Природа лизоцима. 
Природа лизоцима

Лизоцимм (мурамидаза, англ. lysozyme) — антибактериальный агент, фермент класса гидролаз, разрушающий клеточные стенки бактерий путём гидролиза пептидогликана клеточной стенки бактерий муреина. Главным образом, лизоцим получают из белка куриных яиц. Также аналогичные ферменты содержатся в организмах животных, в первую очередь, в местах соприкосновения с окружающей средой — в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, слёзной жидкости, грудном молоке, слюне, слизи носоглотки и т. д. В больших количествах лизоцимы содержатся в слюне, чем объясняются её антибактериальные свойства. В грудном молоке человека концентрация лизоцима весьма высока (около 400 мг/л). Это намного больше, чем в коровьем. При этом концентрация лизоцима в грудном молоке не снижается со временем, через полгода после рождения ребёнка она начинает возрастать.

Лизоцим из белка куриных яиц представляет собой небольшой фермент (14,5 кДа), состоящий из 129 аминокислотных остатков.

История лизоцим слюна антибактериальный фермент В 1909 г. П. Л. Лащенко открыл в курином белке протеолитический фермент, который селективно повреждал клеточные стенки, содержащиепептидогликаны. Выделил в чистом виде, описал и дал название «лизоцим» в 1922 Александр Флеминг.

Трехмерная структура лизоцима впервые была получена Дэвидом Чилтоном Филлипсом (1924—1999) в 1965, когда он получил первую модель с помощьюрентгеновской кристаллографии. Структура была публично представлена на лекции Королевского института в 1965. Лизоцим стал второй белковой структурой и первой ферментной структурой, которая была получена с помощью рентгеновской кристаллографии, и первым ферментом, который содержит полную последовательность всех двадцати стандартных аминокислот.

Применение В пищевой промышленности зарегистрирован в качестве пищевой добавки E1105 (консервант).

В медицине в качестве местного антисептического средства.

Механизм лизиса Фермент атакует пептидогликаны (в частности, муреин), входящие в состав клеточных стенок бактерий (особенно много его в клеточных стенках грам-положительных бактерий — до 50−80%). Лизоцим гидролизует (1,4в)-гликозидную связь между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином. Пептидогликан при этом связывается с активным центром фермента (в форме кармана), расположенным между двумя его структурными доменами. Сорбционный центр лизоцима представляет 6 карманов (A, B, C, D, E, F), причём в A, C и E может связываться только N-ацетилглюкозамин, а в B, D и F — как N-ацетилглюкозамин, так и N-ацетилмурамовая кислота. Молекула субстрата в активном центре принимает конформацию, близкую к конформации переходного состояния. В соответствии с механизмом Филлипса, лизоцим связывается с гексасахаридом, затем переводит 4-й остаток в цепи в конформацию твист-кресла. В этом напряженном состоянии гликозидная связь между центрами D и E легко разрушается. Ингибитором лизоцима служит, в частности, трисахарид N-ацетилглюкозамина, связывающийся с каталитически неактивными центрами A, B и C и препятствующий связыванию субстрата.

Остатки глутаминовой кислоты (Glu35) и аспарагиновой кислоты (Asp52) критичны для функционирования фермента, причём Asp52 ионизирован, а Glu35 нет. Некоторые авторы полагают, что Glu35 выступает в качестве донора протона при разрыве гликозидной связи субстрата, разрушая связь, а Asp52 выступает в роли нуклеофила, при образовании интермедиата — гликозил-фермента. Затем гликозил-фермент реагирует с молекулой воды, в результате чего фермент возвращается в исходное состояние и образуется продукт гидролиза.

Другие авторы полагают, что реакция протекает через образование карбоксоний-иона, стабилизированного заряженной карбоксильной группой Asp52, в то время как высвобождение спирта катализируется по механизму общего основного катализа незаряженным карбоксилом Glu35.

Определение лизоцима в слюне Метод основан на способности лизоцима слюны и секретов слизистой оболочки носа расщеплять полисахариды клеточной оболочки бактерий Micrococcus Lysodeikticus. Активность фермента определяют нефелометрически по изменению мутности суспензии Micrococcus Lysodeikticus.

Реактивы:

Ацетоновый порошок культуры М. Lysodeikticus. 20 мг препарата тщательно растирают в небольшом объеме 1/15 M фосфатного буфера, рН 6,25, затем приливают буфер до объема 100 мл.

1/15 М K-Na-фосфатный буфер, рН 6,25. 136,15 г КН2РО4 растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. 178,4 г двузамещенного Na2HPO4 растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Смешивают 70 мл КН2РО4 (1 М) и 30 мл Na2HPO4, затем разбавляют полученный буфер до концентрации 1/15 M. рН раствора контролируется при помощи рН-метра.

Кристаллический лизоцим. 5 мг препарата растворяют в 5 мл 1/15 M фосфатного буфера, рН 6,25 (исходный раствор). Его хранят в холодильнике в течение 2 недель при +4° С. Непосредственно перед опытом исходный раствор разбавляют фосфатным буфером до концентрации 2 мкг/мл.

Смешанная слюна.

Секрет слизистой носа.

Ход определения. В опытные пробы вносят по 0,1 мл смешанной слюны, разбавленной в 2 раза 0,9% раствором NaCl (или 0,1 мл секрета слизистой носа), прибавляют 0,9 мл 1/15 M фосфатного буфера, рН 6,25, и 5 мл субстрата — Micrococcus Lysodeikticus. Пробы инкубируют 30 минут при 37 °C, после чего сразу же фотометрируют Против 1/15 M фосфатного буфера, рН 6,25 на нефелометре в кюветах с толщиной слоя 10 мм при использовании светофильтра. Активность исследуемого фермента слюны (секрета) выражают в мкг кристаллического лизоцима/мг белка за 30 минут инкубации при 37 °C. Для перехода от показателей светопропускания к количеству (мкг) лизоцима строят калибровочную кривую. Для этого берут серию пробирок, в которые вносят от 0,2 до 1 мл лизоцима (0,2−2 мкг), доводят объем проб до 1 мл 1/15 M фосфатным буфером, рН 6,25, и добавляют 5 мл М. Lysodeikticus. Контрольная проба состоит из 1 мл 1/15 М фосфатного буфера, рН 6,25, и 5 мл М. Lysodeikticus. После инкубации опытных и контрольных проб в течение 30 минут при 37 °C их фотометрируют против 1/15 M фосфатного буфера, рН 6,25. На основании полученных данных строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают количество лизоцима в пробе (мкг), на оси ординат — процент светопропускания.

Пример расчета. Процент светопропускания опытной пробы равен 70, что по калибровочной кривой соответствует 1,6 мкг лизоцима. В пробу брали 0,1 мл слюны, разбавленной в 2 раза, содержание белка слюны — 2 мг.

Содержание лизоцима = (1,6*1*2)/(0,1*2) = 16 мкг /мг белка.

В норме уровень лизоцима в слюне составляет 15 мкг/мг белка, в секрете слизистой носа — 45 мкг/мг белка.