Расположение кодонов мРНК в А-, Р-и Е-участках по данным аффинной модификации рибосом человека аналогами мРНК — производными олигорибонуклеотидов с фотоактивируемой группой на остатке гетероциклического основания

Изучение структурно-функциональной топографии рибосом важно не только для понимания молекулярных механизмов биосинтеза белка, но и для разработки подходов к т регуляции этого процесса. К настоящему времени достигнуты значительные успехи в изучении структурно-функциональной организации рибосом бактерий [1,2], вместе с тем наблюдается отставание в изучении рибосом эукариот. По-видимому, это связано не только с меньшей доступностью рибосом эукариот (и, в частности, человека), но и с тем, что многие из методов, успешно применяемых для изучения бактериальных рибосом, пока что не могут быть использованы для исследования рибосом высших организмов. Прежде всего это касается метода РСА, так как кристаллы эукариотических рибосом пока не получены, и методов, основанных на реконструкции рибосомных субчастиц из белков и рРНК, поскольку до сих пор не найдено подходов к сборке активных субчастиц рибосом эукариот in vitro. В связи с этим, пожалуй, единственным на сегодняшний день методом, с помощью которого может быть получена детальная информация о структурной организации рибосом эукариот, является метод аффинной модификации (или, как теперь принято называть, метод аффинного химического сшивания), основанный на использовании реакционноспособных аналогов компонентов аппарата трансляции (мРНК, тРНК и т. п.), который оказался в свое время очень продуктивным при изучении бактериальных рибосом (см. обзоры [3,4]).

Лаборатория Структуры и Функции Рибосом НИБХ СО РАН является единственным в мире научным коллективом, где на протяжении ряда лет проводится систематическое исследование мРНК-связывающего центра рибосом человека с помощью метода аффинной модификации. К моменту начала настоящей работы были выявлены существенные отличия во взаимодействии мРНК с рибосомами прои эукариот. Так, с помощью синтетических матриц, несущих остатки 4-тиоуридина, было показано, что взаимодействие мРНК с эукариотической рибосомой осуществляется за счет меньшего числа контактов с рРНК малой субчастицы. С помощью коротких аналогов мРНКпроизводных олигорибонуклеотидов было установлено с какими нуклеотидами 18S рРНК сближены первые нуклеотиды кодонов матрицы в Ри Е-участках (положения +1 и -3, соответственно) и нуклеотиды, расположенные с 3'-стороны от ко дона в А-участке (положения от +7 до +13) и с 5'-стороны от кодона в Е-участке (положение -6). Было также известно, с каким нуклеотидом 18S рРНК соседствует нуклеотид мРНК, примыкающий с З'-стороны к ко дону в Р-участке. Кроме того, было изучено белковое окружение первых нуклеотидов кодонов матрицы в А-, Ри Е-участках и нуклеотидов, расположенных с 5'- и З'-сторон от этих участков (см. обзоры [5,6]).

Целью настоящей работы являлось изучение окружения на 80S рибосоме человека первого нуклеотида кодона в А-участке (положение +4 относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке) и каждого из нуклеотидов кодонов матрицы в Ри Е-участках (положения от +3 до -3) с помощью метода аффинного химического сшивания с использованием коротких аналогов мРНК, производных олигорибонуклеотидов с фотоактивируемой группой на остатке гетероциклического основания, в составе комплексов, имитирующих различные состояния рибосомы в процессе элонгации.

Основными задачами являлись: определение нуклеотидов 18S рРНК и рибосомных белков, сшивающихся с производными гексарибонуклеотида pUUUGUU, несущими перфторфенилазидогруппу на атоме С5 первого, второго или третьего остатка урацила, в рибосомных комплексах, где модифицированный остаток находился в положениях от +3 до -3- определение нуклеотидов 18S рРНК, сшивающихся с производным гексарибонуклеотида pUUUGUU, несущим перфторфенилазидогруппу на атоме N7 остатка гуанина, в рибосомных комплексах, где модифицированный остаток находился в положениях +4 и +1- определение нуклеотидов 18S рРНК, сшивающихся с производным додекарибонуклеотида pUUAGUAUUUAUU, несущим перфторфенилазидогруппу на атоме N7 остатка гуанина, в рибосомном комплексе, где модифицированный остаток находился в положении -3, и изучение влияния наличия и природы тРНК в Е-участке на сшивку с 18S рРНК в этом комплексесопоставление данных по фотоаффинной модификации рибосом человека производными олигорибонуклеотидов pUUUGUU и pUUAGUAUUUAUU с данными, полученными с помощью РСА, по расположению матрицы на бактериальных рибосомах.

