получения и очистки рекомбинантных белков.

Разработка методов очистки зависит от местонахождения синтезируемых белков (внутри или вне клетки), их агрегатных состояний в клетке (в растворимой форме или в тельцах включения) и ряда других факторов. Гибридные гены можно конструировать таким образом, что детерминируемые ими чужеродные белки будут локализоваться либо в цитоплазме клеток E. coli, либо будут секретироваться наружу через клеточную мембрану, если лидерную последовательность встроить перед кодирующей. Конструкции с секретируемыми белками применяются либо при биосинтезе таких веществ, которые накапливаясь в клетках, вызывают их гибель (токсинов и т. п.), либо при биосинтезе белков, которые подвергаются значительной степени деградации клеточными протеазами. В литературе описаны способы получения полипептидов как секретирующихся в культуральную среду, так и накапливающихся в клетках. С целью выбора методов выделения и очистки целевых белков пути их биосинтеза можно представить в виде схемы:

Синтезируемые белки.

4, I.

Секретируемые Внутриклеточные.

4, 4.

Растворимые В виде телец включения.

В зависимости от изначальных условий планируют стратегию очистки целевых продуктов. В случае белков, секретируемых в культуральную жидкость, используют такие распространенные методы выделения как: ультрафильтрация с использованием специальных ячеек и колонок с полыми волокнами, осаждение сульфатаммонийными растворами различных концентраций, фракционирование растворами спиртов и органических растворителей и т. д. Первое широко применяется при получении ферментов (нуклеаз, протеаз и др.), второе — для разделения альбуминов, глобулинов. Как правило, в культуралной жидкости содержится небольшое число разновидностей белков и процессы очистки не представляют значительных сложностей.

Примеры получения белковых препаратов, секретируемых в культуральную жидкость подробно рассмотрены в обзоре [179].

В большинстве случаев используются конструкции рекомбинантных плазмид и клеток, когда синтезируемые чужеродные для клеток белки накапливаются в цитоплазматическом пространстве. В этих случаях, как правило, белки могут накапливаться в более значительных количествах (до 25−40%) [191].

В соответствии с исходными агрегатными состояниями подбираются условия их выделения и очистки. Но первоначальная стадия (разрушение клеточных стенок для извлечения содержимого) используется и в том и в другом случаях. Для этого применяются способы, рассмотренные в разделе лит. обзора по получению ферментных препаратов: осмотический шок, обработка суспензии клеток лизоцимом в сочетании с детергентами, ЭДТА, дезоксихолиевой кислотой и др. Но и в этом случае наибольшее распространение получил такой способ как обработка суспензии клеток ультразвуком [179].

Для очистки рекомбинантных белков, находящихся в клетках в растворимом виде, используют разработанные и ставшие традиционными методы препаративной биохимии, подробно рассмотренные в предыдущей главе обзора. В качестве примеров очистки растворимых форм белков рассмотрим получение таких препаратов как факторы некроза опухолей альфа и бета.

Факторы некроза опухолей альфа и бета (ФНО-альфа и ФНО-бета) относятся к цитокинам, большой группе эндогенных медиаторов и обладают широким спектром биологических активностей [192,193].

ФНО-альфа человека (кахектин) обладает цитотоксическими или цитостатическими свойствами для ряда линий опухолевых клеток, участвует в проведении иммунного клеточного ответа, в воспалительных реакциях, в гемопоэзе, влияет на рост и дифференцировку клеток и обладает множеством других биологических функций [192−216]. Все это делает его весьма перспективным для применения в медицине. Вследствие этого требуются значительные количества препарата, т. е. необходима технология его производства. Количество зарубежных фирм, исследующих и разрабатывающих ФНО, возрастает с каждым годом.

Препараты находятся на разных стадиях клинического изучения. Разрабатываются подходы к снижению системной токсичности ФНО путем замены аминокислот в его структуре [180,217−219], что позволит увеличить максимально-переносимые дозы и достичь высокого противоопухолевого эффекта в клинике. В работе [220] авторы показали, что при замене Arg на Gin в 31-ом положении на аминокислотной последовательности молекулы ФНО-альфа, получаемый препарат в экспериментах in vitro имел меньшую (в три раза) токсичность по отношению к нормальным человеческим клеткам (культура диплоидных фибробластов человека L 68) в сравнении с исходным ФНО-альфа.

ФНО-бета (лимфотоксин) имеет значительную степень гомологии с ФНО-альфа (до 35%) и связывается с теми же клеточными рецепторами. Это определяет сходство их биологического действия на клетки. Однако, сродство к рецепторам этих цитокинов разное и это может быть объяснением качественных и количественных различий в действиях ФНО-альфа и ФНО-бета [192,193,221]. ФНО-бета имеет ряд своих специфических эффектов для применения в медицинской практике [222]. Более подробно современное состояние разработок и перспективы использования ФНО-бета представлены в опубликованном нами обзоре [223].

Оба этих белка чрезвычайно перспективны для применения в медицине и к настоящему времени в России завершаются доклинические испытания ФНО-бета [224] и проводятся клинические испытания ФНО-альфа.

Методы получения и очистки препаратов факторов некроза опухолей имеют свое развитие по оптимизации как конструкций плазмид, так и процессов выделения целевых белков.

Так, например, фактор некроза опухолей бета (лимфотоксин) первоначально был получен по способу, описанному в работе [225], когда для его выделения был использован природный источникактивированная лимфобластная линия клеток человека RPMI-1788. Способ включал в себя концентрирование межклеточной жидкости, хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе, препаративное изоэлектрофокусирование, хроматографию на лектин-сефарозе и препаративный электрофорез в полиакриламидном геле. Из 294 л клеточной культуры получили 25 мкг электрофоретически гомогенного белка, что составило около 11% от исходного содержания ФНО-бета. Выход по активности составил 0,97×10 Б.

