Сбор белка из раствора

• 1) Осаждение белка из раствора с помощью ТХУ
• 2) Очистка от ТХУ ацетоном (повторяется 3−4 раза):
  • — разбавление раствора ацетоном
  • — центрифугирование
  • — слив супернатанта
• 3) выпарка ацетона
• 4) добавление 10 мкл красителя
• 5) термостатирование
• 6) электрофарез

Электрофарез в полиамидакрильном геле:

• 1) Дезинфексия стёкл для фареза спиртом, затеем фильтровальной бумагой и закрепление их на заливочном столике
• 2) Приготовление геля:

Используется 2 типа геля: нижний (разделяющий, отличается повышенной концентрацией) и верхний (концентрирующий).

Раствор для полиакриламидного геля (ПААГ):

А* - 0,5 М трис-HCl 0,4% SDS, pH 6,8.

A — 1,5 M трис-HCl, 0,4% SDS, pH8,8.

B — 29,2% акриламид, 0,8% бисакриламид С — 10% персульфат аммония.

D — 50% глицерин Е — 0,5 М ЭДТА-Na₂? pH=7,0.

F — 100% TEMED.

Нижний гель:

А — 1,5 мл В — 2,49мл Е — 24 мкл.

H₂O — 1,42 мл Затем С — 40 мкл.

F — 15 мкл Верхний гель:

А* - 0,625 мл В — 0,375 мл Е — 16,5 мкл.

H₂O — 1,4535 мл Затем С — 20 мкл.

D — 10 мкл После добавления C и D гели сразу взболтать и залить в стёкла. Сначала залить 3 мл нижнего геля и дождаться его затвердения, затем залить 1 мл верхнего геля и вставить в него гребёнку для образования кармашков.

Затем залить буфер.

Состав (на 500 мл буфера):

• — 7,2 г Gly
• — 1,5 г трис-ОН
• — 0,5 г SDS
• — H₂O до 500 мл

В каждую пробу добавить растворитель и краску по 3 мкл.

Состав краски:

MeOH 50 мл.

H₂O 50 мл.

AcOH 10 мл.

Coomasine 0,25 г Состав растворителя для проб:

D — 200 мкл Е — 20 мкл А* - 0,5 мл Меркаптоэтанол — 100 мкл.

SDS — 40 мг.

H₂O — 1,280 мл Бромфеноловый синий на кончике шпателя В кармашки в геле залить по 8 мкл проб (пропипетированных с растворителем и краской) и маркер.

Затем залить 2 л буфера в основную камеру установки.

Электрофарез проводится при силе тока 25 мА и напряжении 200 В Затем осадить белок в геле раствором ТХУ в течении 15 мин, после чего добавить краску и очистить раствором (7% AcOH и 5% EtOH).

Определить массу белка путём сравнения с маркером.