Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Кооперативное взаимодействие олигонуклеотидов на комплементарных ДНК-последовательностях

Диссертация: Кооперативное взаимодействие олигонуклеотидов на комплементарных ДНК-последовательностях
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

При исследовании модификации в составе 20-ти различных комплементарных комплексов, включая тандемные комплексы, состоящие из олигонуклеотида-мишени длиной 10, 22 и 26 звеньев, алкилирующих производных 6-ти или 8-ми звенных дезоксирибоолигонуклеотидов и фланкирующих их с 3' и/или 5'-концов двух 8-звенных олигонуклеотидов-эффекторов, как немодифицированных, так и несущих остатки… Читать ещё >

Содержание

  • Глава I. Физико-химические аспекты кооперативных взаимодействий в двух- и трехцепочечных комплексах нуклеиновых кислот (обзор литературы)
    • 1. Количественные аспекты кооперативных взаимодействий в двуспиральных комплексах нуклеиновых кислот с одноцепочечным разрывом
    • 2. Изучение термодинамики образования трехцепочечных тандемных комплексов между олигонуклеотидами и ДНК с помощью метода «количественного аффинного расщепляющего титрования»

Кооперативное взаимодействие олигонуклеотидов на комплементарных ДНК-последовательностях (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Как известно, стэкинг-взаимодействие гетероциклических оснований нуклеиновых кислот дает существенный энергетический вклад при формировании двухи трехцепочечной структуры олигои полинуклеотидов. Природа этих взаимодействий не зависит от длины нуклеотидной цепи. Так, в водных растворах даже мононуклеозиды способны образовывать «стопки» за счет «вертикальных» взаимодействий с характерными величинами изменения свободной энергии диссоциации, не превышающими 1.5 ккал/моль. Природа сил, способствующих стэкинг-взаимодействию, несомненно связана с взаимодействием индуцированных диполей, образованных системой я-электронов оснований. Поскольку стэкинг-структуры наиболее стабильны в водных растворах, то это приводит многих исследователей к выводу о том, что гидрофобные взаимодействия играют важную роль в стабилизации стэкинговых структур. С другой стороны, наличие собственных дипольных моментов и проявление лондоновских дисперсионных сил дают заметный эффект, который, в частности, определяет различие энергий взаимодействий различных пар оснований.

Уже в 1966 году было обнаружено, что пуриновые нуклеозиды могут образовывать тандемы на комплементарном полинуклеотиде [1]. Аналогичным образом тандемные структуры образуют олиго нуклеотиды [2]. Причиной образования тандемов являются кооперативные взаимодействия, обусловленные стэкингом гетероциклов соседних компонентов тандема. Это свойство было использовано Корана при создании им химико-ферментативного метода синтеза генов для соединения коротких олигонуклеотидов в один, более длинный с помощью ДНК-лигазы [3]. Разработанный им подход и на сегодняшний день лежит в основе завершающих этапов синтеза генов и их встраивания в плазмиды для последующего клонирования. В дальнейшем в большом цикле работ, выполненных Шабаровой и сотрудниками, был разработан аналогичный метод химического лигирования олигонуклеотидов с помощью водорастворимых карбодиимидов или бромциана, позволивший в конечном итоге осуществить первый чисто химический синтез гена [4]. В работах Зарытовой с сотрудниками было показано, что эффективность модификации нуклеиновой кислоты-мишени реакционноспособными производными олигонуклеотидов (комплементарно-адресованной модификации) может быть существенно повышена, если фланкировать адресованный реагент производными олигонуклеотидов, комплементарными соседним участкам нуклеиновой кислоты-мишени и несущими стабилизирующие дуплекс остатки феназиния [5,6]. Такие вспомогательные производные олигонуклеотидов были названы эффекторами. При использовании для модификации алкилирующей группы — 1Ч-2-хлорэтиламино-]Ч-метиламинофенильной группы (далее ЯС1) на примере модификации 303-звенного однонитевого фрагмента ДНК, содержащего три одинаковых тетрануклеотидных последовательности было показано, что ЯО-производное комплементарного тетрануклеотида можно избирательно направить на любой из этих участков, варьируя набор добавляемых эффекторов в соответствии с последовательностями, прилегающими к идентичным сайтам модификации [7]. В дальнейшем тандемные системы были использованы для осуществления направленной модификации нуклеиновых кислот реагентами, содержащими фотоактивируемые группы [8] и каталитически активные в реакциях окисления молекулярным кислородом металлокомплексные группы: РеЕБТА [9] и Ре-блеомицин [10]. В работах Власова с сотрудниками было показано, что сближение на комплементарной матрице двух олигонуклеотидов, один из которых несет фотоактивную перфторазидо-бензоильную группу, а второй — фотосенсибилизирующий остаток пирена, позволяет осуществлять фотоафинную модификацию олигонуклеотида мишени с существенно более высокой эффективностью и при использовании более длинноволнового облучения, чем при модификации одним фотоактивным реагентом [11, 12]. Недавно для секвенирования нуклеиновых кислот методом Сэнгера было предложено использовать тандемы коротких олигонуклеотидов в качестве «составных» праймеров [13, 14]. Таким образом, тандемные структуры, образуемые олигонуклеотидами или их производными на комплементарной матрице, уже нашли применение для решения ряда важных задач биоорганической химии.