выводы.

1. Изучено окружение на 80S рибосоме кодонов мРНК в А-, Ри Е-участках с помощью аффинной модификации рибосом человека аналогами мРНК — фотоактивируемыми производными олигорибонуклеотидов, несущими перфторфенилазидогруппу на остатке гетероциклического основания. а) Определены нуклеотиды 18S рРНК и рибосомные белки, сшивающиеся с производными гексарибонуклеотида pUUUGUU с перфторфенилазидогруппой на атоме С5 первого, второго или третьего остатка урацила в модельных комплексах, где модифицированный остаток находился в положениях от +3 до -3 относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке: показано, что модификации во всех случаях подвергается исключительно 40S субчастица, а в её- составе — как 18S рРНК, так и белкиустановлено, что модифицированный остаток урацила в положениях от -1 до +3 сшивается с нуклеотидом G1207 18S рРНК, а в положениях -2 и -3 — с G961- обнаружено, что • во всех изученных комплексах производные pUUUGUU модифицируют белки S2 и S3, сшивка с которыми происходит и в отсутствие тРНКустановлено, что модифицированный остаток урацила в положении +1 сшивается с белком S26 и в незначительной степени с белком S23, а в положении -3 — также с белком S26 и в незначительной степени с белком S5/S7. б) Определены нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с производным гексарибонуклеотида pUUUGUU с перфторфенилазидогруппой на атоме N7 остатка гуанина в модельных комплексах, где модифицированный остаток находился в положениях +4 и +1. Показано, что модифицированный остаток в положении +4 сшивается с нуклеотидами А1823, А1824 и А1825 18S рРНК, а в положении +1 — с G1702. в) Определены нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с производным додекарибонуклеотида pUUAGUAUUUAUU с перфторфенилазидогруппой на атоме N7 остатка гуанина в модельных комплексах, где модифицированный остаток находился в положении -3, и в бинарном комплексе (т.е. в отсутствие тРНК). Показано, что модифицированный остаток в положении -3 сшивается с нуклеотидом G1207 18S рРНК независимо от наличия и природы тРНК в Е-участке, а в бинарном комплексе — с 3'-концевым участком 1840−1849.

2. Сопоставление результатов по фотоаффинной модификации рибосом человека с данными рентгеноструктурного анализа рибосом бактерий позволило выявить: а) новые универсальные элементы структуры рРНК малой субчастицы, сближенные с кодонами в А- (нуклеотиды А1823 и А1824 18S рРНК и соответствующие им нуклеотиды А1492 и А1493 16S рРНК Е. coli) и Е- (нуклеотид G961 18S рРНК и соответствующий ему нуклеотид G693 16S рРНКЕ coli) участкахб) универсальную черту расположения матрицы на рибосоме — резкий изгиб между кодонами в Ри Е-участкахв) отличие в белковом окружении матрицы на рибосомах млекопитающих и бактерий, а именно, белок S26, не имеющий гомолога среди бактериальных рибосомных белков, соседствует с кодонами в Ри Е-участках 80S рибосомы.

2.3.

Заключение

.

Таким образом, использование производных олигорибонуклеотидов с перфторфенилазидогруппой на одном из остатков гетероциклических оснований позволило получить детальную информацию об окружении каждого из нуклеотидов кодонов мРНК в Ри Е-участках, а также данные о нуклеотидных остатках 18S рРНК, сближенных с первым нуклеотидом кодона в" А-участке. Результаты настоящей работы подтвердили сделанный ранее вывод о том, что кодоны матрицы в А-, Ри Е-участках соседствуют с нуклеотидами, занимающими одинаковое положение во вторичной структуре рРНК малых субчастиц рибосом бактерий и млекопитающих. Кроме того, с использованием данных производных найдены новые структурные элементы в 3'-концевом (нуклеотиды А1823, А1824 и А1825) и центральном (нуклеотид G961) доменах 18S рРНК, сближенные с кодонами матрицы в Аи Е-участках, соответственно, а также выявлено сходство в расположении матрицы на рибосомах бактерий и млекопитающих, а именно, наличие резкого изгиба между кодонами в Ри Е-участках. Наряду со сходством обнаружены отличия в расположении матрицы на рибосомах прокариот и высших эукариот. Одно из отличий вызвано появлением дополнительного (по сравнению с 16S рРНК) нуклеотида А1825 18S рРНК, сближенного с кодоном мРНК в А-участке рибосом человека. Другое отличие касается белкового окружения матрицы в А-, Ри Е-участках. Белок S26, не имеющий гомолога среди бактериальных рибосомных белков, сближен с кодонами матрицы в Ри Е-участках 80S рибосомыа белок S23 соседствует с 5'-стороной кодона в Р-участке, в отличие от гомологичного ему белка S12, вблизи которого располагается кодон в А-участке 70S рибосомы.

