Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториев

Диссертация: Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториев
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Как уже отмечалось в литературном обзоре, в настоящее время создан ряд кандидатных вакцин против ВИЧ-1 на основе сальмонеллы в качестве вектора. Однако все они использовались для перорального введения. В частности, рекомбинантная вакцина, сконструированная на основе бактерии Salmonella, была предложена в качестве кандидатной вакцины для оральной иммунизации против ВИЧ-1 в США (Fouts et al., 2003… Читать ещё >

Содержание

  • Основные положения, выносимые на защиту
  • Научная новизна и практическая ценность
  • Личный вклад автора
  • Публикации и апробация работы
  • Публикации по теме диссертации
  • Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. Вирус иммунодефицита человека первого типа
      • 1. 1. Строение вириона. Жизненный цикл вируса
      • 1. 2. Вакцины против ВИЧ/СПИДа
        • 1. 2. 1. Живые аттенуированные вакцины
        • 1. 2. 2. Инактивированные вакцины и вирусоподобные частицы
        • 1. 2. 3. Субъединичные вакцины
          • 1. 2. 3. 1. Нативные Env вакцины
          • 1. 2. 3. 2. Вакцины на основе модифицированного белка Env
          • 1. 2. 3. 3. Вакцины на основе Tat- белка
        • 1. 2. 4. Полиэпитопные иммуногены для индукции Т- и В-клеточного 27 иммунного ответа против ВИЧ
        • 1. 2. 5. ДНК-вакцины как способ доставки Т- клеточных полиэпитопных 28 иммуногенов
        • 1. 2. 6. Обоснование перспективности создания мукозальной вакцины 31 против ВИЧ
        • 1. 2. 7. Доставка иммуногенов с помощью аттенуированных штаммов 33 сальмонелл
        • 1. 2. 8. Суппозитории для доставки лекарственных средств и 38 микроорганизмов
  • Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
    • 2. 1. Материалы
      • 2. 1. 1. Реактивы
      • 2. 1. 2. Ферменты
      • 2. 1. 3. Плазмиды
      • 2. 1. 4. Бактериальные штаммы
      • 2. 1. 5. Культуральные и питательные среды
    • 2. 2. Методы
      • 2. 2. 1. Трансформация клеток аттенуированного штамма S. enteritidis Е23 44 методом электропорации
      • 2. 2. 2. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
      • 2. 2. 3. Гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции
      • 2. 2. 4. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле
      • 2. 2. 5. Культивирование и идентификация аттенуированных штаммов 45 сальмонелл на дифференциальных агаризованных питательных средах
      • 2. 2. 6. Серотипирование аттенуированных штаммов сальмонелл с 46 помощью агглютинирующих сывороток
      • 2. 2. 7. Оценка стабильности плазмиды pcDNA-TCI в составе S. enteritidis 46 E23/pcDNA-TCI in vitro
      • 2. 2. 8. Метод оценки патогенности S. enteritidis Е23 и S. enteritidis 47 E23/pcDNA-TCI
      • 2. 2. 9. Приготовление суппозиториев, содержащих лифилизированные 48 клетки аттенуированного рекомбинантного штамма S. enteritidis Е-23/ pcDNA-TCI
      • 2. 2. 10. Изучение персистенции штаммов штаммов S. enteritidis Е23 и 49 S enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных
      • 2. 2. 11. Анализ экспрессии гена TCI по уровню синтеза специфической 50 мРНК после иммунизации мышей суппозиториями, содержащими Salmonella enteritidis Е-23/ pcDNA-TCI
      • 2. 2. 12. Получение рекомбинантного белка TCI
      • 2. 2. 13. Определение количества специфических цитотоксических 51 лимфоцитов в селезенке иммунизированных животных с помощью реакции ELISPOT
      • 2. 2. 14. Иммуноферментный анализ сывороток иммунизированных 52 животных на наличие специфических IgG антител к TCI
      • 2. 2. 15. Иммуноблотинг с использованием тест-системы «New-Lav-blotl»
      • 2. 2. 16. Иммуноферментный анализ сывороток иммунизированных 53 животных на наличие специфических IgA антител к TCI
      • 2. 2. 17. Статистическая обработка результатов
  • Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 55 3.1. Характеристика рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA- 55 TCI
  • Список сокращений
  • А.о. — аминокислотный остаток
  • БСА — бычий сывороточный альбумин
  • ВИО-вирус иммунодефицита обезьян
  • ВИЧ-1 — вирус иммунодефицита человека 1 типа
  • ВПЧ — вирусоподобная частица
  • ИФА -иммуноферментный анализ
  • КОЕ — колониеобразующие единицы
  • ЛД50 — доза, вызывающая 50% летальность
  • МАТ — моноклональное антитело
  • М.к. -микробные клетки
  • ОП -оптическая плотность
  • ОТ-ПЦР — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией П.о. — пары оснований ПХ — пероксидаза хрена

СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита человека УФ-ультафиолетовый цАМФ — циклический аденозинмонофосфат ЦТЛ — цитотоксические Т- лимфоциты ЭДТА -этилендиаминтетрауксусная кислота сгр — ген цАМФ рецепторного белка суа — ген аденилатциклазы

ELISPOT — enzyme-linked immunosorbent spot assay

FBS (fetal bovine serum) — фетальная бычья сыворотка

HLA (human leukocyte antigen) — лейкоцитарный антиген человека

IgA — иммуноглобулины класса А

IgG — иммуноглобулины класса G

IFN-y (interferon gamma) — интерферон гамма

МНС (major histocompatibility complex) — главный комплекс гистосовместимости

MPER (membrane-proximal external region) — мембрано-проксимальный внешний регион gp41 ВИЧ

PBS (phosphate-buffered solution) — фосфатно-солевой буферный раствор SHIV (simian-human immunodeficiency virus) — вирус иммунодефицита обезьяны-человека

Для достижения поставленной дели необходимо было решить следующие задачи:

1. Оценить влияние плазмиды pcDNA-TCI на биохимические и антигенные свойства штамма S. enteritidis Е23.

2. Изучить сохранность плазмиды pcDNA-TCI в клетках аттенуированного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI.

3. Изучить вирулентность, токсичность и токсигенность штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI для теплокровных животных.

4. Изучить длительность персистенции аттенуированного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных после введения суппозиториев, содержащих рекомбинантный штамм.

5. Исследовать возможность экспрессии гена TCI в клетках пейеровых бляшек при введении суппозиториев, содержащих рекомбинантный штамм S. enteritidis Е23/ pcDNA-TCI.

6. Изучить интенсивность ВИЧ-специфического клеточного, гуморального и мукозального иммунного ответа у лабораторных животных после введения суппозиториев, содержащих S. enteritidis E23/pcDNA-TCI.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Введение плазмиды pcDNA-TCI в клетки аттенуированного штамма S. enteritidis Е23 не влияет на биохимические и антигенные свойства штамма.

2. Штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI невирулентен, малотоксичен и нетоксигенен для теплокровных животных.

3. Суппозитории, содержащие рекомбинантный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, при перректальном введении лабораторным мышам обеспечивают доставку плазмиды pcDNA-TCI и экспрессию гена TCI в клетках пейеровых бляшек.

4. Иммунизация мышей штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе суппозиториев вызывает формирование системного Т-клеточного иммунного ответа и появление специфических IgG и IgA антител в сыворотке крови против антигена TCI.

5. Повторное введение лабораторным мышам суппозиториев, содержащих S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, приводит к усилению иммунного ответа на антиген TCI.

Научная новизна и практическая ценность

1. Впервые установлено, что штаммы S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI являются невирулентными, малотоксичными и нетоксигенными для теплокровных животных.

2. В ходе исследования персистенции рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI показано, что данный штамм, также как и штамм S. enteritidis Е23, обладает ограниченной способностью к персистенции в организме млекопитающих. Установлено, что бактерии обоих исследованных штаммов не обнаруживаются в селезенке иммунизированных животных через 63 дня после однократного и через 70 дней после двукратного введения суппозиториев.

3. Впервые показано, что перректальное введение лабораторным мышам суппозиториев, содержащих лиофилизированные клетки штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, обеспечивает доставку плазмиды pcDNA-TCI и экспрессию гена TCI в клетках пейеровых бляшек.

4. Впервые показано, что после иммунизации лабораторных мышей штаммом

5. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев происходит формирование как системного Т-клеточного иммунного ответа, так и гуморального иммунного ответа, что выражалось в появлении специфических IgG и IgA в сыворотке крови против белков ВИЧ-лизата и рекомбинантного белка TCI. Схема иммунизация, основанная на двукратном введении S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, была более эффективной, чем на однократном введении.

Результаты настоящих исследований могут представлять интерес с точки зрения практического применения. Был получен ряд дополнительных характеристик, которые позволяют утверждать, что аттенуированный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI пригоден для дальнейшей разработки кандидатной вакцины против ВИЧ-1 СалВИЧ «Д». На основании полученных данных можно рекомендовать штамм S. enteritidis Е23 в качестве вектора доставки других ДНК-вакцин против вирусных и бактериальных инфекций, онкологических заболеваний. Возможно также рекомендовать использование штамма S. enteritidis Е23 для доставки биологически активных белков (например, цитокинов) в случаях, когда необходимо активировать местный иммунитет слизистой.

Личный вклад автора овные эерименты, проведенные в работе, включая ледование биохимичих, антигенных и иммуногенныхов штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, оценкаабильни ДНК-вакцины in vitro и vivo, ледование длительни пестенции в организме животных, иммунизированных S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в видеппозиториев, а также анализ полученных результатов, выполнены автором лично. Пановка ELISPOT была проведенавмнос. н

ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Каплиной О. Н. ледования патогенни штаммов S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI проводилвмносотрудниками Научно-ледователого центра токологии и гигиеничой регламентации биопрепаратов (НИЦ ТБП) ФМБА РФ.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликованы 3 статьи, две из которых — в журналах, рекомендованных ВАК для защиты диссертаций. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: на Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний», Санкт-Петербург, 2008 г- Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008 г- Keystone Symposia Global Health Series. HIV Vaccines: Progress and Prospects, Banff, Alberta, Canada, 2008 г- 3-ей конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва, 2009 год- Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири», Красноярск, 2010 г.