Техника рекомбинантных ДНК позволила упростить процедуру получения ФНО-бета и сделать препарат доступным для широкомасштабных исследований. Авторы работы [226] использовали штамм E. coli М15, трансформированный плазмидой pDS78/RBSll, кодирующей биосинтез ФНО-бета. Для экспрессии гена проводили индукцию лактозного оперона изопропил-1-тио-бета-Д-галактозидом. ФНО-бета очищали из экстракта клеток при помощи двух последовательных хроматографий на ДЕАЕ-сефарозе и S-сефарозе с последующим осаждением сульфатом аммония. Из 60 г клеток (10 л среды) авторам удалось получить 10 мг электрофоретически гомогенного рекомбинантного ФНО-бета (рФНО-бета). В работе [227] предложен способ очистки, включающий использование хроматографии вначале на ДЕАЕ-целлюлозе, а затем на детоксигеле. Источником ФНО-бета служил штамм E. coli HB 101, трансформированный плазмидой pGG 402, содержащей ген целевого белка под контролем триптофанового промотора. Индукцию гена осуществляли с помощью индолилакриловой кислоты. Полученные клетки содержали ФНО-бета до 34% от общей массы клеточных белков. Высокое содержание целевого полипептида в биомассе позволило очистить белок практически за одну стадию. Последующая хроматография на колонке с детоксигелем была использована для удаления примесей бактериального эндотоксина. Выход лимфотоксина в этом процессе составил около 8 мг из 1 л клеточной культуры. В работе [228] сообщается о еще большем содержании ФНО-бета в биомассе при использовании плазмиды pETlld-TNF-b и реципиентного штамма E. coli BL21. Содержание ФНО-бета достигало 80% от суммарного клеточного белка, тогда как при использовании в качестве клеток-хозяев штамма E. coli 7118 — 17%. Но достичь такого высокого содержания целевого белка удается только в небольших объемах среды для культивирования и, следовательно, для небольших количеств биомасс, т. е. в аналитических вариантах. Предложенные в работе [229] процедуры получения и очистки ФНО-бета многостадийны, трудоемки и требуют дорогостоящих сорбентов для хроматографий. В одной из последних работ для получения препарата ФНО-бета [230] Денисов A.A. с сотр., используя рекомбинантный штамм E. coli SG 200−50/pLT21,предложили трехстадийную схему очистки:

ЭкстрактГель-фильтрация Хроматография на Хроматография на клеток G-150 ДЕАЕ-сефадексе КМ-сефадексе.

При использовании этой схемы они получали до 10 мг препарата за одну процедуру (из 4 л клеточной суспензии штамма-продуцента) и достигали степени его очистки в 96,7 раза. Это значение свидетельствует о низком содержании ФНО-бета в исходной клеточной массе, следовательно — неоптимальных условиях культивирования. Стадия гель-фильтрации на сефадексе G-150 грубого экстракта клеток трудномасштабируема и неоптимальна. В то же время для производства препарата (до 100 мг и выше) требуется масштабируемый процесс и большие количества биомассы.

Аналогичное историческое развитие претерпел и процесс получения и очистки препарата ФНО-альфа. В одной из последних работ [231] описан способ его получения по схеме:

Совмещенная.

Экстрактмикро-хроматография Хроматография Гельклеток фильтрация на Н-(у-геле и на Р-(у-геле) фильтрация.

ЗАЕ-(у-геле) G-25.

В результате из 14 г клеток авторы получили 130 мг высокоочищенного белка. Однако, приведенная ими схема трудоемка, особенно — начальная стадия (продавливание относительно вязкого экстракта клеток через фильтры с малым диаметром пор (45 мкм), которая требует специального оборудования.

Таким образом, оптимизация процедур получения рекомбинантных белков, в частности — факторов некроза опухолей, является актуальной задачей.

Итак, на примерах наработки и очистки факторов некроза опухолей мы рассмотрели способы получения эукариотических белков, которые синтезируются в клетках в растворимом виде. Как следует из обзора, для их выделения используются ставшие традиционными способы препаративной биохимии — ионообменные хроматографии, гель-фильтрация, электрофорез.

В ряде случаев используют биосинтез гибридных белков, когда целевой белок синтезируется в комплексе с другим белком (их гены находятся в одной рамке считывания), для которого разработаны методы хроматографии на аффинном сорбенте. В качестве примера можно привести биосинтез гибридного белка: пре-82-белок вируса гепатита В + {3-галактозидаза (пре-82-Р-гал) и его очистку на колонке с иммобилизованным аналогом субстрата (п-аминофенил-Р-Д-галактозид) с последующим отщеплением целевого белка [232].

Как отмечалось выше, многие полипептиды, экспрессируемые в цитоплазму, образуют малорастворимые агрегаты [179], и в этом случае для работы с ними требуются специальные методы перевода их в растворимое состояние. Нерастворимые рекомбинантные белки обычно накапливаются в клетках Е. соН в виде дискретных включений, которые можно увидеть при использовании фазово-контрастного микроскопа. Как правило, первая стадия очистки таких включений заключается в отмывке их от растворимых белков. Для этого используют разрушение клеток в буфере и отделение включений осаждением при помощи центрифугирования [179]. Так как одновременно осаждаются и клеточный дебрис и обломки мембран, содержащие целый комплекс белков (в том числе — протеазы), для отмывки телец включений от последних (перевода их в надосадочную фракцию) вводят в буфер солюбилизирующие агенты: Тритон Х-100, ЭДТА. В ряде случаев для отмывки включений используют растворы мочевины. различных концентраций. Концентрацию мочевины в растворе для отмывки в каждом случае подбирают индивидуально, с целью не допустить значительных потерь целевого белка. В обзоре [179] описан пример подбора концентраций растворов мочевины для отмывки включений, обеспечивающих минимальную степень растворения целевого белка при максимальном освобождении его от сопутствующих. Отмывке белковых включений перед ренатурацией целевых белков уделяется особое внимание, так как белковые примеси могут оказывать влияние на эффективность растворения, расщепления и восстановления исходной (нативной) конформации рекомбинантных белков [179].