На основании полученных результатов, а также принимая во внимание предыдущие данные [147, 150−153,159], предложена схема расположения матрицы в А-, Ри Е-участках 80S рибосом человека (рис. 24). Согласно этой схеме, между кодонами в Аи Р-участках матрица делает изгиб, в результате чего эти кодоны оказываются сближенными с нуклеотидом G1702 18S рРНК и белком S15, в то время как нуклеотиды А1823, А1824 и А1825 соседствуют только с кодоном в А-участке, а первый нуклеотид кодона в Р-участке — с С1057. Другой более резкий изгиб делает матрица между кодонами в Ри Е-участках, благодаря которому нуклеотид G1207 18S рРНК и белок S26 располагаются вблизи этих ко донов, при этом остаток G961 соседствует только с первым и вторым нуклеотидами кодона в Е-участке.

40S субчастица.

Рис. 24. Схема расположения матрицы в А-, Ри Е-участках 80S рибосом человека.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Материалы.

В работе использовали дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты и АТР фирмы «Sigma» (США) — акриламид, дезоксихолат натрия, DMSO, DTT, HEPES, LiC104, N-N'-метиленбисакриламид, пуромицин, PIPES, спермин, SDS, Трис, циклогексимид и краситель «Stains all» фирмы «Fluka» (Швейцария) — 2-меркаптоэтанол и сорбент Nucleosil 5С18 фирмы «Macherey-Nagel» (Германия) — кумасси бриллиантовый голубой — «Ferak» (Германия) — TEMED, спермидин и поли (и) — «Reanal» (Венгрия) — ферменты: AMV-ревертазу фирмы «Life Science» (США), РНКазу, А и протеиназу К фирмы «Sigma» (США), РНКазу U2, РНКазу Т1 и щелочную фосфатазу фирмы «Boehringer Mannheim» (Германия), РНКазу Н фирмы «Biopol» (Россия), Т4 полинуклеотидкиназу фирмы «Сибэнзим» (Россия), Т4 РНК-лигазу фирмы «Promega» (США). тРНКУа1 (1800 пмоль/ ОЕ2бо), тРНКРЬе (1300 пмоль/ОЕ26о), [14C]Phe-TPHKPhe (800 dpm/пмоль, 1300 пмоль/ОЕгбо), Уа1-тРНКУа1 (1800 пмоль/ОЕгбо) Е. coli любезно предоставлены Т. Г. Шапкиной (Санкт-Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова, г. Гатчина) и tPHKAsp (1300 пмоль/ ОЕгбо), любезно предоставленную Н. А. Моор (Лаборатория биоорганической химии ферментов, НИБХ СО РАН) — олигорибонуклеотиды UUUGUU, UUUGUU3'OMe> UUAGUAUUUAUU и производные олигорибонуклеотида UUUGUU с перфторфенилазидогруппой на атоме С5 первого, второго или третьего остатка урацила синтезированы и охарактеризованы в Группе химии олигорибонуклеотидов (Лаборатория химии нуклеиновых кислот, НИБХ СО РАН) — [у-32Р]АТР (1000 Ки/ммоль) и [5'-32Р]рСр (450 Ки/ммоль) синтезированы Д. В. Семёновым (Лаборатория радиохимии, НИБХ СО РАН) — олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные нуклеотидным последовательностям 821−840, 950−969,1081−1100,11 811 200, 1197−1216, 1821−1840, 1835−1849, 1830−1849 и 1851−1869 18S рРНК человека, синтезированы в НИБХ СО РАН, а олигомеры, комплементарные последовательностям 655−674, 1222−1241, 1396−1417, 1621−1640 и 1812−1831, любезно предоставлены П. Воллензиеном (Университет штата Северная Каролина, г. Роли, США). CIRCH2NH2 и N.