Публикации по теме диссертации

Публикации в отечественных и зарубежных журналах

1. Karpenko L.I., Danilenko A.V., Bazhan S.I., Danilenko E.D., Sysoeva G.M., Kaplina O.N., Volkova O.Y., Oreshkova S. F, Ilyichev A.A. Attenuated Salmonella enteritidis E23 as a vehicle for the rectal delivery of DNA vaccine coding for HIV-1 polyepitope CTL immunogen // Microbial Biotechnology. — 2012 — T.5, № 2. — P.241−250.

2. Даниленко A.B., Карпенко Л. И., Бажан С. И., Даниленко Е. Д., Бабенко O.A., Батенева A.B., Каплина О. Н., Ильичев A.A. Иммуногенные свойства ДНК-вакцины, кодирующей ВИЧ-1 полиэпитопный CTL иммуноген, в составе аттенуированного штамма Salmonella enteritidis Е23 // Сиб. мед. журн. — 2009. — Т.24, № 4, вып. 1. -С.67−72.

3. Даниленко A.B., Карпенко Л. И., Даниленко Е. Д., Бабенко O.A., Батенева A.B., Акулова Н. И., Ильичев А. А, Каплина О. Н. Изучение гуморального иммунного ответа у лабораторных животных на рекомбинантный аттенуированный штамм сальмонеллы, несущий ДНК-вакцину pcDNA-TCI, при различных схемах иммунизации // Достижения современной биотехнологии: сб. науч.тр. / Под ред. проф. И. Г. Дроздова.-Новосибирск — 2008. — С. 147−156.

Публикации в материалах всероссийских и международных конференций

1. Даниленко A.B., Карпенко Л. И., Даниленко Е. Д., Каплина О. Н., Бабенко O.A., Батенева A.B., Ильичев A.A. Изучение гуморального иммунного ответа и различных аспектов персистенции CYA, CRP-аттенуированного рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных при перректальном способе иммунизации // «Дни иммунологии в Сибири»: Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием, Красноярск, 1−3 марта 2010 г.: сб. тез.-Крас., 2010, С.18−19.

2. Даниленко A.B., Карпенко Л. И., Даниленко Е. Д., Бабенко O.A., Батенева A.B., Каплина О. Н., Ильичев A.A. Исследование гуморального иммунного ответа и длительности персистенции аттенуированного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных при различных способах введения // Конференция по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, (3- 2009- Москва): сб. тез. — М., 2009. — Т.2. — С.93.

3. Даниленко A.B., Даниленко Е. Д., Бабенко O.A., Батенева A.B., Акулова Н. И., Каплина О. Н., Карпенко Л. И. Кандидатная ВИЧ-1 вакцина на основе аттенуированного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI. Исследование гуморального иммунного ответа и длительности персистенции // «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней»: Всерос. науч.-практ. конф., -Москва, 11−12 нояб. 2008 г.: сб. тез.-М., 2008.-С.

4. Даниленко А. В., Карпенко Л. И., Батенева А. В., Даниленко Е. Д., Бабенко О. А., Акулова Н. И., Ильичев А. А. Исследование длительности персистенции аттенуированного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных при различных способах введения // «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний»: Всерос. науч. конф.: сб. тез. — СПб., 2008, — С. 30.

5. Karpenko L.I., Veremeiko Т.A., Danilenko A.V., Levagina G.M., Danilenko E.D., Bazhan S.I., Ilyichev A.A. HIV-polyepitope DNA vaccine in suppositories. Results of Preclinical study // HIV Vaccines: Progress and Prospects, March 27 — April 1, 2008, Banff, Alberta (Canada). Abstr. Book.-2008.-(A 223).-P.102.-Keystone Symposia Global Health Ser.

Глава 1. Обзор литературы

1. Вирус иммунодефицита человека первого типа

1.1. Строение вириона. Жизненный цикл вируса.

Первыми официальными научными сообщениями о СПИД стали две статьи о необычных случаях развития пневмоцистной пневмонии и саркомы Капоши у мужчин-гомосексуалистов, опубликованные в 1981. В июле 1982 впервые для обозначения новой болезни был предложен термин СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита). В сентябре того же года на основе ряда оппортунистических инфекций, диагностированных у мужчин-гомосексуалистов, наркопотребителей, больных гемофилией, А и гаитян, СПИД впервые было дано полноценное определение как болезни. В 1982 году развитие СПИД были впервые ассоциировано с инфекционным агентом (Hanrahan et al., 1982). Несколько независимых групп исследователей идентифицировало вирус, вызывающий иммунодефицит, который был отнесен к семейству Retroviridae, роду Lentivirus (Barresinoussi et al., 1983- Gallo etal., 1983- Levy et al., 1984). env—gpl20 env-gp4T vpx-pl

Рис. 1. Схема строения вириона ВИЧ-1 (www.microbiologybytes.com).

Вирион ВИЧ-1 имеет сферическую форму, диаметром 100−150 нм. Основные черты строения сходны с другими представителями рода лентивирусов. Наружная оболочка вируса состоит из бислоя липидов, который имеет происхождение из клеточной мембраны клетки хозяина. В эту мембрану встроены поверхностные молекулы ВИЧ-

§-р160. Так как мембрана имеет клеточное происхождение, то на ее поверхности и внутри нее сохраняется множество клеточных белков. Под наружной оболочкой располагается сердцевина вируса (кор), которая имеет форму усеченного конуса и образована белком р24. Промежуток между наружной вирусной мембраной и сердцевиной вируса заполнен матриксным белком р17. Внутри сердцевины располагаются две молекулы вирусной РНК, связанные с низкомолекулярными белками (р9 и р7) (рис. 1).

Геном ВИЧ-1 представлен двумя позитивными копиями РНК размером около 10 000 нуклеотидов, кодирующими 15 белков (рис. 2) (Hahn et al, 1984). из RU5 790 1186 S' LT|R

34 PI

MA CA H рб

634 PBS

5559 5970(

PR RT RH IN

U3 RU

3'LTR

8653 PPT

Рис. 2. Схематическое представление генома ВИЧ-1. Геном ВИЧ-1 содержит три структурных гена — gag, pol и env, а также шесть вспомогательных генов (vif vpr, tat, rev, vpu, nef). Структурные гены кодируют белки матрикса (MA), капсида (СА), нуклеокапсида (NC), рб, р2 и pi (gag) — протеазу (PR), обратную транскриптазу (RT), РН полипептид (РН), интегразу (IN) (pol) — поверхностный (SU, gpl20) и трансмембранный (TM, gp41) белки оболочки (env). Гены расположены в одном ряду в соответствии с рамкой считывания. На конце генома обозначены длинные концевые повторы — LTR, подразделенные на U3, R и U5 последовательности, а также прилежащие к ним сайт инициации репликации (PBS) и полипуриновый тракт (РРТ). Цифры сверху и снизу каждого прямоугольника соответствуют координатам начала и окончания структурной единицы, соответственно. Приведенная нумерация соответствует штамму HXB2CG ВИЧ-1 (www.hiv.lanl.gov'). Линейка, определяющая масштаб, расположена внизу рисунка.

Три района генома env, pol и gag поставляют структурные белки и ферменты, критичные для вирусной репликации- остальные гены vif vpr, tat, rev, vpu и nef кодируют белки, выполняющие дополнительные функции, которые также имеют огромное значение для жизненного цикла вируса.

Ген env кодирует белки оболочки, которые необходимы для связывания с клеткой хозяина. Гликопротеин-предшественник gpl 60 разрезается клеточной протеазой на функциональные белки оболочки: поверхностный gpl20 и трансмембранный gp41 (Allan et al., 1985- Robey et al., 1985- Veronese et al., 1985), которые нековалентно связываются между собой, формируя тримеры (Earl et al., 1990). Начало инфекции обусловлено координированным действием этих белков, когда gpl 20 связывается с рецептором на поверхности лимфоцита, затем претерпевает конформационное изменение, которое экспонирует вторичный сайт связывания с корецептором на поверхности клетки хозяина. Вторичное связывание с корецептором приводит к диссоциации gp41 из комплекса и его последующему внедрению в клеточную мембрану, что, таким образом, создает сайт для вхождения вируса в клетку. После вхождения в клетку белки, кодируемые генами gag и pol, продолжают процесс. Вирусная обратная транскриптаза преобразует одноцепочечный РНК- геном в двуцепочечную ДНК (Goff et al., 1990), которая встраивается в клеточный геном с помощью вирусной интегразы (Lafemina et al., 1992). Белки, продуцируемые с вирусного генома, которые впоследствии процессируются вирусной протеазой, вместе с вирусной РНК формируют новые вирусные частицы, высвобождаемые в межклеточное пространство или заражающие соседние клетки. Вирус в полной мере использует для своих нужд клеточную систему хозяина и инициирует патогенный механизм апоптоза (Stevenson et al., 2003).

После идентификации инфекционного агента ожидалось, что эффективная вакцина против СПИДа будет создана в течение ближайших 3−10 лет, но ее нет и по сей день. Эпидемия ВИЧ/СПИД продолжает распространяться в России и в мире. Так, по данным Федерального научно-методического Центра по профилактике и борьбе со СПИДом (www.hivrussia.ru) в 2011 году в РФ число инфицированных ВИЧ-1 выросло на 7% и составило 660 тысяч человек. В мире ежедневно инфицируется вирусом 7400 человек.

Одной из причин сложившейся ситуации является то, что ВИЧ-1 отличается от других вирусов, вызывающих инфекционные заболевания, против которых были успешно разработаны вакцины в прошлом. Эти отличия порождают проблемы, с которыми сталкиваются ученые в попытках создать вакцину (Chhatbar et al., 2011).

Первой проблемой является гипервариабельность ВИЧ-1. ВИЧ-1 характеризуется крайней изменчивостью как на уровне зараженных индивидов, так и на уровне популяции.