Для растворения белковых включений используют различные реагенты. В работе [179] основные из них представлены в виде таблицы (табл.1).

Таблица 1.

Реагенты, обеспечивающие выход эукариотических полипептидов из нерастворимых включений в раствор

Реагент Растворяемый эукариотический полипептид.

Гуанидин-НС1 (5−8 М) Аи В-цепи инсулина.

Гормон роста крупного рогатого скота.

Урокиназа.

Мочевина (6−8 М) Прохимозин уинтерферон.

Гормон роста лосося.

Додецилсульфат натрия уинтерферон.

Интерлейкин-2.

Щелочной рН (>9,0) Прохимозин.

Гормон роста цыпленка.

Ацетонитрил/пропанол ге§ А-белок фага Т4.

Такие денатурирующие агенты, как мочевина и гуанидинхлорид, нарушают водородные связи и ионные взаимодействия. Нативные белки, подвергающиеся воздействию высоких концентраций этих растворителей, оказываются полностью развернутыми, но ковалентные связи, в том числе — дисульфидные мостики, остаются интактными.

При экстремальных значениях рН нарушаются ионные взаимодействия между полипептидными цепями, а детергенты и органические растворители разрушают гидрофобные связи между боковыми частями полипептидов. Эффективность солюбилизации белков каждым из вышеперечисленных агентов может варьировать. Это происходит вследствие того, что взаимодействия между белками в нерастворимых включениях неодинаковы, поскольку зависят от того, какие именно белки входят в их состав [179]. Ряд полипептидов в растворе с денатурирующими агентами сохраняют способность к агрегации, так как имеют внутримолекулярные ковалентные связи, такие, как дисульфидные мостики. Если необходимо полностью разрушить эти связи, к солюбилизирующему агенту добавляют восстановители тиоловых групп — дитиотреитол или 2-меркаптоэтанол.

Другой метод, который может быть использован для разрушения внутримолекулярных дисульфидных связей — получение их производных в форме 8-сульфонатов, с последующим восстановлением при ренатурации. Такой подход был использован, в частности, при получении А-и В-цепей инсулина [233].

Следует отметитить, что на конечный выход белка при его ренатурации могут влиять многие параметры реакции его растворения солюбилизирующнми агентами [179], некоторые из них перечислены ниже: а) значение рН, б) температура раствора при денатурации, в) время воздействия растворителя, г) ионный состав растворителя, д) концентрация растворяющего агента, е) концентрация суммарного белка, ж) соотношение: растворитель/белок, з) наличие или отсутствие тиоловых реагентов, и) модификация тиоловых групп (при образовании Б-сульфонатов). После солюбилизации эукариотических полипептидов осуществляется их ренатурация в буфере, не содержащем денатурирующих агентов или других солюбилизаторов. Чтобы достичь этого обычно используют диализ или разбавление [179,232 241]. Путем разбавления можно контролировать одновременно изменения концентрации растворителя и гетерологичного полипептида. При ренатурации (путем разбавления или диализа) также имеется ряд параметров, влияющих на выход получаемого активного белка: а) скорость перехода от условий солюбилизации к условиям ренатурации, б) степень чистоты полипептида, в) концентрация полипептида в растворе, г) значение рН процесса, д) ионный состав растворителя, е) наличие или отсутствие тиоловых реагентов и ряд других. Существуют методики ренатурации белков, состоящие из двух стадий: на первой стадии белки принимают конформацию, близкую к нативной, а на второй — процесс ренатурации завершается полностью [179].

Примером этого может служить процесс перевода прохимозина из 8 М мочевины в буферный раствор при значении рН 10,7, затем, после 15−30 мин инкубации значение рН доводится до 8,0 и раствор выдерживается до завершения ренатурации при этом значении [232].

Другой подход — перевод растворенных белков в раствор с низкой концентрацией мочевины, где происходит частичная ренатурация [179].

Исследованию процессов ренатурации, зависимости ее от температуры, состава растворов, чистоты препаратов и других параметров посвящено значительное число публикаций [179,232−235, 240,241 и др.]. При анализе их можно сделать выводы, что все белки в процессах денатурации и ренатурации имеют свои особенности, но существуют и общие условия для повышения их выходов.

Установлено, что важное значение при ренатурации имеет степень чистоты выделяемого полипептида.

Примеси могут препятствовать процессу ренатурации, образуя комплексы, а при наличии примесей протеаз в растворе, в процессе ренатурации произойдет деградация целевого белка и как следствиеего значительные потери. Поэтому, если не удается отмыть тельца включения от примесных белков до их растворения, проводят очистку полипептидов в присутствии некоторых растворителей до их ренатурации. Для этого обычно используют ионообменные хроматографии в присутствии мочевины. Гуанидинхлорид несет электрический заряд и препятствует процессу ионообменной хроматографии, но не препятствует проведению гель-фильтрации. Другие методы, используемые некоторыми авторами для очистки полипептидов перед их ренатурацией — это высокоскоростное центрифугирование, экстракция органическими растворителями и др. 179]. Так, в работе [240] авторы для извлечения интерферона-гамма использовали 50%-ный раствор пропанола и достигали на этой стадии выхода по целевому белку 39,6% при его очистке в 10 раз.