100 гидроксисукцинимидный эфир и-азидотетрафторбеизойной кислоты синтезированы Т. М. Ивановой (Лаборатория исследования модификации биополимеров, НИБХ СО РАН).

Прочие неназванные реактивы были марки «хч», «чда» или «осч». Для приготовления всех растворов использовали бидистиллированную воду (прибор для очистки воды VHQ-PS фирмы «SITA», Великобритания). Для фильтрования растворов и анализа связывания меченых лигандов с 80S рибосомами использовали нитроцеллюлозную мембрану фирмы «Millipore» (США) с диаметром пор 0,45 мкм.

Оптическую плотность регистрировали с помощью микроспектрофотометра «Милихром» (НПО «Научприбор», г. Орёл). Фотоаффинную модификацию 80S рибосом проводили, используя УФ-лампу фирмы «SpotCure» (Великобритания). Препараты сушили на вакуумном испарителе «UNIVAPO 100Н» (Германия). Измерение рН проводили на рН-метре ОР-264/1 «Radelkis» (Венгрия). Радиоактивность просчитывали на счётчиках «Rackbeta» и «Minibeta» фирмы «LKB-Pharmacia» (Швеция). Пробы, меченные 14С, просчитывали в 5 мл толуольного сцинтиллятора (5 л толуола, 20 г РРО, 1 г РОРОР), меченные 32Р, — в 1 мл воды по Черенкову. Гели радиоавтографировали с использованием рентгеновской плёнки фирмы «Conica» (США). В работе использовали ультрацентрифугу «Beckman L8M», а также центрифуги «Beckman J2−21M», «Eppendorf 5403» и «Eppendorf 5415С» (Германия).

3.2. Выделение рибосомных 40S и 60S субчастиц из плаценты человека.

Рибосомные 40S и 60S субчастицы с интактной рРНК выделяли из нормальной послеродовой плаценты. Промежуток времени между родами и гомогенизацией ткани не превышал 30 мин. Плаценту немедленно погружали в 500 мл буфера I (20 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 125 мМ КС1, 10 мМ MgCb, 0.5 мМ EDTA, 4 мМ 2-меркаптоэтанол), который предварительно охлаждали до 4 °C. Не позже, чем через 20 мин после родов, плаценту резали на кусочки по 25−30 г, освобождаясь при этом от мембран и соединительной ткани, отмывали от крови в буфере I и суспендировали при 4 °C в равном по весу количестве буфера I, содержащего 250 мМ сахарозу, 1 г/л гепарина и 0.05 г/л циклогексимида. Полученный гомогенат центрифугировали на центрифуге «Beckman J2−21M» (ротор JA-14) при 4 °C и 13 000 об/мин в течение 30 мин. К постмитохондриальному супернатанту.