При окислительной деструкции двунитевых ДНК с помощью Fe2+EDTAпроизводными олигонуклеотидов, способных к образованию триплексов [15], и при алкилировании одноцепочечных мишеней RCl-производными [16] было обнаружено, что эти процессы в тандемах ошибок в матрице более чувствительны к наличию ошибок в матрице — мисмэтчей (от английского mismatch), чем при использовании единого протяженного олигонуклеотида, комплементарного тому же сайту.

Таким образом, как и любое другое фундаментальное явление, этот тип взаимодействий используется в различных прикладных молекулярно-биологических задачах. Одной из важнейших на сегодняшний день является задача создания технологичного и надежного метода диагностики геномных последовательностей с целью выявления одиночных мутаций. При использовании олигонуклеотидов в качестве адресующих частей биологически или химически активных коньюгатов основной проблемой является неоднозначность комплексообразования между олигонуклеотидным реагентом и мишенью (ДНК или РНК). Одним из путей решения этой проблемы является использование олигонуклеотидов-эффекторов (или любых других лигандов), создающих энергетические (за счет дополнительных стэкинг-взаимодействий) или конформационные преимущества для реагента при связывании с НК мишенью в данном уникальном сайте. Определяемая общим понятием «кооперативная», эта система может быть количественно охарактеризована на основе общих термодинамических подходов. Систематизируя известные на сегодняшний день количественные данные по кооперативным свойствам комплексов нуклеиновых кислот как дуплексов, так и триплексов, можно сделать выводы о принципиальных возможностях данного подхода и оценить наиболее перспективные пути его развития.

Получение количественных характеристик кооперативных взаимодействий и исследование факторов, влияющих на эти характеристики, является важной физико-химической задачей. В настоящей работе для этой цели нами был разработан метод, основанный на комплементарно-адресованной модификации нуклеиновых кислот реакционноспособными производными олигонуклеотидов и исследованы некоторые факторы, влияющие на эффективность кооперативного взаимодействия олигонуклеотидов: структура области стыка олигонуклеотидов, наличие некомплементарных или химически модифицированных нуклеотидов.

ВЫВОДЫ.

В настоящей работе исследованы количественные характеристики кооперативных взаимодействий олигонуклеотидов в тандемных комплементарных комплексах. Результаты проделанной работы можно сформулировать следующим образом:

1. Для определения параметров кооперативного связывания олигонуклеотидов в комплементарных комплексах впервые применен метод комплементарно-адресованного модифицирующего титрования (KAMT), основанный на определении констант ассоциации реакционноспособных производных олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами (мишенями) из зависимостей степеней модификации от концентрации реагентов.