В процессе ренатурации белка одним из определяющих параметров является его концентрация, поскольку необходимо, чтобы внутримолекулярные взаимодействия преобладали над межмолекулярными. В работах [240,241], при исследовании процесса ренатурации интерферона-гамма показано, что если при концентрациях белка ниже 0,3−0,5 мг/мл ренатурация проходит довольно успешно, то при концентрациях выше 0,3−0,5 мг/мл белок ренатурирует не полностью.

Особенно существенна концентрация белка в тех случаях, когда его молекулы содержат дисульфидные связи. В случаях разрушения дисульфидных связей в нерастворимых белковых включениях при использовании тиоловых реагентов или при образовании производных 8-сульфонатов, восстановление правильных дисульфидных связей достигается применением смесей восстановленных и окисленных реагентов, таких как глутатион. Для этого подбираются оптимальные концентрации и соотношение восстановленного и окисленного реагентов. При значении рН ренатурирующего буфера, равном 8,0 и выше, тиоло-дисульфидный обмен происходит быстро. При высоких значениях рН обмен тиоловых и дисульфидных групп может происходить и в отсутствии экзогенных тиоловых реагентов, источником свободных тиоловых групп может служить сам белок [179].

Большое значение в процессе ренатурации имеет состав и концентрация буферов. В работах [240,241] авторы отмечали негативное влияние фосфатов и других двух-, трехвалентных кислотных остатков на восстановление нативной конформации интерферона-гамма.

Основную роль при ренатурации играет, естественно, природа и структура самого целевого белка. Так например, ß—эндорфин (короткий полипептид) может сам спонтанно ренатурировать в процессе выделения, для кальцитонина человека (32 аминокислотных остатка, из них — два цистеина) необходим подбор условий ренатурации [179], а получение? -глобина из гибридного белка, синтезированного в клетках E. coli — пример процесса очистки полипептида, находящегося в денатурированном состоянии [236]. Последний в виде гибридного белка вначале был очищен при помощи ионообменной хроматографии в присутствии 8 М мочевины, а затем — с помощью гель-фильтрации в присутствии 5 М гуанидинхлорида.

О влиянии природы и структуры белков на их растворимость (денатурацию-ренатурацию) свидетельствуют результаты работы [237], где авторы получали укороченные варианты интерферона-гамма и показали, что укороченные молекулы интерферона-гамма синтезируются уже в нативном состоянии и не требуют при выделении процесса ренатурации. В работе [238] авторы отметили, что на растворимость интерферона-гамма в значительной степени влияют замены аминокислот на С-конце.

После проведения ренатурации белков, получаемых из телец включения, при необходимости они доочищаются методами, ставшими традиционными для очистки растворимых белков (хроматографии на ионообменных и др. сорбентах, гель-фильтрация и т. д.).

Наряду с получением прои эукариотических белков путем наработки их при помощи рекомбинантных клеток, проводятся аналогичные работы по получению белков вирусных оболочек с целью создания генно-инженерных вакцин. В работе [242] Edman J.C. с сотр. описали способ получения белков вируса гепатита В в прокариотических клетках (E.coli). Практически одновременно появились работы о клонировании генов, кодирующих поверхностный белок гемагглютинин вируса гриппа [243], VP-I полипептид вируса ящура [244] и ряда белков других вирусов. Однако, создание генно-инженерных вакцин осложнено рядом особенностей и трудностей. Основная трудность заключается в том, что капсидные вирусные белки построены, как правило, из нескольких полипептидных цепей, формирование которых в клетке происходит путем морфопоэза с участием дополнительных белковых факторов, процессинга и модификации в условиях взаимодействия с клеточной или вирусной мембраной и липидами [245]. Генно-инженерные вакцины первого поколения содержали полноразмерные гены белков оболочек вирусов, создание их отличалось трудоемкостью и значительными затратами. По мере накопления знаний о природе вирусов, особенностях проявления иммунного ответа и др., стало ясно, что за иммуногенность отвечают не полные белки, а их участки (полипептиды). Поэтому генно-инженерные вакцины второго поколения содержат полипептиды, несущие главные антигенные детерминанты. Эксперименты с вирусами ящура, гриппа, гепатита В и аденовирусов [245−247] свидетельствуют о том, что химически синтезированные или полученные путем протеолиза короткие олигопептиды, соответствующие антигенным детерминантам, сами по себе обладают иммуногенной активностью, которая при определенных обстоятельствах может приближаться к иммуногенности интактного вируса. Такие химически синтезированные вакцины успешно применяются, они безопасны, не обладают побочным действием, но весьма дороги, поскольку короткие олигопептиды быстро разрушаются в бактериальной клетке и их наработка имеет ряд трудностей [245]. Более перспективен и технологичен генно-инженерный путь синтеза антигенных детерминант на матрице рекомбинантной ДНК в составе химерного белка. Антигенная детерминанта или, еще лучше, антигенные детерминанты разных серотипов или видов вируса могут быть встроены в молекулу белка-носителя, специально сконструированного таким образом, чтобы обеспечить экспонирование эпитопных участков белковой молекулы в мономерной форме. Такая задача вполне разрешима, так как разработаны методы, позволяющие рассчитывать вторичную и третичную структуры полипептидных цепей в растворе.

Опираясь на вышеперечисленные разработки и успехи в генно-инженерных исследованиях, ряд ученых предпринимают попытки создать вакцину против HIV-I. В мире в настоящее время ведется поиск последовательностей пептидов HIV-I для специфической наработки антител при иммунизации конструкциями, созданными на их основе. В частности показано, что пептиды последовательностей gpl20 367−382, 434−449, 424−456 могут быть реальными кандидатами для изучения их способности индуцировать выработку нейтрализующих антител к ВИЧ [248]. В качестве кандидатов в вакцины разрабатываются так же конструкции на основе пептидов gp 160/120, р24 и р17 фрагментов, gpl60 в поксвирусе [249]. Эпитоп, содержащий участок 730−744 из белка Evn был встроен в белок оболочки поливируса типа I и таким образом получен высокий титр HIV-нейтрализующих антител [250]. Сообщалось о клинических испытаниях вакцины на основе пептида HGP-30 из белка р17 [251]. Но наиболее перспективны вакцины содержащие несколько Т и В-клеточных эпитопов инфекционного агента. В работах [252,253] описано создание такой конструкции, содержащей шесть эпитопов белка Env и три — белка Gag (HIV-I, штамм 10). При иммунизации мышей он вызывал наработку антител, специфически реагирующих с белками оболочки HIV-I [253]. з?