101 добавляли дезоксихолат натрия до концентрации 1% и перемешивали в течение 30 мин при 4 °C. Постмитохондриальный супернатант, обработанный дезоксихолатом, наносили на сахарозную подушку (35%-ный раствор сахарозы в буфере 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 100 мМ NH4CI, 3 мМ MgCh, 0.15 мМ EDTA, 5 мМ 2-меркаптоэтанол) и центрифугировали при 4 °C 20 ч (центрифуга «Beckman L8M», ротор SW-28, 26 000 об/мин). По окончании центрифугирования супернатант осторожно сливали. Осадок полисом растворяли при 4 °C в 10 мл буфера 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, содержащего 100 мМ NH4CI, 3 мМ MgCh, 0.125 мМ EDTA и 10 мМ 2-меркаптоэтанолнерастворившийся материал удаляли центрифугированием (центрифуга «Beckman J2−21M», ротор JA-20, 17 000 об/мин, 15 мин, 4°С). Раствор полисом обрабатывали 0.5 мМ пуромицином 10 мин при 0 °C, затем к раствору добавляли по каплям при постоянном помешивании 3 М КС1 до концентрации 0.5 М и инкубировали 20 мин при 37 °C, после чего раствор наносили на линейный градиент плотности сахарозы (10 — 30%) в буфере 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 500 мМ КС1, 3 мМ MgCb, 0.125 мМ EDTA и 10 мМ 2-меркаптоэтанол, и центрифугировали 18 ч при 4 °C (ультрацентрифуга «Beckman L8M», ротор SW-28, 20 000 об/мин). Фракции, соответствующие 40S и 60S субчастицам, осаждали центрифугированием (центрифуга «Beckman L8M», ротор SW-28, 24 000 об/мин, 22 ч, 4°С), предварительно повысив концентрацию Mg2+ до 20 мМ и снизив концентрацию КС1 до 120 мМ. Осадки растворяли в воде до концентрации 80−120 ОЕгбо/мл и хранили в жидком азоте порциями по 25 мкл. Перед использованием к 40S и 60S субчастицам добавляли V* объема пятикратного буфера, А (однократный буфер А: 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 120 мМ КС1, 13 мМ MgCl2, 0.65 мМ EDTA) или буфера Б (однократный буфер Б: 20 мМ HEPES-NaOH, рН 7.5, 100 мМ NH4CI, 4 мМ MgCl2, 0.15 мМ EDTA, 0.6 мМ спермидин, 0.8 мМ спермин) до концентрации субчастиц 15−20 ОЕгбо/мл, реактивировали в течение 10 мин при 37 °C, осветляли центрифугированием в течение 1 мин при комнатной температуре при 14 000 об/мин и замеряли оптическую плотность, полагая, что 1 ОЕгбо соответствует 50 пмоль 40S или 25 пмоль 60S субчастиц по данным [171]. Для получения 80S рибосом субчастицы смешивали в мольном соотношении 40S:60S = 1:1.3, при этом, как показал анализ 80S рибосом в линейном градиенте плотности сахарозы (10.

30%) в буфере, А (центрифуга «Вескшап L8M», ротор SW-40, 24 000 об/мин, 19 ч, 4°С), практически все 40S субчастицы ассоциируют с 60S субчастицами. Конечная концентрация реактивированного препарата 80S рибосом составляла примерно 10″ 6 М. Активность 80S рибосом в поли (Ц)-зависимом связывании [14C]Phe-TPHKPhe измеряли по методике, описанной в работе [172], она составляла примерно 70% (т.е. около 1.4 моль [14C]Phe-TPHKPhe связывалось с 1 моль 80S рибосом).

3.3. Синтез фотоактивируемых производных олигорибонуклеотидов, несущих перфторфенилазидогруппу на атоме N7 остатка гуанина.

Присоединение перфторфенилазидогруппы по атому N7 остатка гуанина олигорибонуклеотидов UUUGUU (UUUGUU3-оме) и UUAGUAUUUAUU проводили в две стадии. Вначале олигорибонуклеотиды алкилировали, инкубируя 0.5 ОЕ260 UUUGUU (UUUGUU3'OMe) с 400 нмоль C1RCH2NH2 в 160 мкл 8 мМ Трис-HCl, рН 7.5, в течение 5 ч при 37 °C или 0.66 ОЕ260 UUAGUAUUUAUU с 24 нмоль C1RCH2NH2 в 120 мкл 8 мМ Трис-HCl, рН 7.5, в течение 2 ч при 47 °C. Продукты алкилирования выделяли с помощью офВЭЖХ на микроколонке объёмом 200 мкл со смолой Nucleosil 5С18 (элюция ступенчатым градиентом концентрации 10, 20, 30,40 и 90%-ного метанола в 50 мМ ТЭА-ацетате, рН 7.5, 24 мин, скорость элюции 100 мкл/мин). Элюция алкилированных олигорибонуклеотидов происходила при несколько более высокой концентрации метанола (54%-ной в случае UUUGUU и 60%-ной в случае UUAGUAUUUAUU), чем элюция исходных олигорибонуклеотидов. Степень модификации олигорибонуклеотидов составляла 90%. Фракцию, содержащую алкилированный олигорибонуклеотид, упаривали досуха в вакууме, растворяли в 5 мкл Н20, затем к этому раствору добавляли 10 мкл DMSO и обрабатывали N-гидроксисукцинимидным эфиром л-азидотетрафторбензойной кислоты (NSu-Az), как описано в [152]. Для этого отдельно растворяли 1.8 мг NSu-Az в 20 мкл DMSO и полученный раствор порциями добавляли к раствору алкилированного олигорибонуклеотида при комнатной температуре через каждые полчаса (сначала 10 мкл, затем два раза по 5 мкл). После окончания реакции к смеси в качестве носителя добавляли 1 мкл 0.1 М АТР и нуклеотидный материал осаждали 10 объёмами 2%-ного LiClQ" в ацетоне. Осадок отделяли центрифугированием при 14 000 об/мин в течение 3−5 мин при комнатной температуре, высушивали в течение 10−15 мин и растворяли в 40 мкл НгО. Затем проводили повторное переосаждение, как указано выше. Осадок сушили на воздухе в течение 15−20 мин, растворяли в 20 мкл Н2О. Фотоактивируемые производные олигорибонуклеотидов выделяли с помощью офВЭЖХ, как описано выше. Элюция фотоактивируемых производных происходила при несколько большей концентрации метанола (72%-ной в случае UUUGUU и 76%-ной в случае UUAGUAUUUAUU), чем элюция алкилированных олигорибонуклеотидов, из-за наличия гидрофобной перфторфенилазидогруппы. Выход продуктов, содержащих перфторфенилазидогруппу, по отношению к алкилированным олигорибонуклеотидам составлял около 90%. При расчете молярной экстинкции фотоактивируемых производных олигорибонуклеотидов полагали, что молярная экстинкция перфторфенилазидной части реагента равна 8.6″ 103 моль^см*1 [173].