Второй проблемой является способность ВИЧ-1 уклоняться от действия нейтрализующих антител.

Это возможно по ряду причин: внешняя белковая оболочка вируса покрыта плотной сеткой углеводов-

места прикрепления вируса к клеточным рецепторам (СБ4) защищены от нейтрализующих антител-

высокое генетическое разнообразие «уводит» иммунную реакцию в сторону от производства нейтрализующих антител широкого спектра действия.

Нейтрализующие антитела широкого спектра действия не вырабатываются в большинстве случаев естественной ВИЧ-инфекции, поэтому обычная вакцинологическая стратегия «подражания» естественной инфекции для индуцирования нейтрализующих антител может оказаться неэффективной против ВИЧ-1. Чтобы успешно решить этот вопрос, в настоящее время разрабатываются новые способы индукции нейтрализующих антиВИЧ-1 антител.

Третьей проблемой является то, что ВИЧ-1 встраивает свой генетический материал в человеческий геном и создает пожизненную инфекцию. После такого встраивания ВИЧ-инфицированные клетки не отличаются от неинфицированных клеток, что приводит к невосприимчивости и неэффективности механизмов иммунной защиты.

Четвертой проблемой является отсутствие в настоящее время идеальной модели инфекции на животных, на которой можно было бы проверить эффективность вакцины против ВИЧ-1. Использование для моделирования инфекции человекообразных обезьян очень дорого и, кроме того, патогенез заболевания, вызванного ВИЧ-1 и вирусом иммунодефицита обезьян (ВИО), а также основные антигены гистосовместимости у обезьян и человека отличаются. Исследователям вакцин против ВИЧ-1 приходится полагаться на трансгенные животные модели, но прогностическая ценность таких моделей будет оставаться неопределенной до тех пор, пока не будет продемонстрирована способность кандидатной вакцины защитить человека против СПИДа в рамках клинических испытаний.

Пятой проблемой является отсутствие сведений о том, какой силы должен быть индуцируемый вакциной протективный иммунный ответ. При многих других вирусных инфекциях можно выявить лиц, которые инфицируются патогеном, отвечают на него спонтанной иммунной реакцией и побеждают инфекцию. Исследование таких лиц приводит к выявлению параметров иммунного ответа организма, необходимого и достаточного для борьбы с инфекцией, что облегчает создание вакцины. Для ВИЧ-1 не существует задокументированного случая выздоровления от инфекции, и параметры протективного иммунного ответа остаются неизвестными. В отсутствии таких сведений у ученых нет достоверных маркеров для определения того, насколько одна кандидатная вакцина лучше другой. Неясно, сколько — одна или более — врожденных, клеточно-опосредованных, мукозальных иммунных реакций или гуморальных реакций необходимо, чтобы обеспечить защитный иммунитет. В частности, мукозальный иммунитет может потребоваться для профилактики ВИЧ-инфекции на самых ранних стадиях.

Шестой проблемой является отсутствие знаний об антигенах ВИЧ-1, которые необходимы для индуцирования защитной реакции, поэтому разработчики создают кандидатные вакцины для проверки ряда антигенов ВИЧ-1 в различных комбинациях. Однако пока систематически в клинических или доклинических исследованиях не были проверены различные антигены ни одного из векторов. До тех пор, пока не будет достигнута некоторая эффективность вакцин в клинических испытаниях и/или не будут выполнены системные исследования на приматах, этот вопрос останется нерешенным (Haut et al., 2009).

Хотя задача разработки вакцины против ВИЧ-1 является крайне сложной, считается, что это принципиально возможно. К тому же нет другого пути справиться с эпидемией или ограничить ее масштабы (Picker et al., 2012). Это убеждение основано в определенной мере и на практических наблюдениях. Известно, что: небольшое число лиц не подвергается заражению, несмотря на многократные контакты с ВИЧ-инфекцией. Можно предположить, что исследование ВИЧ-1-специфического иммунного ответа таких людей позволит выявить и исследовать механизмы защиты, что может быть использовано при создании вакцины-

мощные клеточные иммунные реакции против ВИЧ-1 у небольшого числа лиц могут подавлять вирусную нагрузку до невыявляемых уровней-

при обычном течении ВИЧ-инфекции клеточный иммунитет подавляет вирусную нагрузку в течение длительного периода времени, часто в течение десятилетия-

обезьяны, иммунизированные живой ослабленной вакциной, полностью защищены против вируса иммунодефицита обезьян (ВИО), который обычно вызывает СПИД у обезьян-

нейтрализующие антитела широкого спектра действия против ВИЧ-1 могут полностью защитить обезьян от инфицирования гомологичным гибридным вирусом иммунодефицита обезьяны/человека.

1.2. Вакцины против ВИЧ/СПИДа

Работы по созданию вакцины против ВИЧ-инфекции активно ведутся и в России, и за рубежом В России такие работы ведутся в следующих крупных центрах

ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России и НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН (Гудима и др 2007, Гудима и др, 2008), авторы вакцины «ВИЧРЕПОЛ», первой российской вакцины, успешно прошедшей первую фазу клинических испытаний,

Санкт-Петербургский консорциум, разработавший ДНК-вакцину на основе российского варианта ВИЧ-1 субтипа, А — «ДНК-4»,

ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», разработавший вакцину «КомбиВИЧвак», на основе полиэпитопных B-клеточного и Т-клеточного иммуногенов (Karpenko et al, 2010) В 2011 г была завешена первая фаза клинических испытаний вакцины «КомбиВИЧвак» и показана ее безвредность

Среди зарубежных разработок следует выделить три вакцины, которые дошли до третей фазы клинических испытаний

В США, Канаде и Нидерландах была запущена плацебо-контролируемая 3 фаза клинических испытаний gpl20 субъединичной кандидатной вакцины производства фирмы VaxGen, которая вовлекла 5400 добровольцев с высоким риском половой передачи ВИЧ, в основном, гомосексуалистов (Graham et al, 1998) Это была первая ВИЧ- вакцинная конструкция, поступившая на 3 фазу клинических испытаний Вакцинная конструкция содержала смесь двух рекомбинантных gpl20 белков из вирусов ВИЧ-1 субтипа В, один из штамма MN, другой из первичного изолята GNE8 (Gilbert et al, 2005, Flynn et al, 2005) Вакцина индуцировала высокий титр Env-специфичных нейтрализующих антител против ВИЧ-1 MN и SF162, но низкий титр широконейтрализующих антител против остальных штаммов вирусов ВИЧ-1 и -2 (Gilbert et al, 2010)

Третья фаза клинических испытаний похожей вакцины, представляющей собой смесь рекомбинантных белков, gpl20 из штамма MN субтипа В и gpl20 из первичного изолята-штамма А244 субтипа Е (AIDSVAX В/Е), началась в Таиланде примерно в то же самое время Испытания проводили на 2500 добровольцах-наркоманах (Pitisuttithum et al, 2006)

В результате было показано, что ни одно из этих исследований не установило статистически значимого уменьшения частоты инфицирования ВИЧ-1 у вакцинируемых, несмотря на повторявшиеся через 2 года бустерные иммунизации (Gilbert et al., 2005, Gilbert et al., 2005). Наблюдаемое уменьшение частоты инфицирования ВИЧ-1 в определенных этнических группах в исследовании коррелировало с высоким титром антител против gpl20, но количество таких случаев было слишком мало для статистической достоверности результатов (Cohen et al., 2003).

Еше один вакцинный кандидат, дошедший до третьей фазы клинических испытаний, был создан на основе репликационно-некомпетентного аденовируса 5 серотипа, экспрессирующего гены белков ВИЧ-1: Gag, Pol, Nef. Целью этой вакцинной стратегии была индукция ВИЧ-1 специфического клеточного иммунного ответа. Эта фаза клинических испытаний показала, что вакцина на основе вектора Ad5 индуцирует клеточный иммунный ответ у большинства испытуемых, хотя у некоторых добровольцев персистенция вирусного вектора в организме была ограничена за счет наличия собственных Аё5-специфичных нейтрализующих антител. Исследования, проводимые в рамках 2Ь фазы клинических испытаний, спонсируемых фирмой Merck и Национальным институтом здоровья США, были прерваны после того, как стали известны промежуточные результаты, которые показали, что вакцина не может предотвратить заражение ВИЧ-1 или снизить вирусную нагрузку после инфицирования, а также то, что наличие предшествующих нейтрализующих антител к аденовирусу у вакцинируемых приводит к повышению риска заражения ВИЧ-1.

Наиболее успешной из всех разработанных и прошедших третью стадию клинических испытаний вакцин против ВИЧ-1 явилась кандидатная вакцина, концепция которой строилась на основе прайм-бустерного введения двух субъединичных вакцин ALVAC-HIV и AIDSVAX В/Е, разработанных фирмами Sanofi Pasteur и VaxGene. Результаты испытаний ВИЧ-1 вакцины, проводившихся в Таиланде в 2003—2006 годах, в которых участвовало 16 000 добровольцев, показали, что прайм-бустерная стратегия иммунизации уменьшает уровень заражения ВИЧ-1 на 26,1−31,4%, но не снижает вирусную нагрузку у тех добровольцев, кто стал ВИЧ-1- инфицированным после вакцинации. Надо сказать, что в этом случае впервые клинические испытания ВИЧ-1- вакцинного кандидата показали определенную эффективность в предотвращении передачи вируса (Robb et. al., 2012).

В следующих главах будут более подробно рассмотрены концепции, на основе которых разрабатывались вакцины против ВИЧ-1.