Так как все эти белки создаются искусственно, то следовательно существует большая вероятность их нестабильности при биосинтезе, выделении и очистке. Как следует из обзора литературы, существующие методы получения рекомбинантных белков далеки от совершенства и нуждаются в разработке и оптимизации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы и плазмиды.

Штаммы микроорганизмов продуцентов рестриктаз были высеяны из воздуха, промышленных стоков, из почвенных суспензий и клубеньков растений. Перспективные штаммы, в которых были обнаружены ферменты рестрикции, хранятся в ИКК ГНЦ ВБ «Вектор», часть из них депонирована в ВКПМ (г.Москва).

В работе использовали рекомбинантные плазмиды pTNF 311А (R31Q) [254] и pTBI [253], созданные в ГНЦ ВБ «Вектор», и плазмиду pLT 21 [181], полученную из Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (г.Москва). В качестве реципиентных штаммов использовали E. coli SG 200−50 recA (F', ara D139, (argF-lac)U169, flbB5301, deoCl, rpsL150, relAl, Alon-100, cps-50:MudI) и E. coli CSH 36 (Alac p20 Sup E thi), полученные из Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (г.Москва) и из ИКК ГНЦ ВБ «Вектор» .

Материалы и сорбенты.

В работе использовали следующие реактивы: трис-(оксиметил)-аминометан, HEPES, PIPES, бромистый этидий, полиэтиленгликоль с м.в. 6000, агароза, тритон Х-100, 2-меркаптоэтанол, дитиотреит, бромфеноловый синий, полиэтиленимин, полиакриламид, актиномицин Д, эпихлоргидрин, боргидрид натрия, этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль (ЭДТА), лизоцим, глутаровый альдегид фирм «Serva» (Германия), «Sigma» (США). Для приготовления микробиологических сред использовали агар, пептон, триптон, дрожжевой экстракт, казаминовые кислоты фирм «8егуа» (Германия), «Difco» (США) — «Мегк» (Германия). ДЕАЕ-целлюлоза ДЕ-52, фосфоцеллюлоза P-II были производства фирмы «Whatman» (Великобритания), гидроксилапатит, гепарин-сефарозафирмы «Bio-Rad» (США). Белки-маркеры мол. масс — фирмы «Pharmacia» (Швеция) или «Serva» (Германия). Декстран с м.в. 500 000, ДНК фага лямбда, ДНК фага Т7, ДНК плазмид М13, pUC19, эндонуклеазы рестрикции — производства НИКТИ Б AB ГНЦ ВБ «Вектор» .

Другие реактивы были отечественного производства квалификации «ос.ч.» или «х.ч.» .

3S.

Гепарин-силохром.

Синтез сорбента гепарин-силохром.

20 г аминопропилсилохрома (силохром 800/70 аминопропиловый, ТУ 6−09−10−1471−80) промывали 200 мл деионизованной воды на стеклянном фильтре (№ 172). Затем сорбент суспендировали в 300 мл 0,5 М калий-фосфатного буфера, рН 8,8, добавляли 20 мл эпихлоргидрина и перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч. После этого сорбент промывали на стеклянном фильтре 2 л деионизованной воды и суспендировали в 300 мл раствора, содержащего 0,5 М калий-фосфат, рН 8,8, 300 мг гепарина («Спофа», Чехословакия) и 100 мг боргидрида натрия. Суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 30 ч, затем добавляли 100 мл 0,2 М раствора Трис-НС1, рН 8,8 и дополнительно перемешивали в течение 3 ч. Сорбент последовательно промывали 2 л деионизованной воды, 100 мл раствора ИаС1 (1 М) и вновь 2 л воды. Полученный сорбент суспендировали в 0,01 М растворе Трис-НС1, рН 8,3 и хранили при температуре 4 — 6 °C. Содержание иммобилизованного гепарина 0,3 — 0,6 мг/мл геля (не менее 0,2мг/мл).

Метод анализа количества иммобилизованного гепарина.

Метод анализа количества иммобилизованного гепарина основан на способности гепарина связывать краситель толуидиновый синий из раствора [255]. По разности оптических плотностей при длине волны 631 нм в контрольном растворе красителя и исследуемом растворе (после удаления из него образовавшегося комплекса гепарин-краситель) можно судить о исходном количестве гепарина в пробе.

Для построения калибровочной кривой в ряд пробирок, содержащих по 2,5 мл 0,005%-ного раствора толуидинового синего в 0,2%-ом ИаС1, вносили известные количества гепарина (10−60 мкг). Объем каждой пробы доводили до 5 мл, добавляя 0,2%-ный раствор ЫаС1, перемешивали в течение 1 мин и образовавшийся комплекс гепарин-краситель экстрагировали 5 мл гексана. Отбирали водную фазу и замеряли снижение оптической плотности при длине волны 631 нм против контрольного раствора красителя на спектрофотометре СФ-26 в кювете с длиной оптического пути 1 см не позднее 30 мин после проведения реакции (таблица 2).

Таблица 2.

Зависимость оптической плотности растворов при длине волны 631 мн от количества гепарина.

1 2 3 4 5 6.

Количество гепарина в пробе, мкг 10 20 30 40 50 60.

Оптическая плотность (А 631) 0,17 0,35 0,51 0,67 0,81 0,9.