3.4.

Введение

радиоактивной метки на 5'-конец.

Введение

метки 32Р на 5'-конец олигорибонуклеотидов и их производных, тРНК и ОДН проводили с помощью [у-32Р]АТР и Т4 полинуклеотидкиназы. Для этого реакционную смесь объемом 20 мкл, содержащую 100 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 60 мМ MgCh, 1 мМ EDTA, 0.5−1.5 нмоль олигорибонуклеотида (0.2 нмоль ОДН или 0.4 нмоль тРНК), 10−20 МБк [у-32Р]АТР и 15 ед. акт. Т4 полинуклеотидкиназы, инкубировали в течение 30 мин при 37 °C. Затем в случае олигорибонуклеотидов и их производных к смеси добавляли примерно 1 мкмоль нерадиоактивного АТР и дополнительно инкубировали 15 мин при 37 °C. Во всех случаях нуклеотидный материал осаждали 10 объёмами 2%-ного 1ЛСЮ4 в ацетоне и выделяли офВЭЖХ, как описано в разделе 3.3. Удельная активность меченых олигорибонуклеотидов и их производных была (50−100)* 103 имп/мин на пмоль, тРНК — (30−50)-103 имп/мин на пмоль, а ОДН — (5−10)*105 имп/мин на пмоль по Черенкову.

3.5. Гидролиз РНКазой Т1.

Примерно 100 пмоль меченного 32Р исходного или алкилированного олигорибонуклеотида (pUUUGUU или pUUAGUAUUUAUU) (см. раздел 3.4) инкубировали в 15 мкл 20 мМ цитрата натрия, рН 5.0, содержащего 250 мкг/мл суммарной тРНК Е. coli, в течение 15 мин при 55 °C. Затем к смеси добавляли 0.5 ед. акт. РНКазы Т1 и дополнительно инкубировали 15 мин при 55 °C. Продукты гидролиза осаждали 10 объемами 2%-ного LiC104 в ацетоне (см. раздел 3.3), осадок растворяли в 4 мкл деионизованного формамида, содержащего 0.01%-ный бромфеноловый синий и 0.01%-ный ксиленцианол. Полученный раствор инкубировали в течение 1 мин при 90 °C, охлаждали во льду до 0 °C и анализировали с помощью электрофореза в 20%-ном ПААГ, содержащем 0.4%-ный бис-акриламид и 8 М мочевину в буфере ТБЕ (89 мМ Трис-борат, рН 8.3, 89 мМ борная кислота, 2 мМ EDTA). По окончании электрофореза гель высушивали в вакууме и радиоавтографировали на рентгеновскую пленку.