1.2.1. Живые аттенуированные вакцины

Действующим началом живых аттенуированных вакцин является аттенуированный ВИЧ-1. Эксперименты по созданию аттенуированных вакцин проводились с использованием модели инфекции обезьян. Рядом экспериментаторов получены мутанты SIV (Simian Immunodeficiency Virus — вирус иммунодефицита обезьян) с делецией гена nef. Было показано, что такие мутанты могут служить живыми вакцинами, которые вызывают защиту от заражения патогенным SIV у обезьян (Wyand et al., 1999, Cranage et al., 1997, Joag et al., 1998). Параметры защиты животных, иммунизированных 'с помощью штамма SIV с делетированным геном nef остаются пока до конца неизученными (Koff et al., 2006), несмотря на доказательство индукции продолжительного ЦТЛ ответа (Johnson et al., 1997, Gauduin et al., 1999). Было обнаружено, что SIV вызывает иммунный ответ, который защищает обезьян от заболевания при заражении патогенным вирусом, но не защищает от заражения при повторной встрече с возбудителем. В работе Genesca с соавторами было показано, что непатогенный штамм SHIV 89.6 может вызывать продолжительный иммунный ответ у обезьян, который не обеспечивает защиту против повторной инфекции SIV, но препятствует неконтролируемой репликации вируса. В эксперименте была продемонстрирована роль Т-клеточного звена иммунитета в такой защите (Genesca et al., 2009, Genesca et al., 2008). Однако из соображений безопасности живые аттенуированные вакцины не испытываются на людях, поэтому сделать заключение о перспективности дальнейших работ не представляется возможным.

1.2.2. Инактивированные вакцины и вирусоподобные частицы

В попытках создания вакцины против ВИЧ-1 использовались инактивированные вирусные частицы. Инактивированные SIV (simian immunodeficiency virus) или SHIV (simian-human immunodeficiency virus) вакцины получали путем мягкого окисления с алдитриол-2 для удаления ионов цинка из белков Gag и IN или алкилирования с помощью N-этиленимина или через инактивацию вирусной РНК с помощью УФ и псоралена. Иммуногенность полученных препаратов была низкой (Lifson et al., 2004). Такой результат, возможно, являлся следствием наличия небольшого количества гликопротеинов в составе данной вирусной частицы (Zhu et al., 2006).

В экспериментах на культурах клеток насекомых с помощью бакуловирусных векторов было показано, что белки Gag и Env ВИЧ-1 и SIV спонтанно собираются, образуя так называемые вирусоподобные частицы (ВПЧ) (Doan et al., 2005, Zanotto et al., 2005). Эти ВПЧ использовали в экспериментах по исследованию иммуногенности данных белков. ВПЧ на основе белков Gag и Env SIV были протестированы на человекообразных обезьянах с использованием нескольких путей введения, включая назальный путь. Их иммуногенность оказалась низкой даже при использовании холерного токсина в качестве адыованта. Было показано отсутствие образования широко нейтрализующих антител при введении ВПЧ на основе белка Env ВИЧ-1 мышам и морским свинкам (Kim et al., 2007). Однако использование прайм-буст стратегии, когда для праймирующей иммунизации использовали ДНК-вакцину, позволило усилить иммуногенность вакцины ВПЧ (Buonaguro et al., 2007). Было показано, что ВПЧ, включающая модифицированный белок Env в его нативной форме и бактериальный флагеллин как адыовант, может эффективно стимулировать клеточный ответ и, следовательно, этот подход может быть перспективным для создания антиВИЧ-1 вакцины (Vassilieva et al., 2011).

1.2.3. Субъединичные вакцины

1.2.3.1. Нативные Env вакцины

Белковые субъединичные вакцины разрабатывались на основе мономерного белка gpl60 ВИЧ-1 (Dolin et al., 1991, Belshe et al., 1993, Keefer et al., 1994). В дальнейшем для создания кандидатных вакцин стали использовать белки gpl20 и gpl40. Эти антигены вводили в организм в растворимой форме с использованием такого адъюванта, как окись алюминия. Показано, что субъединичные вакцины на основе белка Env индуцировали нейтрализующие антитела, которые, в основном, были направлены на гипервариабельную V3 петлю белка gpl20 и были способны защищать обезьян против гомологичного или близкородственного штамма ВИЧ-1, но не защищали от заражения гетерологичным штаммом вируса (Girard et al., 1991, Fultz et al., 1992, Girard et al., 1995, Berman et al., 1996). Аналогично на модели SHIV/обезьяна было показано, что вакцины, основанные на gpl20, были способны обеспечивать защиту против заражения гомологичным SHIV (Mooij et al., 1998), но не против заражения гетерологичным штаммом вируса (Stott et al., 1998).

В результате пассивной иммунизации с помощью моноклинального антитела, направленного на нейтрализующий эпитоп, расположенный в V3 петле gpl20 ВИЧ-1, была продемонстрирована защита обезьян от заражения гомологичным лабораторно-адаптированным Illb изолятом вируса (Emini et al, 1990). Однако в других исследованиях было показано, что большинство первичных изолятов ВИЧ-1 являлись устойчивыми к нейтрализации (Moore et al., 1995). Не было показано индукции нейтрализующих антител к первичным ВИЧ-1 изолятам у более, чем 2000 добровольцев, которые были провакцинированы в период между 1988 и 1996 годами кандидатной вакциной Env с использованием таких адъювантов, как оксид алюминия или оксид алюминия и деоксихолат (McElrath et al, 1996, Burton et al, 1998). Попытка повысить эффективность иммунизации с помощью введения белка gpl20 SIV в комплексе с различными адъювантами, липосомами или иммуностимулирующими комплексами не дала существенного результата (Browning et al, 1992), поскольку было показано, что эти способы недостаточно эффективны для формирования протективного иммунного ответа у обезьян при их заражении SIV (Hulskotte etal., 1995).

1.2.3.2. Вакцины на основе модифицированного белка Env

В попытках улучшить иммуногенность белка Env, а также его способность индуцировать образование ВИЧ-1 широконейтрализующих антител было разработано несколько новых подходов (Girard et al, 2006, Vaine et al, 2010).

Эти подходы состоят в следующем.

1. Были использованы тримерные gpl40 молекулы, стабилизированные добавлением гетерологичного тримеризационного домена на С-конце последовательности gp41 (Yang et al, 2002), a также gpl40 тримеры с делецией 30 аминокислот в участке гипервариабельной V2 петли для лучшего экспонирования нейтрализующих эпитопов, перекрывающихся с С04-связывающим сайтом (Barnett et al, 2001, Srivastava et al, 2003, Srivastava et al, 2003). Тримерные deltaV2 gpl40 молекулы сами по себе и в смеси с адъювантами индуцировали высокий титр гомологичных Env связывающих антител, но низкий титр гетерологичных нейтрализующих антител (Lian et al, 2005, Li et al, 2006). Было показано, что системная иммунизация или комбинация системной и мукозальной иммунизации вакциной на основе белка deltaV2 Env BH4−1sfi62 защищает самок обезьян против интравагинального заражения гомологичным вирусом (Barnett et al, 2008), но не защищает против заражения гетерологичным вирусом (Xu et al., 2006).

2. Тримерные gpl 60 молекулы были внутренне стабилизированы дисульфидной связью между gpl20 и gp41 (так называемые SOS белки). Их иммуногенность на лабораторных животных была исследована с использованием прайм-буст схемы. В качестве прайм-иммунизации вводилась ДНК, кодирующая SOS белок, а в качестве буст-иммунизации вводился рекомбинантный белок. В результате был получен высокий титр нейтрализующих антител против штаммов вируса того же субтипа, но с низким уровнем нейтрализующих антител против штаммов вируса других субтипов (Beddows et al., 2005).

3. Были получены олигомерные gpl40 молекулы, ковал ентно соединенные с синтетическими имитаторами CD4 рецептора (Devico et al, 1996, Fouts et al., 2002). При использовании таких антигенов было показано, что у обезьян появляются нейтрализующие антитела к эпитопам ВИЧ-1, «открытие» которых для нейтрализации антителами индуцируется связыванием gpl 60 с CD4 рецептором при вхождении вируса в клетку (Fouts et al., 2000). Использование таких белков способствовало уменьшению вирусной нагрузки (DeVico et al., 2007).

4. Была протестирована смесь Env иммуногенов из основных штаммов ВИЧ-1 (Nabel et al., 2005, Hurwitz et al., 2005, Seaman et al., 2005), циркулирующих в мире, в надежде, что мультивалентная Env вакцина будет способствовать расширению спектра образующихся в организме нейтрализующих антител (Lu et al., 2010). И действительно, было показано, что вакцина на основе белка Env из разных субтипов ВИЧ-1 вызывала у макак резус более интенсивный иммунный ответ, чем моновалентная Env вакцина.

5. Синтетические гены, созданные на основе теоретически определенной консенсусной последовательности белка оболочки ВИЧ-1 (Gao et al., 2005, Doria-Rose et al., 2005, Thomson et al., 2005) использовали для индукции T- и В- клеточного иммунного ответа, и в частности, нейтрализующих антител (Gao et al., 2007). В результате было показано, что антитела хорошо нейтрализуют ВИЧ-1 Env псевдовирусы и лишь частично нейтрализуют спектр Env 2 tier псевдовирусов. В другой работе было показано, что ВПЧ, содержащая консенсусную последовательность белка Env субтипов В или С, введенная через слизистую легких мышей, вызывала значительный клеточный системный и мукозальный иммунный ответ против эпитопов белка штаммов вируса ВИЧ-1 субтипов В и С и была более эффективна при индукции иммунного ответа в сравнении с ВПЧ, содержащей моновалентный белок Env субтипа С (McBurney et al., 2009).

Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториев (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

выводы.

1. Показано, что клетки штамма S. enteritidis Е23 и рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, содержащего плазмиду, имеют одинаковые биохимические свойства и антигенные маркеры, при этом рекомбинантный штамм устойчив к ампициллину и растет в 1,6 раза медленнее.

2. Установлено, что плазмида pcDNA-TCI стабильно сохраняет свою структуру в клетках S. enteritidis Е23 в условиях in vitro и in vivo.

3. Показано, что штаммы S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI имеют показатель ЛД5о при внутрибрюшинном заражении белых мышей (6,8±-0,3)х106 и о.