2. При исследовании модификации в составе 20-ти различных комплементарных комплексов, включая тандемные комплексы, состоящие из олигонуклеотида-мишени длиной 10, 22 и 26 звеньев, алкилирующих производных 6-ти или 8-ми звенных дезоксирибоолигонуклеотидов и фланкирующих их с 3' и/или 5'-концов двух 8-звенных олигонуклеотидов-эффекторов, как немодифицированных, так и несущих остатки >Ц2-гидроксиэтил)феназиния, определены параметры контактной кооперативное&trade-, обусловленной прямым взаимодействием олигонуклеотидов в тандемном комплексе, и неконтактной кооперативности, связанной с воздействием олигонуклеотидов на вторичную структуру мишени. Возможность образования 26-звенным олигонуклеотидом-мишенью вторичной структуры типа «шпильки» было дополнительно подтверждено с помощью реакции самомодификации.

3. Исследовано влияние структуры области стыка олигонуклеотидов в тандемном комплексе на величины параметров контактной кооперативности. Показано, что наличие на стыке нуклеотида, содержащего остаток феназиния, существенно усиливает кооперативность. Присутствие концевой неканонической пары ТТ или реакционноспособной группыЫНСНгКО полностью элиминирует кооперативные взаимодействия с немодифицированным нуклеотидом, но сохраняет достаточно сильное взаимодействие между остатком нуклеотида в составе мисмэтча и остатком нуклеотида, модифицированным феназинием. На примере пары ТТ установлено, что тандемные комплексы лучше дискриминируют ошибочные основания, чем обычные дуплексы.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Huang W. M., Ts’o P.O.P. Physicochemical bases of the recognition process in nuckeic acid interactions. 1. teractions of polyuridylic acid and nucleosides. J. Mol. Biol. 1966. V. 16. P. 523−543.
  2. Michelson A. M., Monny C. Polynucleotides. X. Oligonucleotides and their association with polynucleotides. 1967. V. 149. P. 107−126.
  3. В.Ф., Кутявин И. В., Левина A.C., Мамаев С. В., Подыминогин М. А. №(2-оксиэтил)феназиниевые производные олигонуклеотидов эффекторы комплементарно адресованной модификации нуклеиновых кислот. Доклады АН СССР. 1988. Т.302. С.102−105.
  4. Strobel S. and Dervan P.B. Cooperative site specific binding of oligonucleotides to duplex DNA. J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. 7286−7287.
  5. Ю.Воробьев П.E., Маркушин Ю. Я., Сергеев Д. С., Зарытова В. Ф. Повышение эффективности сайт-специфического расщепления ДНК-мишени блеомициновым производным тетрануклеотида с помощью олигонуклеотидов-эффекторов. Биоорган, химия. 1996. Т. 22. С. 111−116.
  6. Colocci N., Dervan Р.В. Cooperative triple helix formation at adjacent DNA sites: sequence composition dependence at the junction. J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 4781−4787.
  7. Erie D., Sinha N., Olson W., Jones R., Breslauer K. A Dumbbell-shaped, double-hairpin structure of DNA: a thermodynamic investigation. Biochemistry. 1987. V. 26. P. 7150−7159.
  8. Record M.T., Jr., & Lohman T.M. A semiempirical extension of polyelectrolyte theory to the treatment of oligoelectrolytes: application to oligonucleotide helix-coil transitions. Biopolymers. 1978. V. 17. P. 159−166.
  9. О.Н., Друца B.JL, Долинная Н. Г., Цитович А. В., Шабарова З. А. ДНК-подобные дуплексы, содержащие повторы. VII. Химико-ферментативный синтез полимеров с фрагментами природных промоторов. Молекулярн. биол. 1984. Т. 18. С. 146−151.