По полученным данным строили график зависимости А631 от количества внесенного в раствор гепарина (сам график зависимости не приведен).

Для определения содержания иммобилизованного гепарина в полученном образце сорбента и в сорбенте фирмы «Вю-Б1ас1"С1ПА, в ряд пробирок, содержащих по 2,5 мл 0,005%-ного раствора толуидинового синего в 0,2%-ом ЫаС1 вносили различные количества образцов влажных сорбентов. Объем каждой пробы доводили до 5 мл, добавляя 0,2%-ный раствор ИаС1, перемешивали в течение 1 мин и образовавшийся комплекс удаляли центрифугированием (1000 об/мин -3 мин). Оптическую плотность растворов при длине волны 631 нм замеряли аналогично против контрольного раствора красителя (таблица.

3).

Таблица 3.

Определение содержания иммобилизованного гепарина в образцах сорбентов.

Гепарин-сефароза Гепарин-силохром.

Количество сорбента (мг) 25 50 100 25 50 100.

Оптическая плотность (А 631) 0,16 0,25 0,5 0,2 0,4 0,74.

Количество гепарина в пробе (мкг) 8 15 29 12 23 46.

Количество иммобилизованного гепарина, мг на 1 г влажного сорбента 0,32 0,3 0,29 0,47 0,46 0,46.

Среднее значение, мг гепарина/г сорбента 0,3 0,46.

В данном примере опыта по определению содержания иммобилизованного гепарина в сорбентах: гепарин-сефарозы фирмы «Вю-КасГ'(США) и синтезированного гепарин-силохрома, первый содержит 0,3 мг гепарина/г влажного сорбента, второй — 0,46 мг/г, соответственно.

Определение рестриктаз в микроорганизмах.

Использовали прямой анализ способности клеточного экстракта гидролизовать субстратную ДНК. Анализируемые штаммы высевали на агаризованную среду и выращивали в течение ночи при необходимой температуре. Клетки отбирали микробиологической петлей и суспендировали в 200 мкл буферного раствора (50 мМ трис-НС1, рН8,0, 50 мМ ЫаС1, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1% тритон Х-100). Смесь подвергали обработке ультразвуком на дезинтеграторе МБЕ (Великобритания), используя конический наконечник, до снижения оптической плотности суспензии при длине волны 550 нм до 65−70% от исходного значения (спектрофотометр СФ-26, «ЛОМО», г. Ленинград). Для этого через определенные промежутки времени отбирали пробы объемом 20 мкл, вносили их в 2 мл буферного раствора и замеряли оптическое поглощение. Обработанную ультразвуком смесь осветляли центрифугированием (1−2 мин при 10 000 об/мин) и аликвоты осветленного лизата (2,5,10 или 15 мкл) вносили в 50 мкл инкубационной смеси (10 мМ трис-НС1, рН 8,0, 50 мМ ЫаС1, 10 тМ М^С1 2, Ю тМ 2-меркаптоэтанол) с субстратной ДНК. Инкубировали в течение 30−60 мин и продукты реакции анализировали электрофорезом в 1%-ном геле агарозы. По окончании электрофореза гель окрашивали 0,05%-ным раствором бромистого этидия в течение 10−15 мин, промывали водой и смотрели в ультрафиолетовом свете. О наличии ферментов эндонуклеаз рестрикции II класса в штаммах микроорганизмов судили по появлению дискретных фрагментов субстратной ДНК на картине электрофореграммы.

Выделение и очистка рестриктаз.

Очистку ферментов проводили при 4 °C. 5 г клеток суспендировали в 10 мл 50 мМ трис-НС1 -буфера, рН 7,4, содержащего 10 мМ 2-меркаптоэтанол и 0,1%-ный тритон Х-100, и разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе при частоте 22 кГц по 20 с с интервалом по 40 с для охлаждения в ледяной бане. Степень разрушения клеток контролировали по снижению оптической плотности как описано в предыдущем разделе.

К 15 мл полученной суспензии при постоянном перемешивании приливали 25 мл смеси, содержащей 11,2%-ный ПЭГ, 3,2%-ный декстран и соответствующее количество соли. Перемешивание продолжали в течение 5−10 мин, затем смесь отстаивали 25 мин и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 40 мин (центрифуга К-23, «1апе:гку», Германия). Собирали верхнюю полиэтиленгликолевую фазу и наносили на колонку (1,6×15 см) с фосфоцеллюлозой Р-11, уравновешенную буфером А: 10 мМ КН2РО4, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, рН 7,4. Колонку промывали 100 мл буфера, А и сорбированные белки элюировали ЫаС1 (линейный градиент концентрации 0 — 1 М) в буфере А. Общий объем элюирующего раствора 150 мл. Собирали фракции по 3 мл и анализировали их на содержание рестриктазы. Фракции, содержащие целевой фермент, объединяли, при необходимости диализовали (или разбавляли буфером А) и наносили на колонку (2 мл) с гепарин-силохромом (или гидроксилапатитом), уравновешенную буфером А. Элюцию сорбированных белков проводили раствором ИаС1 (линейный градиент концентрации 0 — 1 М) в буфере А. В случае использования гидроксилапатита элюцию проводили линейным градиентом концентрации КН2РО4 от 10 до 500 мМ, рН 7,4 в присутствии 10 мМ 2-меркаптоэтанола. Фракции, осуществляющие в условиях анализа полный гидролиз субстратной ДНК, объединяли и диализовали в течение 16 ч против 100 мл 10 мМ трис-НС1-буфера, рН 7,4, содержащего 50 мМ КС1, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол и 50%-ный глицерин. Полученные ферментные препараты хранили при температуре — 20 °C.

Определение активности ферментов и функциональной чистоты ферментных препаратов.