2,9±-0,4)х10 микробных клеток/животное, соответственно, что позволяет отнести их к невирулентным. Термически инактивированные культуры S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI являются малотоксичными и имеют показатели ЛД5о, о о равные (4,7±-0,2)х10 и (5,2±-0,5)х10 микробных клеток/животное, соответственно. Показатель ЛД50 для фильтратов клеточных культур обоих штаммов составил более 1,6 мл/животное, что позволяет сделать вывод об отсутствии у бактериальных штаммов токсигенных свойств.

4. Установлено, что штаммы S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI обладают ограниченной способностью к персистенции в организме мышей при о введении суппозиториев, содержащих 10 клеток соответствующего штамма. Клетки.

5. enteritidis E23/pcDNA-TCI обнаруживаются в селезенке иммунизированных мышей вплоть до 63-го дня после однократного и до 70 дня после двукратного введения суппозиториев. В пейеровых бляшках как рекомбинантный, так и исходный штаммы обнаруживаются со 2-го по 15-ый день после однократного введения. В крови и легких иммунизированных животных сальмонелл не обнаружено в течение всего срока наблюдения.

5. Показано, что препарат суммарной РНК из клеток пейеровых бляшек мышей, иммунизированных S. enteritidis Е23/ pcDNA-TCI в составе суппозиториев, содержит специфическую РНК, соответствующую гену TCI, что свидетельствует об экспрессии гена TCI в данных клетках лабораторных животных.

6. Показано, что введение мышам S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе суппозиториев вызывает индукцию ВИЧ-специфического клеточного, гуморального и мукозального иммунного ответа. Схема иммунизации, основанная на двукратном введении S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, является более эффективной, чем на однократном.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает благодарность сотрудникам отдела биоинженерии ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»: Каплиной О. Н. за помощь в проведении ИФА и ЕЫБРОТ, Слесаренко Л. В. за техническую помощь в работе и дружеское участие, и всем остальным сотрудникам отдела за ценные советы и помощь в экспериментальной работе и оформлении диссертации. Автор также благодарит сотрудников Института медицинской биотехнологии Терещенко Т. А., Левагину Г. М. за помощь в получении суппозиториев, Лебедева Л. Р. за помощь в получении рекомбинантного белка ТС1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Значительная часть новых случаев инфицирования ВИЧ-1 происходит при половом контакте, поэтому вакцина против вируса должна обеспечивать защиту одновременно как в слизистых в области проникновения вируса, так и при передаче вируса через кровь. Считается, что рекомбинантные штаммы сальмонелл, несущие антигены ВИЧ-1 или их ген-эквиваленты в составе ДНК вакцины — это один из наиболее перспективных путей создания мукозальной антиВИЧвакцины (Fouts et. al., 1995/ Hopkins et. al., 1995). В частности, такого же мнения придерживается первооткрыватель ВИЧ-1 Роберт Галло (Gallo et. al., 2006).

Преимущество непарентерального способа ДНК-вакцинации с использованием аттенуированных сальмонелл, по сравнению с инъекционным, заключается в том, что при непарентеральном введении ДНК-вакцины в составе бактериального вектора, помимо гуморального и клеточного, активируется и специфический мукозальный иммунитет, создающий барьер для проникновения вируса в организм (Shata et. al., 2002). При использовании данного подхода не требуется проведения дорогостоящей стадии очистки ДНК-вакцины или антигена. Кроме того, непарентеральный способ введения технически менее сложен, что особенно важно при планировании массовых иммунизаций, охватывающих группы риска.

Как уже отмечалось в литературном обзоре, в настоящее время создан ряд кандидатных вакцин против ВИЧ-1 на основе сальмонеллы в качестве вектора. Однако все они использовались для перорального введения. В частности, рекомбинантная вакцина, сконструированная на основе бактерии Salmonella, была предложена в качестве кандидатной вакцины для оральной иммунизации против ВИЧ-1 в США (Fouts et al., 2003, Institute for Human Virology University, Maryland, USA) и вышла на первую фазу клинических испытаний. В России также проводятся работы по созданию пероральной вакцины против ВИЧ-1 на основе аттенуированного штамма сальмонеллы, несущего ДНК-вакцину, кодирующую оболочечный белок ВИЧ-1 gpl 20 (Мурашев, и др., 2006).

Если сравнивать пероральный и перректальный способы введения, то перректальный способ предпочтителен по двум причинам. Первая заключается в том, что слизистая кишечника служит одними из главных «ворот» инфекции — местом проникновения ВИЧ-1, а также начальным и преимущественным местом репликации вируса, следовательно, перректальное введение ДНК-вакцины обеспечивает развитие иммунной реакции непосредственно в «воротах» инфекции. Кроме того, перректальная вакцинация не требует антацидов, нейтрализующих кислый pH желудка, как это необходимо в случае перорального введения.

В настоящей диссертационной работе приведены результаты дополнительных исследований по характеризации ранее разработанной кандидатной вакцины против ВИЧ-1, представляющей собой ректальные суппозитории, содержащие лиофилизированную биомассу клеток аттенуированного штамма Salmonella enteritidis Е23, трансформированных ДНК-вакциной pcDNA-TCI, несущей ген искусственного белка TCI.

Прежде всего, были проведены исследования, связанные с доказательствами безопасности и безвредности полученной кандидатной вакцины.

В результате этих работ было показано, что введение плазмиды ДНК-вакцины в состав S. enteritidis Е23 не повлияло на фенотип аттенуированого рекомбинантного штамма. П£ биохимическим и антигенным характеристикам штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI полностью соответствует родительскому.

Исследование персистенции рекомбинантного штамма S. enteritidis i?25/pcDNA-TCI показало, что штамм обладает пониженной способностью к размножению в организме млекопитающих. Среди мышей, которым клетки сальмонеллы вводили перректально, не наблюдали гибели животных. Рекомбинантный штамм, также как исходный, не был выделен из крови и легких иммунизированных животных. В ткани тонкого кишечника микробные клетки обнаруживались 4 дня, в пейеровых бляшках-в течение 15 дней. Наиболее длительно штаммы сальмонеллы сохранялись в селезенке мышей, однако и из этого органа штамма S. enteritidis .E2.?/pcDNA-TCI элиминировался через 63 дня после однократного и через 70 дней после двукратного введения. Этот факт указывает на то, что аттенуированный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, также как исходный, в конечном итоге удаляется из организма под действием иммунной системы.

Исследования патогенности штаммов Salmonella enteritidis Е-23 и Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI, проведенные совместно с сотрудниками НИЦ ТБП Минздрава РФ, показали, что оба штамма являются невирулентными, малотоксичными и нетоксигенными для теплокровных животных. На основании полученных данных эксперты НИЦ ТБП сделали заключение о том, что данные штаммы Salmonella не представляют опасности для здоровья человека, т. е. относятся к первой категории риска.

Федеральный закон «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» № 86-ФЗ от 5 июля 1996 года, ст. 7).

Кроме того, было показано, что ректальные суппозитории, содержащие вмешанную в суппозиторную основу лиофилизированную биомассу клеток штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущих антиВИЧ-ДНК-вакцину, обеспечивают формирование специфического иммунного ответа.

Закономерным является вопрос о механизме доставки ДНК-вакцины с помощью аттенуированных бактерий при перректальном способе введения и механизме активации под действием ДНК-вакцины иммунного ответа. На наш взгляд, механизм попадания рекомбинантной сальмонеллы в организм и реализации ее иммуногенной активности может быть следующим (гипотетическая схема приведена на рисунке 14).

После перректальной иммунизации сальмонелла проникает в организм через М-клетки кишечника, которые представлены в слизистой как тонкого, так и толстого кишечника, захватывается макрофагами и по лимфатической системе переносится этими клетками в региональные органы иммунной системы, включая пейеровы бляшки. Далее происходит лизис сальмонеллы в макрофагах (в частности, благодаря аттенуации), в результате которого плазмида попадает в ядр макрофага, где обеспечивает экспрессию целевого гена, синтез целевого белка и как следствие, индукцию специфического клеточного, гуморального и мукозального иммунного ответа.

В данном исследовании, при использовании аттенуированной S. enteritidis Е23 в качестве вектора для доставки pcDNA-TCI, была показана экспрессия гена TCI в пейеровых бляшках с помощью ОТ-ПЦР. Эти результаты подтверждают правильность вышеуказанной гипотезы и демонстрируют, что сальмонелла способна доставлять плазмиду в антигенпрезентирующие клетки кишечника при перректальной иммунизации. ген TCI.

Ар

Клетки Salmonella, несущие плазмиду pcDNA-TCI.

Ч.

DD.

Проникновение клеток Salmonella в ткани.

Гастроинтерстициональный тракт ftmw^^jmmim.

Трансформация клеток.

Salmonella.

Бактериальный лизис.

Перректальная иммунизация.

Индукция плазматических Т-хелперных клеток, а TCR.

Антиген.

Индукция цитотоксического, гуморального и мукозального иммунного ответа.

Рис. 14. Гипотетическая схема доставки и экспрессии плазмидной ДНК, несущей ген TCI, при использовании в качестве вектора доставки сальмонеллы.

Перректальное введение мышам суппозиториев, содержащих 108 клеток Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, индуцирует у иммунизированных животных:

1) клеточный иммунный ответ, оцениваемый по увеличению количества спленоцитов иммунизированных животных, продуцирующих IFN-y при их стимуляции in vitro специфическими пептидами и белком TCI. Это в свою очередь, предполагает антигенспецифическую активацию CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов.

2) гуморальный иммунный ответ, определяемый по наличию антител класса IgG и IgA к лизату нативных белков ВИЧ-1, а также к рекомбинантному белку TCI.

Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что при ДНК-иммунизации с использованием суппозиториев, содержащих клетки Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, реализуются все стадии, необходимые для доставки целевого иммуногена иммунной системе, а именно экспрессия гена TCI, процессинг и представление целевого белка и его отдельных эпитопов Ти В-лимфоцитам.

Таким образом, в результате проделанной работы получены новые данные, подтверждающие безвредность и эффективность кандидатной вакцины против ВИЧ-1 в виде суппозиториев, содержащих лиофилизированную биомассу клеток штамма 5. еМегШсИз Е23/рсЭКА-ТС1. Полученные данные позволяют предполагать, что кандидатная вакцина может быть эффективна в клинической практике для вакцинации против ВИЧ-1.