  10. Tasawa I., Tasawa S., Ts’o P.O.P. Studies on oligonucleotides: Thermodynamic and optical properties of the oligoinosinate-polycytidylate complexes. J. Mol. Biol. 1972. V. 66. P. 115−130.
  11. Damle V.N. Theory of interaction of polymer and small molecules which can aggregate in solution. Biopolymers. 1970. V. 9. P. 1437−1443.
  12. Crothers D.M. Statistical thermodynamics of nucleic acid melting transition with coupled binding equilibria. Biopolymers. 1971. V. 10. P. 2147−2160.
  13. Springgate M.W., Poland D. Cooperative and thermodynamic parameters for oligoinosinate-polycytidylate complexes. Biopolymers. 1973. V. 12. P. 2241−2260.
  14. McGhee J.D., von Hippel P.H. Theoretical aspects of DNA-protein interaction: cooperative and non-cooperative binding of large ligands to a one-dimensional homogeneous lattice. J. Mol. Biol. 1974. V. 86. P. 469.
  15. T.B., Горн B.B., Кутявин И. В., Лебедев А. В., Лохов С. Г., Подыминогин М. А. Кооперативное взаимодействие олигонуклеотидов в дуплексах с одноцепочечным разрывом. Докл. Акад. наук СССР. 1990. Т. 315. С. 1485−1488.
  16. С. Г. Термодинамика стабилизированных комплексов олигонуклеотидов: влияние интеркалирующих красителей и кооперативные взаимодействия. Диссертация. Новосибирск. 1995
  17. Weber G. Energetics of ligand binding to proteins. Adv. Protein Chem. l975.V.29. P. l-78.
  18. Breslauer K.J., Frank R., Blocker H. and Marky L.A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 37 463 750.
  19. Breslauer K. J. Extracting thermodynamic data from equilibrium melting curves for oligonucleotide order-disorder transitions. Meth. Mol. Biol. 1994. V. 26. P. 347 372.
  20. Singleton S.F. and Dervan P.B. Thermodynamics of oligodeoxyribonucleotide-directed triple helix formation: an analysis using quantitative affinity cleavage titration. J.Am.Chem.Soc. 1992. V. l 14. P. 6957−6965.
  21. Зб.Кантор Ч. Р, Шиммель П. Р. Биофизическая химия, М.: Мир. 1984.37.3енгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М.: Мир. 1987.
  22. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F., Lebedev A.V. and O.S. Fedorova. Design and Targeted Reactions of Oligonucleotide Derivatives. CRC Press. Boca Raton. Florida. USA. 1994.
  23. Д. Г., Зарытова В. Ф., Бадашкеева А. Г., Фёдорова О. С. Реакционноспособные производные олигонуклеотидов как ген-направленные вещества. Итоги науки и техники. Сер.'.Биотехнология. М., ВИНИТИ. 1991. Т.37.С. 1−182.
  24. Distefano M.D., Shin J.A., Dervan P.B. Cooperative binding of oligonucleotides to DNA by triple helix formation: dimerization via Watson-Crick hydrogen bonds. J.Am.Chem.Soc. 1991. V.113. P. 5901−5902.
  25. Distefano M.D., Dervan P.B. Energetics of cooperative binding of oligonucleotides with discrete dimerization domains to DNA by triple helix formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 1179−1183.
  26. Distefano M.D., Dervan P. B Ligand-promoted dimerization of oligonucleotides binding cooperatively to DNA. J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 11 006−11 007.
  27. О.И., Горшкова И. И., Карпова Г. Г., Кутявин И. В., Грайфер Д. М. Селективное алкилирование тРНКРЬе по остатку G24. Молекулярн. биология. 1984. Т.18. С. 1419−1423.
  28. О.И., Горн В. В., Горшкова И. И., Грайфер Д. М., Карпова Г. Г., Мундус Д. А., Теплова Н. М. Алкилирование тРНКРЬе 4-(N-2-xflop3mn-Nметиламино)бензил-5'-фосфамидом d (ATTTTCA). Биоорган, химия. 1986. Т. 12. С. 490−498.