За единицу ферментативной активности рестриктазы принимали такое количество фермента, которое в течение 1 ч полностью специфически расщепляло 1 мкг ДНК фага X [137,143−145].

Для обнаружения примесей неспецифических эндонуклеаз в препарате рестриктазы гидролиз 1 мкг ДНК фага X проводили в стандартных условиях в присутствии избытка рестриктазы (10−20 ед.акт.) в течение 16−20 ч. Об отсутствии примесей судили по сохранению специфической картины распределения рестриктов после их разделения в агарозном геле.

Наличие примесей экзонуклеаз и фосфатаз в препаратах ферментов определяли путем гидролиза ДНК в присутствии избытка фермента (4−5 ед.акт. — 3−5 ч инкубации) с последующей сшивкой образовавшихся фрагментов ДНК-лигазой фага Т4 и повторной обработкой рестриктазой. Об отсутствии примесей судили по полноте сшивки рестриктов и типичной картине повторной рестрикции ДНК [137,143 145].

Определение сайта узнавания рестриктаз.

При определении сайта узнавания рестриктаз проводили гидролизы субстратных ДНК: ДНК фага А, фага Т7, плазмид pBR 322, pUC 19 для выяснения числа фрагментов, которые образуются при их расщеплении. Полученные данные сравнивали с табличными для известных ферментов [143] и выбирали предполагаемые прототипы. Затем проводили визуальное сравнение картин электрофореза их гидролизатов с картинами гидролиза известных рестриктаз (предполагаемых прототипов). Обнаружив соответствие, проводили совместный гидролиз исследуемой и известной рестриктазами. Таким образом были определены сайты узнавания рестриктаз из B. megaterium361 (Нае III), В. species54 (Sau96 I), В. species 122 (Pst I), B. species9 (Нае III), B. species29 (Stu I), B. stearothermophilus (BstN I), H. alvei22 (EcoR I), K. pneumoniae378 (Sac II), R. trifolii (SalG I), R. meliloti21 (Cla I), S. aureus557 (Sau96 I) и ряда других. В тех случаях, когда соответствие с картинами гидролиза известных (доступных) рестриктаз не было обнаружено, проводили совместные гидролизы исследуемых рестриктаз с известными ферментами (Hind III, Mlu I и др.) для локализации мест расщепления на ДНК. Локализованные участки ДНК (по 100−200 п.н.о.) затем сравнивали по наличию в них одинаковых тетра-, гегсануклеотидных последовательностей, которые не встречаются в других районах молекул ДНК. Таким образом были определены сайты узнавания рестриктаз из R. leguminosarum (Рра I), B. brevis7 (Bbv II), B. coagulanso (Fsp I), B. coagulansllo (Ear I), B. schlegelii4 (BsiY I).

Определения места гидролиза на двуцепочечной ДНК.

Для выяснения места расщепления проводили секвенирование участка ДНК в районе узнавания рестриктазой [162]. По совпадению полос на радиоавтографе геля в химическом и ферментативном гидролизатах судили о том, между какими нуклеотидами происходит расщепление двуцепочечной ДНК. Этот этап работ проводился под руководством сотрудника ГНЦ ВБ «Вектор» Чижикова В.Е.

Генно-инженерные и микробиологические методы.

Трансформацию клеток E. coli плазмидами проводили по кальциевой методике [174]. Полученные суспензии клеток высевали на агаризованную питательную среду, содержащую ампициллин (50−100 мкг/мл) и инкубировали при 32° С в течение ночи. Для анализа продуктивности клонов по целевому белку микробиологической петлей отбирали половину колонии, суспендировали ее в 30−50 мкл буфера для нанесения проб [256], прогревали 5−10 мин при 100 °C и наносили на дорожки полиакриламидного геля. Выделение и очистку плазмидных.

ДНК, их гидролиз рестриктазами и гель-электрофорез проводили по стандартным методикам [174]. Среды для культивирования готовили по методикам, описанным там же [174]. Ферментацию проводили в ферментере с объемом среды 8 л. Инокулят вносили в количестве 2% (у/у) от засеваемого объема среды. По окончании ферментации культуральную жидкость быстро охлаждали до 5- клетки собирали центрифугированием и хранили при температуре — 20 °C.

При исследовании стабильности рекомбинантных штаммов-продуцентов в процессе роста отбирали пробы культуральной жидкости, разбавляли физ. раствором и в количествах по 50−150 колоний рассевали параллельно на селективные (Ар, 50−100 мкг/мл) чашки и на чашки без антибиотика. По соотношению чисел колоний, выросших на чашках (16−20 ч инкубации при 32° С), рассчитывали процентное содержание в культуре плазмидсодержащих клеток (Арк).

Выделение и очистка факторов некроза опухолей.

Для получения экстракта клетки суспендировали в 20 мМ трис-НС1-буфере в пропорции на 1 г клеток 3 мл буфера. В качестве ингибитора протеаз в суспензию добавляли ¿-пСЬ до 0,5 мМ концентрации. Клетки разрушали при помощи ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т при частоте колебаний стержня 22 кГц. Клеточный дебрис из суспензии удаляли центрифугированием при 18 000 об/мин в течение 60 мин (центрифуга 1−21, «Вектап», США). Полученный супернатант наносили на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, уравновешенную 20 мМ трис-НС1. Объем колонки выбирали из расчета 25−30 мг наносимого суммарного белка на 1 мл сорбента. После нанесения колонку промывали буфером и белки элюировали линейным градиентом ИаС1 от 0 до 0,2 М в том же буфере. Вытекающий из колонки раствор собирали по фракциям и анализировали при помощи гель-электрофореза на наличие целевого белка. Фракции, содержащие целевой белок, объединяли, добавляли НЕРЕБ до конечной концентрации 10 мМ и доводили значение рН до 6,8, добавляя 50 мМ раствор соляной кислоты. Полученный раствор наносили на колонку с гидроксилапатитом, уравновешенную 10 мМ раствором НЕРЕБ, рН 6,8. Объем колонки выбирали из расчета 10 мг наносимого суммарного белка на 1 мл сорбента. Колонку промывали буфером и белки элюировали линейным градиентом ЫаС1 в том же буфере (10 мМ НЕРЕБ, рН 6,8). Фракции, содержащие целевой белок, объединяли, диализовали против 20 мМ трис-НС1-буфера и проводили рехроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе в условиях, описанных выше. Полученный раствор высокоочищенного белка диализовали против двух смен 10 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,2, содержащего 0,15 М ИаС1 и стерилизовали фильтрацией (фильтр с диаметром пор 0,22 мкм).