1. Бойченко М. Н., Воробьев A.A., Гусев В. В., Тымчук С. Н. Возможность использования мутантов суа и сгр сальмонелл в качестве векторов рекомбинантной вакцины орального применения. // Вестн. РАМН. 1994 — № 4 — С.62−63.

2. Бойченко М. Н., Воробьев A.A., Тымчук С. Н. Перспектива получения мутантов суа и сгр сальмонелл для использования в качестве вакцинных штаммов // Вестн. РАМН. 1995 — № 10 — С.37−39.

3. Бойченко, М.Н., Воробьев, A.A. Использование сальмонелл в качестве вектора при создании рекомбинантных вакцин // Вестник РАМН 1997 — № 23 — С.43−46.

4. Бондаренко В. М., Воробьев A.A., Белявская В. А. Векторные мукозальные бактериальные вакцины: проблемы и перспективы // ЖМЭИ 2002 — № 6 — С.5−9.

5. Гудима Г. О., Сидорович И. Г., Карамов Э. В., Решетников A.B., Хаитов P.M. Опыт клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин // Иммунология 2008 — Т. 29. — № 5-С.252−263.

6. Карпенко Л. И., Бажан С. И., Некрасова H.A., Белавин П. А., Данилюк Н. К., Серегин C.B., Бабкина И. Н., Игнатьев Г. М., Агафонов А. П., Бойченко М. Н., Воробьев.

7. Карамов Э. В., Гарманова A.B., Хаитов P.M. Мукозный иммунитет и его особенности // Иммунология. 2008 — № 6. — С.377−384.

8. Карпенко, Л.И., Игнатьев, Г. М., Кожина, Е.М. и др. Получение и исследование рекомбинантных штаммов Salmonella typhimurium SL 7207, продуцирующих HbcAg HbcAg-HBs. // Вопр. вирусологии 2000 — № 2 — С.43−46.

9. Кузнецова Т. Н., Хазиев А. Ф., Кунягина О. В. Лекарственный препарат для профилактики и лечения урогенитальных инфекций. Патент РФ № 2 185 842, опубл. 27.07.02. Бюл № 21.

10. Лебедев Л. Р., Карпенко Л. И., Даниленко Е. Д., Рыжиков А. Б., Бажан С. И., Масычева В. И., Ильичев A.A. Молекулярные конструкции нанобиочастиц для вакцинологии // Российский иммунологический журнал.-2008. Т.2 (11).- № 2−3- С. 337.

11. Некрасова, H.A., Игнатьев, Г. М., Агафонов, А.П., Ильичев, A.A., Карпенко Л. И. Исследование системного и мукозального иммунного ответа при иммунизации мышей кандидатной ВИЧ-1 вакциной // Сибирский медицинский журнал. 2004 — Т. 19 — N. 2 -С.60−62.

12. Рыжова С. А. Получение авирулениного мутанта S. enteritidis и изучение его биологических свойств. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Москва -1997 г.

13. Сорокин C.B., Аваков А. Э. Лекарственный препарат и способ профилактики и лечения урогенитальных инфекций. Патент РФ № 2 073 520, опубл. 20.02.97. Бюл. № 5.

14. Хертеленди Жольт Иштван, Вейнер Муррэй. Вакцина против урогенитальных инфекций на основе вагинального суппозитория. Патент РФ № 2 224 542, опубл. 27.02.04. Бюл № 6.

15. Холодков С. В., Холодкова Т. П., Вайншток И. П., Литвинов В. В. Суппозитории бактериальных препаратов и способ их получения. Патент РФ № 2 228 738, опубл. 20.05.04. Бюл № 15.

16. Allen, Т., Mortara, L., Mothe, В., Liebl, M., Jing, P., Calore, В. et al. Tat-vaccinated macaques do not control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication // J. Virol. -2002 N. 76 — P. 4108^-112.

17. Bachtiar, EW, Coloe, PJ, Smooker, PM. Construction and immunogenicity of Salmonella vaccine vector expressing HIV-1 antigen and MCP3 // Acta Microbiol. Immunol. Hung. 2009 — V. 56 — N. 4 — P. 403−415.

18. Barnett, S., Srivastava, I., Kan, E., Zhou, F., Goodsell, A., Cristillo, A. et al. Protection of macaques against vaginal SHIV challenge by systemic or mucosal and systemic vaccinations with HIV-envelope // AIDS 2008 — N. 22 — P.339−348.

19. Barouch, D., Santra, S., Schmitz, J., Kuroda, M., Fu, Т., Wagner, W. et al. Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cytokineaugmented DNA vaccination // Science 2000 — N. 290 — P. 486−492.

20. Bayard, F., Malmassari, S., Deng, Q., Lone, Y., Michel, M. Hepatitis B virus (HBV)-derived DRB1 *0101-restricted CD4 T-cell epitopes help in the development of HBV-specific CD8+ T cells in vivo. // Vaccine. 2010 V. 14 — N. 28 — P. 3818−3826.

21. Bei, R., Scardino, A. TAA polyepitope DNA-based vaccines: a potential tool for cancer therapy. //J. Biomed. Biotechnol. 2010 — N. 2010 — P. 102 758.

22. Bellino, S., Francavilla, V., Longo, O., Tripiciano, A., Paniccia, G., Arancio, A. et al. Parallel conduction of the phase I preventive and therapeutic trials based on the Tat vaccine candidate // Rev. Recent Clin. Trials 2009 — N. 4 — P. 195−204.

23. Belyakov, I. M, Ahlers, J. D, Nabel, G. J, Moss, B., Berzofsky, J. A Generation of functionally active HIV-1 specific CD8+ CTL in intestinal mucosa following mucosal, systemic or mixed prime-boost immunization// Virology 2008 -N. 381 — P. 106−115.

24. Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. // Ann. NY Acad. Sci. 2012 — N. 1247 — P. 97 116.

25. Bergey s Manual of Determinative Bacteriology / Eds G.J. Holt et al. 9 th ed. Baltimore, USA, 1994.

26. Borras-Cuesta, F., Petit-Camurdan, A., Fedon, Y. Engineering of immunogenic peptides by co-linear synthesis of determinants recognized by B and T cells // Eur. J. Immunol. 1987 -V. 17-N. 8-P. 1213−1215.

27. Brandtzaeg, P. Mucosal immunity: induction, dissemination, and effector functions // Scand J Immunol. 2009 — V. 70 — N.6 — P. 505−515.

28. Brett, S., Rhodes, J., Liew, F., Tite, J. Comparison of antigen presentation of influenza A nucleoprotein expressed in attenuated AroASalmonella typhimurium with that of live virus.//J Immunol. 1993 -V. 150-N. 7-P. 2869−2884.

29. Browning, M., Reid, G., Osborne, R., Jarrett, O. Incorporation of soluble antigens into ISCOMs: HIV gpl20 ISCOMs induce virus neutralizing antibodies//Vaccine 1992 -N. 10 -P. 585−590.

30. Burton, D., Moore, J. Why do we not have an HIV vaccine and how can we make one? // Nat. Med. 1998 — N. 4 — P. 495198.

31. Burton, D., Weiss, R. AIDS/HIV. A boost for HIV vaccine design // Science 2010 -N. 329-P. 770−773.

32. Cafaro, A., Caputo, A., Fracasso, C., Maggiorella, M., Goletti, D., Baroncelli, S. et al. Control of SHIV-89.6P-infection of cynomolgus monkeys by HIV-1 Tat protein vaccine // Nat. Med. 1999 — N.5 — P. 643−650.

33. Calarota, S., Dai, A., Trocio, J., Weiner, D., Lori, F., Lisziewicz, J. IL-15 as memory Tcell adjuvant for topical HIV-1 DermaVir vaccine // Vaccine 2008 — N. 26 — P. 5188−5195.

34. Caputo, A., Gavioli, R., Bellino, S., Longo, O., Tripiciano, A., Francavilla, V. et al. HIV-1 Tat-based vaccines: an overview and perspectives in the field of HIV/AIDS vaccine development // Int. Rev. Immunol. 2009 — N. 28 — P. 285−334.

35. Caputo, A., Gavioli, R., Ensoli, B. Recent advances in the development of HIV-1 Tat-based vaccines // Curr. HIV Res. 2004 — N. 2 — P. 357−376.

36. Chhatbar C, Mishra R, Kumar A, Singh SK. HIV vaccine: hopes and hurdles. // Drug Discov Today. 2011 — V.16 — N.21−22 — P. 948−956.

37. Choi, J., Shin, D., Ryu, S. Salmonella enterica serovar Typhimurium ruvB mutant can confer protection against salmonellosis in mice. // Vaccine 2010 — V. 28 — N. 39 — P. 64 366 444.

38. Cicin-Sain, L., Brune, W., Bubic, I., Jonjic, S., Koszinowski, UH. Vaccination of mice with bacteria carrying a cloned herpesvirus genome reconstituted in vivo. // J Virol. 2003 -V. 77-N. 15 — P. 8249−8255.

39. Cohen, J. Public health. AIDS vaccine trial produces disappointment and confusion // Science 2003 -N. 299-P. 1290−1291.

40. Corey, L., McElrath, M. HIV vaccines: mosaic approach to virus diversity //Nat. Med. 2010;N. 16-P. 268−270.

41. Cranage, M., Whatmore, A., Sharpe, S., Cook, N., Polyanskaya, N., Leech, S., et al. Macaques infected with live attenuated SIVmac are protected against superinfection via the rectal mucosa // Virology 1997;N. 229 — P. 143−154.

42. Cribbs, D. Abeta DNA vaccination for Alzheimer’s disease: focus on disease prevention. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 2010 — V. 9 — N. 2 — P. 207−216.

43. Czerkinsky, C., Nilsson, L., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. «A solidphase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells//J. Immunol. Methods 1983 — V.65 -N.l-2 — P. 109−121.