  29. В.В., Кнорре Д. Г., Кутявин И. В., Мамаев С. В., Подуст Л. М., Федорова О. С. Изучение эффективности модификации одноцепочечного фрагмента ДНК алкилирующими производными олигонуклеотидов. Биоорган, химия. 1987. Т. 13.С. 1221−1229.
  30. Л.М., Горн B.B., Максакова Г. А., Федорова О. С. Структура мишени, как фактор, влияющий на эффективность модификации одноцепочечной ДНК алкилирующими производными олигонуклеотидов. Биоорган, химия. 1992. Т. 18.С. 1496−1504.
  31. Ю.Н., Лебедев А. В., Левина А. С., Лохов С. Г., Федорова О. С. Комплементарно-адресованная модификация модельного олигодезоксирибонуклеотида, имеющего форму шпильки. Биоорган, химия. 1989. Т. 15. С.370−378.
  32. Л.М., Гайдамаков С. А., Абрамова Т. В., Власов В. В., Горн В. В., Федорова О. С. Специфичная к последовательности модификация двуцепочечной ДНК алкилирующим производным олигонуклеотида рТ(СТ)б. Биоорган, химия. 1989. Т. 15. С. 363−369.
  33. Frolova E.I., Fedorova O.S. and D.G. Knorre. Kinetic study of the addressed modification by hemin derivatives of oligonucleotides. Biochimie. 1993. V.75. P. 512.
  34. B.B., Максакова Г. А., Фёдорова О. С., Кинетика фотомодификации ДНК перфторарилазидопроизводным олигонуклеотида, протекающей с частичной потерей сродства реагента к мишени. Биоорган, химия. 1997. Т. 23. С. 266−272.
  35. А.В., Максакова Г. А., Федорова О. С., Кинетика фотомодификации ДНК производными 1 -3-(п-азидо-тетрафторбензоил)аминопропил.-5'-фосфамидов дезоксирибоолигонуклеотидов в составе модельных дуплексов. Биоорган, химия. 1995. Т.21. С. 767−773.
  36. В.В., Зарытова В. Ф., Потемкин Г. А., Средин Ю. Г., Полищук А. С. Синтез 5'-фосфорилированных олигодезоксирибонуклеотидов фосфотриэфирным твердофазным методом в ручном и автоматическом вариантах. Биоорган, химия. 1986. Т. 12. С. 1054−1062.
  37. Т.С., Зарытова В. Ф., Халимская JI.M. Реакционноспособные фосфамиды моно-и динуклеотидов. Биоорган, химия. 1986. Т. 12. С. 475−481.
  38. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. 3rd Ed./ Ed. Fastman G.D. CRC Press. Inc., 1975. P. 589.
  39. Maniatis, Т., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor. 1982
  40. Г. И., Грачев С. А. Использование перхлората лития при выделении и анализе олиго- и полинуклеотидов. Биоорган, химия. 1985. Т. 11. С. 1420−1422.
  41. Maxam A.M., Gilbert М. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages. Meth. Enzymol. 1980. V. 65. P. 499−560.
  42. К., Эдерер X. Компьютеры в химии. М.: Мир. 1988. С. 284.
  43. Kitz R., Wilson I.В. Esters of methanesulfonic acid as irreversible inhibitors of acetylcholinesterase. J. Biol. Chem. 1962. V. 237. P. 3245−3249.
  44. Ross W. C. J. Biological alkylating agents. Butterworth. London. 1962.
  45. Д.Г., Чимитова Т. А. Изотермы химической модификации биополимеров для аффинных реагентов, образующих активные промежуточные частицы. Молекулярн. биология. 1978. Т. 12. С. 814−821.
  46. Knorre D. G. and Chimitova Т. A. Equations of the kinetic curves of affinity labelling of biopolymers with the reagents consumed in parallel reactions in solution. FEBS Lett. 1981. V. 131. P. 249−252.
  47. Belikova A. M., Zarytova V. F. and Grineva N. I. Synthesis of ribonucleotides and diribonucleotide phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues. Tetrahedron Lett. 1967. V.37. P. 3557−3562.