3.6. Дефосфорилирование тРНК. тРНКУа1 или tPHKAsp (0.4 — 0.6 нмоль) инкубировали в 10 мкл буфера 10 мМ Трис-НС1, рН 7.5, содержащего 0.5 ед. акт. щелочной фосфатазы, при 37 °C в течение 30 мин. Затем к реакционной смеси добавляли 40 мкл НгО и выделяли тРНК двухкратной экстракцией равным объёмом водонасьпценного фенола. Следы фенола экстрагировали из водного раствора тРНК трехкратным объёмом серного эфира. Затем к водной фазе добавляли 0.1 объёма 3 М NaAc, рН 5.2, 3 объёма охлажденного этанола, после чего пробы выдерживали в течение 3−5 ч при -20°С. Осадок тРНК отделяли центрифугированием (12 500 об/мин, 5 мин, 2°С), промывали 200 мкл 70%-ного охлажденного этанола, высушивали на воздухе (20 — 30 мин), растворяли в краске и анализировали с помощью электрофореза в 10%-ном ПААГ в денатурирующих условиях (см. раздел 3.5). Гель окрашивали в растворе бромистого этидия (10*6 г/мл) — полосы геля, содержащие тРНК, вырезали. Дефосфорилированную тРНК элюировали из геля 300 мкл буфера 300 мМ NaAc, рН 5.2, содержащего 1 мМ EDTA и 0.5%-ный SDS, в течение 4−8 ч при 4 °C. После элюции тРНК из раствора осаждали этанолом, как описано выше, осадок.

Х’У тРНК растворяли в 10 мкл НгО и вводили Р на 5'-конец тРНК (см. раздел 3.4). Меченую тРНК выделяли с помощью электрофореза в 8%-ном ПААГ в денатурирующих условиях, как описано в разделе 3.5. Полосы, содержащие меченую тРНК, вырезалитРНК элюировали из геля и осаждали, как описано выше, после чего осадок тРНК растворяли в НгО до конечной концентрации 15 пмоль/мкл. Выход меченой тРНК составил 70−75% (около 300 пмоль) от исходного количества тРНК, взятого в реакцию дефосфорилирования.

3.7. Получение комплексов 80S рибосом с аналогами мРНК в присутствии тРНК.

Рибосомы реактивировали в буфере, А (20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 120 мМ КС1, 13 мМ MgCl2) 0.65 мМ EDTA) или Б (20 мМ HEPES-NaOH, рН 7.5, 100 мМ NH4CI, 4 мМ MgCl2, 0.15 мМ EDTA, 0.6 мМ спермидин, 0.8 мМ спермин) при 37 °C в течение 10 мин, после чего осветляли центрифугированием при 14 000 об/мин в течение 1 мин при комнатной температуре. Препараты тРНК перед использованием переводили в буфер, А или Б, реактивировали при 37 °C в течение 5 мин и помещали в лед. Связывание 80S рибосом с меченными Р аналогами мРНК в присутствии тРНК проводили, инкубируя смесь соответствующих компонентов в буфере, А или Б при 22 °C в течение 50 мин.

Для получения комплексов 1 и 6 80S рибосомы инкубировали с соответствующим аналогом мРНК и РЬе-тРНКРЬе (или тРНКРЬе) (табл. 7). Комплексы 3 и 4 получали аналогично, инкубируя 80S рибосомы с соответствующим аналогом мРНК и Val-TPHKVal (или тРНКУа1) (табл. 7). Комплексы 2 и 5 получали инкубированием комплексов 1 и 4 с Val-TPHKVal и РЬе-тРНК е, соответственно, а комплексы 7 и 8 — инкубированием комплекса 6 с тРНКУа1 и тРНК¹⁵, соответственно (табл. 7). Бинарные комплексы получали, инкубируя 80S рибосом с соответствующим аналогом мРНК.

Степень связывания меченных Р аналогов мРНК с 80S рибосомами в составе комплексов, образованных в присутствии тРНК, и в бинарных комплексах, и меченных 32Р тРНКУа1 и TpHKAsp с комплексом 6 (табл. 7), образованным в присутствии немеченого аналога V, анализировали с помощью фильтрования комплексов через нитроцеллюлозные фильтры. Для этого нитроцеллюлозные фильтры предварительно обрабатывали 0.6 М NaOH при 28 °C в течение 20 мин, затем фильтры промывали не менее 7 раз бидистиллированной водой и вымачивали в буфере, А или Б в течение 30 мин. По окончании инкубации комплексы фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры, промывали два раза соответствующим буфером (А или Б) порциями по 1 мл и связанную на фильтрах радиоактивность просчитывали во флаконах в воде по Черенкову.