44. Darji, A., Guzman, C. A, Gerstel, B., Wachholz, P., Timmis, K. N, Wehland, J., Chakraborty T., Weiss, S. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium //Cell 1997 -N. 91 — P. 765−775.

45. Davis, N., Caley, I., Brown, K., Betts, M., Irlbeck, D., McGrath, K. et al. Vaccination of macaques against pathogenic simian immunodeficiency virus with Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles // J. Virol. 2000 — N. 74 — P. 371−378.

46. Devico, A., Fouts, T., Shata, M., Kamin-Lewis, R., Lewis, G., Hone, D. Development of an oral prime-boost strategy to elicit broadly neutralizing antibodies against HIV-1. // Vaccine. 2002 — V. 20 — N. 15 — P. 1968;1974.

47. Dileo, J., Miller, T., Chesnoy, S., Huang, L. Gene transfer to subdermal tissues via a new gene gun design // Hum. Gene Ther. 2003 — N. 14 — P. 79−87.

48. Doan, L., Li, M., Chen, C., Yao, Q. Virus-like particles as HIV-1 vaccines // P^ev. Med. Virol. 2005 — N. 15 — P.75−88.

49. Dougan, G., Maskell, D., Pickard, D., Hormaeche, C. Isolation of stable aroA mutants of Salmonella typhi Ty2: properties and preliminary characterisation in mice // Mol. Gen. Genet. 1987 — V. 207 — N. 2−3 — P. 402−405.

50. Emini, E., Nara, P., Schleif, W., Lewis, J., Davide, J., Lee, D. et al. Antibodymediated in vitro neutralization of human immunodeficiency virus type 1 abolishes infectivity for chimpanzees // J. Virol. 1990 — N. 64 — P. 3674−3678.

51. Ensoli, B., Fiorelli, V., Ensoli, F., Lazzarin, A., Visintini, R., Narciso, P. et al. The preventive phase I trial with the HIV-1 Tat-based vaccine // Vaccine 2009 — N. 28 — P. 371 378.

52. Eroshkin A.M., Karginova E.A., Gileva I.P. et al. Design of four-helical protein as a candidate for HIV vaccine. // Protein Engeneering-1995; 8- p. 167−173.

53. Fischer, W., Perkins, S., Theiler, J., Bhattacharya, T., Yusim, K., Funkhouser, R. et al. Polyvalent vaccines for optimal coverage of potential T-cell epitopes in global HIV-1 variants //Nat. Med. 2007 -N. 13 — P. 100−106.

54. Flynn, N., Forthal, D., Harro, C., Judson, F., Mayer, K., Para, M. Placebocontrolled phase 3 trial of a recombinant glycoprotein 120 vaccine to prevent HIV-1 infection // J. Infect. Dis. 2005 — N. 191 — P. 654−665.

55. Fultz, P., Nara, P., Barre-Sinoussi, F., Chaput, A., Greenberg, M., Muchmore, E. et al. Vaccine protection of chimpanzees against challenge with HIV-1-infected peripheral blood mononuclear cells // Science 1992 — N. 256 — P. 1687−1690.

56. Gahan, ME., Webster, DE., Wijburg, OL., Wesselingh, SL., Strugnell, RA. Impact of prior immunological exposure on vaccine delivery by Salmonella enterica serovar Typhimurium // Vaccine. 2008 — V. 26 — N. 49 — P. 6212−6220.

57. Gallo, R.C. A reflection on HIV/AIDS research after 25 years // Retrovirology. -2006.-V.20-P.3−72.

58. Gao, F., Liao, H., Hahn, B., Letvin, N., Korber, B., Haynes, B. Centralized HIV-1 envelope immunogens and neutralizing antibodies // Curr. HIV Res. 2007 — N 5 — P. 572 577.

59. Gao, F., Weaver, E., Lu, Z., Li, Y., Liao, H., Ma, B. et al. Antigenicity and immunogenicity of a synthetic human immunodeficiency virus type 1 group m consensus envelope glycoprotein // J. Virol. 2005 — N. 79 — P. 1154−1163.

60. Gauduin, M., Glickman, R., Ahmad, S., Yilma, T., Johnson, R. Immunization with live attenuated simian immunodeficiency virus induces strong type 1 T helper responses and beta-chemokine production//Proc. Natl. Acad. Sci. 1999 — N. 96 — P. 14 031−14 036.

61. Girard, M., Kieny, M., Pinter, A., Barre-Sinoussi, F., Nara, P., Kolbe, H., et al. Immunization of chimpanzees confers protection against challenge with human immunodeficiency virus // Proc. Natl. Acad. Sei. 1991 — N. 88 — P.542−546.

62. Girard, M., Meignier, B., Barre-Sinoussi, F., Kieny, M., Matthews, T., Muchmore, E., et al. Vaccine-induced protection of chimpanzees against infection by a heterologous human immunodeficiency virus type 1 // J. Virol. 1995 — N. 69 — P. 6239−6248.

63. Girard, MP., Osmanov, SK., Kieny, MP. A review of vaccine research and development: the human immunodeficiency virus (HIV) // Vaccine. 2006 — V. 24 — N. 19 -P. 4062−4081.

64. Goldstein, G. HIV-1 Tat protein as a potential AIDS vaccine // Nat. Med. 1996 — N.2 — P. 960−964.

65. Graham, B., Koup, R., Roederer, M., Bailer, R., Enama, M., Moodie, Z. et al. Phase 1 safety and immunogenicity evaluation of a multiclade H1V-1 DNA candidate vaccine // J. Infect. Dis. 2006 — N. 194-P. 1650−1660.

66. Gregg MR, Jack DB, Smith SR, Kendall MJ. The pharmacokinetics of oxprenolol following oral and rectal dosing—a comparison of delivery systems and routes of administration. Iii Clin Pharm Ther. 1987 — V. 12 — N. 2 — P. 91−99.

67. Hanke, T" Schneider, J., Gilbert, S., Hill, A., McMichael, A. DNA multi-CTL epitope vaccines for HIV and Plasmodium falciparum: immunogenicity in mice // Vaccine 1998 -V.16-N. 4-P. 426−435.

68. Hanrahan, J., Wormser, G., Maguire, G., Delorenzo, L., Gavis G. Opportunistic infections in prisoners. // N. Engl. J. Med. 1982. — V. 19 — N. 307 (8) — P. 498.

69. Haut, L., Ertl, H. Obstacles to the successful development of an efficacious T cell-inducing HIV-1 vaccine. // J Leukoc Biol. 2009 — V.86 — N.4 — P. 779−793.

70. Hirao, L., Wu, L., Khan, A., Hokey, D., Yan, J., Dai, A. et al. Combined effects of IL-12 and electroporation enhances the potency of DNA vaccination in macaques // Vaccine -2008 -N. 26 -P. 3112−3120.

71. Hirao, L., Wu, L., Khan, A., Satishchandran, A., Draghia-Akli, R., Weiner, D. Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques // Vaccine 2008 — N. 26 — P. 440−448.

72. Ho, J., Uger, R., Zwick, M., Luscher, M., Barber, B., MacDonald, K. Conformational constraints imposed on a pan-neutralizing HIV-1 antibody epitope result in increased antigenicity but not neutralizing response // Vaccine 2005 — N. 23 — P. 1559−1573.

73. Hoiseth, SK, Stacker, BA Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are nonvirulent and effective as live vaccines //Nature. 1981 — V. 291 — N. 5812 — P. 238−239.

74. Hoxie, J. Toward an antibody-based HIV-1 vaccine // Annu. Rev. Med. 2010 — N. 61 -P. 135−152.

75. Hurwitz, J., Slobod, K., Lockey, T., Wang, S., Chou, T., Lu, S. Application of the polyvalent approach to HIV-1 vaccine development // Curr Drug Targets Infect Disord 2005 -N. 5 — P. 143−156.

76. Ingale, S., Gach, J., Zwick, M., Dawson, P. Synthesis and analysis of the membrane proximal external region epitopes of HIV-1 Hi. Pept. Sci.-2010;N. 16 P. 716−722.

77. Jepson, MA, Clark, MA. The role of M cells in Salmonella infection. // Microbes Infect.-2001 V.3-N. 14−15-P. 1183−1190.

78. Joag, S., Liu, Z., Stephens, E., Smith, M., Kumar, A., Li, Z., et al. Oral immunization of macaques with attenuated vaccine virus induces protection against vaginally transmitted AIDS//J. Virol. 1998 -N. 72-P. 9069−9078.

79. Johnson, R., Glickman, R., Yang, J., Kaur, A., Dion, J., Mulligan, M., et al. Induction of vigorous cytotoxic T-lymphocyte responses by live attenuated simian immunodeficiency virus// J. Virol. 1997 — N. 71 — P. 7711−7718.

80. Kim, J., Rerks-Ngarm, S., Excler, J., Michael, N. HIV vaccines: lessons learned and the way forward. Curr Opin HIV AIDS. 2010 — V. 5 -N. 5 — P. 428−434.

81. Kim, M., Qiao, Z., Yu, J., Montefiori, D., Reinherz, E. Immunogenicity of recombinant human immunodeficiency virus type 1 -like particles expressing gp41 derivatives in a pre-fusion state//Vaccine-2007;N. 25-P. 5102−5114.

82. Koff, W., Johnson, P., Watkins, D., Burton, D., Lifson, J., Hasenkrug, K., et al. HIV vaccine design: insights from live attenuated SIV vaccines // Nat. Immunol. 2006 — N. 7 — P. 19−23.

83. Lenz, O., Dittmar, M., Wagner, A., Ferko, B., Vorauer-Uhl, K., Stiegler, G. et al. Trimeric membrane-anchored gp41 inhibits HIV membrane fusion. J. Biol. Chem. 2005 — N. 280 -P. 4095−4101.

84. Letvin, N. Progress toward an HIV vaccine // Annu. Rev. Med. 2005 — N. 56 — P. 213−223.

85. Lewis, G. Challenges of antibody-mediated protection against HIV-1 // Expert Rev. Vaccines 2010 — N. 9 — P. 683−687.

86. Li, C., Friedman, D., Wang, C., Metelev, V., Pardee, A. Induction of apoptosis in uninfected lymphocytes by HIV-1 Tat protein // Science 1995 — N. 268 — P. 429−431.