  48. Адина-зада А., Федорова О. С. Изучение кооперативных взаимодействий производных дезоксирибоолигонуклеотидов при связывании с ДНК методом химической модификации. Биоорган, химия. 1995. Т.21. С. 703−708.
  49. Vesnaver G., Breslauer K. J. The contribution of DNA single-stranded order to the thermodynamics of duplex formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 3569−3573.
  50. Lima W. F., Monia B. P., Ecker D. J., Freier S. M. Implication of RNA structure on antisense oligonucleotide hybridization kinetics. Biochemistry. 1992. V. 31. P. 120 512 061.
  51. Freid M., Crothers M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interaction by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucl. Acids Res. 1981. V. 9. P. 6505−6525.
  52. Garner M. M., Revzin A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 3047−3060.
  53. Lane D., Prentki P., Chandler M. Use of gel retardation to analyze protein-nucleic acid interactions. Microbiol. Rev. 1992. V. 56. P. 509−528.
  54. Revzin A. Gel electrophoresis assays for DNA-protein interactions. Biotechnique. 1989. V. 7. 346−355.
  55. Monod J., Wyman J., Changeux J.P. On the nature of the allosteric transitions: a plausible model. J. Mol. Biol. 1965. V. 12. P. 88−118.
  56. Т. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир. 1990. С. 272.
  57. Volkenstein M.V., Goldstein В. N. Allosteric enzyme models and their analysis by the theory of graphs. Biochim. Biophys. Acta. 1966. V. 115. P. 478−485.
  58. Malygin A., Karpova G., Westermann P. Hybridization of two oligonucleotides to both strands of an RNA hairpin structure increases the efficiency of RNA-DNA duplex formation. FEBS Lett. 1996. V. 392. P. 114−116.
  59. Bulygin K., Malygin A., Karpova G., Westermann P. Site-specific modification of 4.5S RNA apical domain by complementary oligonucleotides carrying an alkylating group. Eur. J. Biochem. 1998. V. 251. P. 175−180.
  60. В.В., Гринева Н. И., Карпова Г. Г. Внутримолекулярное адресованное алкилирование 2', 3'-0−4-(хлорэтилметиламино)-бензилиден.-тРНК. Молекулярн. биология. 1974. Т. 8. С. 752−761.
  61. Grachev М. A., Rivkin М. I. A chemical approach to studies of the three-dimentional structure of tRNA alkylation with a reagent covalently bound to a «peculiar site». Nucleic Acids Res. 1975. V. 2. P. 1237−1260.
  62. E.B., Адина-Зада А., Фёдорова О. С. Изучение вторичной структуры одноцепочечного фрагмента ДНК с использованием реакции самомодификации. Биоорган, химия. 1997. Т. 23. С. 21−32.
  63. Lomakin A., Frank-Kamenetskii M. D. A theoretical analysis of specificity of nucleic acid interaction with oligonucleotides and peptide nucleic acids (PNAs). J. Mol. Biol. 1998. V. 276. P. 57−70.
  64. Perelroyzen M.P., Vologodskii A.V. Theoretical analysis of «addressed» chemical modification of DNA. Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 4693−4704.
  65. Hearst J.E. Background hybridization associated with the use of photocrosslinkable oligonucleotide hybridization probes for identification of unique sequences in the human genome. Photobiochem. Photobiophys., Suppl. 1987. P. 23−32.
  66. Юб.Долинная Н. Г., Грязнова О. И. Комплексы олиго (поли)нуклеотидов со структурными аномалиями. Успехи химии. 1989. Т. 58. С.1318−1353.
  67. М.А., Карпова Г. Г. Несовершенные комплексы нуклеиновых кислот и их биохимическое проявление. Успехи химии. 1993. Т. 62. С. 414−435.
Заполнить форму текущей работой

На отлично!