Выделение и очистка белка ТВ1.

Клетки суспендировали в растворе 50 мМ трис-НС1, рН 8,5, содержащем 1 мМ гпС12, 0,1 мМ СиС12, 0,5 мМ РМББ и 5 мМ 2-меркаптоэтанол в пропорции 4 мл буфера на 1 г клеток. Суспензию подвергали обработке ультразвуком и затем центрифугировали 60 мин при скорости 12 000 об/мин. Полученный осадок дважды промывали буфером и суспендировали в 6 М растворе мочевины в том же буфере в пропорции на 1 г исходных клеток 1 мл раствора. После перемешивания в течение 3 ч нерастворившиеся белки удаляли центрифугированием в течение 60 мин при скорости 18 000 об/мин и супернатант наносили на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, уравновешенную 6 М раствором мочевины в 50 мМ трис-НС1 -буфере, рН 8,5. После промывки колонки белки элюировали линейным градиентом ЫаС1 от 0 до 0,2 М в 50 мМ трис-НС1, рН 8,5, содержащем 6 М мочевину. Анализ фракций на наличие целевого белка проводили при помощи гель-электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Фракции, содержащие белок ТВ1, объединяли, добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 20 мМ и доводили рН раствора до значения 4,8, добавляя 50 мМ уксусную кислоту. После инкубации в течение 30 мин раствор центрифугировали 20 мин при скорости 5000 об/мин, супернатант собирали, разбавляли его в два раза 50 мМ трис-НС1, рН 8,5 и выдерживали 3 ч при температуре 4 °C. Далее раствор вновь разбавляли в два раза, инкубировали при перемешивании 5 ч и затем диализовали против буфера 50 мМ трис-НС1, рН 8,5 в течение ночи. Раствор центрифугировали 20 мин при скорости 5000 об/мин и супернатант наносили на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой. Промывку колонки и элюцию белков проводили аналогично вышеописанному, но в отсутствии мочевины. Объединенные фракции, содержащие белок ТВ1, диализовали против 10 мМ трис-НС1, рН 7,6, содержащего 0,15 М КаС1 (две-три смены буфера по 1 л) и стерилизовали фильтрацией (фильтр с диаметром пор 0,22 мкм).

Другие методы.

Белковый электрофорез в денатурирующих условиях проводили как описано в [256]. Сканирование окрашенных полиакриламидных гелей и вычисление относительного содержания целевого продукта проводили с использованием прибора «Хромоскан-200» («1оусе ЬоеЫ», Великобритания). Гель-электрофорез в градиенте мочевины проводили как описано в [257], используя 10%-ный полиакриламидный гель и трис-боратный буфер (рН 8,3). Для центрифугирования больших объемов растворов использовали центрифугу 1−21 («Вектап», С1ПА). Обработку клеток ультразвуком проводили на ультразвуковых дезинтеграторах МБЕ (Великобритания) или УЗДН-2Т (Россия).

Подготовку и использование хроматографических сорбентов проводили согласно рекомендациям производящих их фирм. Концентрацию белка в растворах определяли по методу Лоури [258]. Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартного метода нормального распределения [259].

Биологическую активность факторов некроза опухолей определяли в цитотоксическом тесте на клетках мышиных фибробластов линии L 929. Этот этап работы проводился в ОБТК ГНЦ ВБ «Вектор» Мерзликиным Н. В. под руководством Усовой C.B.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Выявление новых штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции и разработка технологии выделения и очистки ферментных препаратов.

Как было рассмотрено в обзоре литературы, одними из важных биологически активных веществ, получаемых из прокариотических клеток, являются ферменты, в частности — эндонуклеазы рестрикции II типа. Именно от их ассортимента и доступности в значительной степени зависит развитие генетической инженерииклонирование генов и получение эукариотических и других белков путем их наработки в прокариотических (и не только) клетках. В обзоре литературы были рассмотрены приемы и методы расширения арсенала доступных ферментов, тем не менее тенденция их развития и оптимизации продолжается и является актуальной задачей.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с сотрудниками ГНЦ ВБ «Вектор» Минздрава РФ: Андреева И. С., Афиногенова Г. Н., Гилева И. П., Дегтярев С. Х., Денисова Л .Я., Ерошкин A.M., Зернов Ю. П., йванисенко В.А., Игнатьев Г. М., Ильичев A.A., Каргинова Е. А., Корепанова A.B., Кравченко В. В., Литовченко JI. JL, Масычева В. И., Мерзликин Н. В., Перебоев A.B., Петренко В. А., Пустошилова Н. М., Пучкова Л. И., Репин В. Е., Серов Г. Д., Синичкина С. А., Терещенко Т. А., Усова C.B., Федосова Л. К., Чижиков В. Е., сотрудниками Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН: Давыдов И. В., Добрынин В. Н., Коробко В. Г., сотрудниками Бот. сада СОР АН: Гордиенко Н. Я., Майстренко Г. Г.

Своим ближайшим коллегам и соавторам проведенных исследований автор выражает искреннюю благодарность.