87. Lian, Y., Srivastava, I., Gomez-Roman, V., Zur Megede, J., Sun, Y., Kan, E. et al. Evaluation of envelope vaccines derived from the South African subtype C human immunodeficiency virus type 1 TV 1 strain // J. Virol. 2005 — N. 79 — P. 13 338−13 349.

88. Lu, S., Grimes Serrano, J., Wang, S. Polyvalent AIDS vaccines // Curr HIV Res -2010;N. 8 P. 622−629.

89. Maggiorella, M., Baroncelli, S., Michelini, Z., Fanales-Belasio, E., Moretti, S., Sernicola, L. et al. Long-term protection against SHIV89.6P replication in HIV-1 Tat vaccinated cynomolgus monkeys // Vaccine 2004 — N. 22 — P. 3258−3269.

90. McBurney, S., Ross, T. Human immunodeficiency virus-like particles with consensus envelopes elicited broader cell-mediated peripheral and mucosal immune responses than polyvalent and monovalent Env vaccines // Vaccine 2009 — N.27 — P. 4337−4349.

91. McGhee, JR., Kiyono, H. New perspectives in vaccine development: mucosal immunity to infections // Infect Agents Dis. 1993 — V.2 — N. 2 — P. 55−73.

92. Nabel, G. Immunology. Close to the edge: neutralizing the HIV-1 envelope // Science -2005 -N. 308 P. 1878−1879.

93. Pantophlet, R., Burton, D. GP120: target for neutralizing HIV-1 antibodies // Annu. Rev. Immunol. 2006 — N. 24 — P.739−769.

94. Pauza, C., Trivedi, P., Wallace, M., Ruckwardt, T., Le Buanec, H., Lu, W. et al. Vaccination with tat toxoid attenuates disease in simian/HIV-challenged macaques // Proc. Natl. Acad. Sci. -2000;N. 97 P. 3515−3519.

95. Picker, L., Hansen, S., Lifson, J. New paradigms for HIV/AIDS vaccine development. // Annu Rev Med. 2012 — V. 63 — P. 95−111.

96. Publicover, J., Ramsburg, E., Rose, J. A single-cycle vaccine vector based on vesicular stomatitis virus can induce immune responses comparable to those generated by a replication-competent vector // J. Virol. 2005 — N. 79 — P. 13 231−13 238.

97. Qu, D., Wang, S., Cai, W., Du, A. Protective effect of a DNA vaccine delivered in attenuated Salmonella typhimurium against Toxoplasma gondii infection in mice. // Vaccine -2008;N. 26- P. 4541−4548.

98. Ramshaw, 1., Ramsay, A. The prime-boost strategy: exciting prospects for improved vaccination//Immunol. Today 2000;N. 21 — P. 163−165.

99. Raupach, B., Kaufmann, S. Bacterial virulence, proinflammatory cytokines and host immunity how to choose the appropriate Salmonella vaccine strain? // Microbes Infcct. 2001 -N. 3 — P. 1261−1269.

100. Reed, L. and Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints.// Am. J. Hygiene. 1938. — № 27. — P.493−497.

101. Robinson, H. DNA vaccines: basic mechanism and immune responses // Int. J. Mol. Med. 1999 — N. 4 — P. 549−555.

102. Rosa, D., Ribeiro, S., Almeida, R., Mairena, E., Postol, E., Kalil, J. et al. A DNA vaccine encoding multiple HIV CD4 epitopes elicits vigorous polyfunctional, long-lived CD4 and CD8 T cell responses. // PLoS One 2011 — N. 6 — P. e 16 921.

103. Ryzhova, S., Boichenko, M. Study of stability of the avirulent phenotype and ability to the limited persistence in the mice of the avirulent mutant of Salmonella enteritidis // Biull. Eksp. Biol. Med. 1997;V. 124-N.10 — P. 429−431.

104. Schadeck, E., Sidhu, M., Egan, M., Chong, S., Piacente, P., Masood, A. et al. A dose sparing effect by plasmid encoded 1L-12 adjuvant on a SIVgag-plasmid DNA vaccine in rhesus macaques // Vaccine 2006 — N. 24 — P. 4677^1687.

105. Schief, W., Ban, Y., Stamatatos, L. Challenges for structure-based HIV vaccine design // Curr. Opin. HIV AIDS 2009 — N. 4 — P. 431140.

106. Seaman, M., Xu, L., Beaudry, K., Martin, K., Beddall, M., Miura, A. et al. Multiclade human immunodeficiency virus type 1 envelope immunogens elicit broad cellular and humoral immunity in rhesus monkeys // J. Virol. 2005 N. 79 — P. 2956−2963.

107. Shata, M., Hone, D. Vaccination with a Shigella DMA vaccine vector induces antigen-specific CD8(+) T cells and antiviral protective immunity. // J. Virol. 2001 — V. 75 — N. 20 -P. 9665−9670.

108. Shata, M., Reitz, M., DeVico, A., Lewis, G., Hone, D. Mucosal and systemic HIV-1 Env-specific CD8(+) T-cells develop after intragastric vaccination with a Salmonella Env DNA vaccine vector. // Vaccine 2001 — V. 20 — N.3−4 — P. 623−629.

109. Shata, MT., Stevceva, L., Agwale, S., Lewis, GK., Hone, DM. Recent advances with recombinant bacterial vaccine vectors // Mol Med Today. 2000 — V.6 — 2 — P. 66−71.

110. Shi, W., Bohon, J., Han, D., Habte, H., Qin, Y., Cho, M. et al. Structural characterization of HIV gp41 with the membrane-proximal external region // J. Biol. Chem. -2010 -N. 285 P. 24 290−24 298.

111. Spearman, P., Kalams, S., Elizaga, M., Metch, B., Chiu, Y. L, Allen, M. et al. Safety and immunogenicity of a CTL multiepitope peptide vaccine for HIV with or without GM-CSF in a phase I trial // Vaccine 2009 — N. 27 — P. 243−249.

112. Spreng, S., Dietrich, G., Weidinger, G. Rational design of Salmonella-based vaccination strategies. //Methods. 2006 — V. 38 -N. 2 — P. 133−143.

113. Thomson, S., Jaramillo, A., Shoobridge, M., Dunstan, K., Everett, B., Ranasinghe, C. et al. Development of a synthetic consensus sequence scrambled antigen HIV-1 vaccine designed for global use. Vaccine 2005;23:4647−57.

114. Tijssen P., Practice and theory of enzyme immunoassays. 1985, AmsterdamNew York: Elsevier — New York, USA: Sole distributors for the USA and Canada, Elsevier Science Pub. Co. 502.

115. Vasan, S., Schlesinger, S., Chen, Z., Hurley, A., Lombardo, A., Than, S. et al. Phase 1 safety and immunogenicity evaluation of ADMVA, a multigenic, modified vaccinia Ankara-HI V-l B'/C candidate vaccine // PLoS One 2010 — N. 5 — P. e 8816.

116. Vassilieva, E., Wang, B., Vzorov, A., Wang, L., Wang, Y., Bozja, J. et al. Enhanced Mucosal Immune Responses to HIV Virus-Like Particles Containing a Membrane-Anchored Adjuvant //MBio- 2011 V.2-N. 1 -e00328−10. doi: 10.1128.

117. Veazey, R., Marx, P., Lackner, A. The mucosal immune system: primary target for HIV infection and AIDS. // Trends Immunol. 2001 — V. 22 — N. 11 — P. 626−633.

118. Wan, J., Wang, C., Wen, X., Huang, X., Ling, S., Huang, Y., Cao, S. Immunogenicity of a DNA vaccine of Avian Reovirus orally delivered by attenuated Salmonella typhimurium. // Res. Vet. Sci. 2011 — V. 91 — N. 3 — P. 382−383.

119. Wang, B., Ugen, K., Srikantan, V., Agadjanyan, M., Dang, K., Refaeli, Y. et al. Gene inoculation generates immune responses against human immunodeficiency virus type 1 // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993 — N. 90 — P. 4156^1160.

120. Woo, PC., Wong, LP., Zheng, BJ., Yuen, KY. Unique immunogenicity of hepatitis B virus DNA vaccine presented by live-attenuated Salmonella typhimurium // Vaccine. 2001 -V. 19 — N. 20−22 — P. 2945−2954.

121. Wyand, M., Manson, K., Montefiori, D., Lifson, J., Johnson, R., Desrosiers, R. Protection by live, attenuated simian immunodeficiency virus against heterologous challenge Hi. Virol. 1999;N. 73 — P. 8356−8363.

122. Xu, R., Megati, S., Roopchand, V., Luckay, A., Masood, A., Garcia-Hand, D. et al. Comparative ability of various plasmid-based cytokines and chemokines to adjuvant the activity of HIV plasmid DNA vaccines // Vaccine 2008 — N. 26 — P. 4819−4829.

123. Yasutomi, Y., Robinson, H., Lu, S., Mustafa, F., Lekutis, C., Arthos, J. et al. Simian immunodeficiency virus-specific cytotoxic T-lymphocyte induction through DNA vaccination of rhesus monkeys // J. Virol. 1996 — N. 70 — P. 678−681.

124. Yin, J., Dai, A., Lecureux, J., Arango, T., Kutzler, M., Yan, J. et al. High antibody and cellular responses induced to HIV-1 clade C envelope following DNA vaccines delivered by electroporation // Vaccine 2010.

125. Zhao, C., Sun, Y., Zhao, Y., Wang, S., Yu, T., Du, F., Yang, X., Luo, E. Immunogenicity of a multi-epitope DNA vaccine against hantavirus // Hum. Vaccin. Immunother. 2012;V. 1 -N. 8(2).

126. Zhu, P., Liu, J., Bess, Jr., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H. et al. Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes // Nature 2006 — N. 441 — P. 847 852.

Показать весь текст
Заполнить форму текущей работой

На отлично!