Бактерии рода Geobacillus из высокотемпературных заводняемых нефтяных пластов и гены биодеградации h-алканов (alkB)

Первые работы, посвященные микроорганизмам из нефтяных пластов, относятся к началу XX века. С тех пор интерес к микрофлоре нефтяных месторождений не ослабевает. Выделены анаэробные микроорганизмы, относящиеся к различным метаболическим группам: восстанавливающие сульфат, тиосульфат, сульфит, элементную серу, Fe (III) — бродильные бактерии, ацетогены и метаногены (Розанова, Кузнецов, 1974; Назина, Беляев, 2004; Magot, 2005). Установлено присутствие аэробных бактерий в пластовых водах нефтяных месторождений (Nazina et al., 2001; Нао et al., 2004a, Wang et al., 2006). Вероятнее всего, эти микроорганизмы проникают в пласт с буровым раствором при разработке месторождения и с нагнетаемой водой при его заводнении. В призабойной зоне нагнетательных скважин присутствует кислород в количестве, достаточном для роста аэробных микроорганизмов. Особый интерес представляют аэробные углеводород-окисляющие бактерии, которые служат первичным звеном в трофической цепи аэробно-анаэробного сообщества заводняемого нефтяного пласта, и оказывают влияние на развитие всего сообщества в целом (Назина и соавт., 2003).

Из пластовых вод выделен ряд мезофильных углеводородокисляющих бактерий. Термофильным аэробным бактериям посвящено немного работ. Выделенные из нефтяных пластов микроорганизмы относятся к родам Bacillus, Geobacillus, Thermoactinomyces, Thermus (Назина и соавт., 2000; Yakimov et al., 1997; Nazina et al., 2001; Hao et al., 2004a, b). Изучение углеводородокисляющих бактерий актуально для решения фундаментальных и прикладных задач. При окислении углеводородов бактерии вырабатывают поверхностно-активные вещества, которые существенно изменяют реологические свойства нефти и могут использоваться в технологиях повышения нефтеотдачи. Стимуляция углеводородокисляющих микроорганизмов в пласте также способствует повышению нефтеизвлечения.

В природе наиболее деградированные залежи нефти обнаруживаются при температуре до 80 °C (Head et al., 2003). Однако до сих пор неизвестны микроорганизмы, осуществляющие биодеградацию нефти при столь высокой температуре. Имеется обширная информация о структуре и работе alk генов, кодирующих ферменты, ответственные за окисление н-алканов у мезофильных бактерий, тогда как сведений о генетических аспектах биодеградации углеводородов термофильными прокариотами практически нет. К началу настоящей работы в Генбанке было лишь два небольших фрагмента последовательностей alkB генов, кодирующих алкан-монооксигеназу, термофильных бактерий рода Geobacillus.

Для изучения разнообразия микробных сообществ нефтяных пластов сравнительно недавно начали применять методы молекулярной экологии, основанные на анализе генов 16S рРНК, выявленных во фракции ДНК, выделенной из пластовой воды. Подобные исследования проведены на высокотемпературных нефтяных месторождениях Калифорнии (Orphan et al, 2000, 2003), Западной Сибири (Bonch-Osmolovskaya et al., 2003), Китая (Назина и соавт., 2006; Li et al., 2006; Shestakova et al., 2010), Норвегии (Kaster et al., 2009) и др. Использование методов гибридизации ДНК с олигонуклеотидными зондами, различных видов ПЦР позволяет выявить филогенетическое разнообразие присутствующих микроорганизмов, но не позволяет оценить степень их активности в пласте.

Известно, что в активно растущей клетке существенно возрастает количество рибосом, поэтому анализ рРНК позволяет выявить метаболически активные компоненты сообщества (Poulsen et al., 1993; Wawer et al., 1997). Данный подход для изучения микробных сообществ нефтяных пластов до сих пор не применялся.

Термофильные бактерии рода Geobacillus неоднократно выделяли из нефтяных пластов, тогда как об их обнаружении молекулярными методами имеется лишь одно сообщение (Bonch-Osmolovskaya et al., 2003). В связи с вышесказанным, представляется актуальным изучение распространения аэробных термофильных бактерий в нефтяных пластах микробиологическими и молекулярно-биологическими методами путем создания библиотек клонов генов 16S рРНК и 16S крДНК (комплементарной 16S рРНК) на основе тотальных ДНК и РНК, выделенных из пластовой воды, выяснение роли геобацилл в биотрансформации нефти и генетических аспектов этого процесса.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было выяснение разнообразия микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов (на примере нефтяного месторождения Даган) и выявление метаболически активных прокариот, выделение аэробных термофильных углеводородокисляющих бактерий и поиск генов ферментативной системы окисления н-алканов у представителей рода Geobacillus и в подземном микробном сообществе.

Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи.

1. Определить численность и распространение микроорганизмов основных метаболических групп в пластовых водах месторождения Даган.

2. Выделить доминирующие термофильные углеводородокисляющие бактерии, определить их таксономическое положение и метаболические свойства, способствующие распространению и деятельности в нефтяных пластах. Исследовать рост выделенных штаммов на углеводородах нефти и индивидуальных н-алканах.

3. Осуществить поиск генов ферментативной системы биодеградации н-алканов у бактерий рода Geobacillus.

4. Определить филогенетическое разнообразие прокариот и выявить метаболически активные группы путем создания библиотек клонов генов 16S рРНК и alkB и 16S крДНК комплементарной 16Б рРНК) на основе тотальных ДНК и РНК, выделенных из пластовой воды прнзабойной зоны нагнетательной скважины в период биотехнологического воздействия.

Научная новизна работы. Впервые для анализа микробного сообщества нефтяного пласта применен комплексный подход, сочетающий микробиологические и радиоизотопные методы с молекулярно-экологическим методом, основанным на анализе генов 168 рРНК и а1кВ в библиотеках клонов, созданных на основе ДНК и РНК, выделенных из пластовой воды. Показано, что аэробные спорообразующие бактерии рода ОеоЬасШш доминируют в посевах наибольших разведений пластовой воды на среды с н-алканами и сырой нефтью, что подтверждается выделением чистых культур (О. зиЫеггапеш, О. &1еаю1кегторШ1ш) и доминированием генов 16Б рРНК геобацилл в ДНК-библиотеке клонов микробного сообщества пластовой воды. Выделенные и коллекционные штаммы геобацилл окисляют налканы нефти с длиной цепи С12-С29−31 при температуре инкубации от 45 до 70−75°С. При исследовании 11 штаммов, принадлежащих к разным видам рода ОеоЬасШш, впервые обнаружено 8 различных гомологов гена а1кВ {а1кВ-%ео1 — а1кВ^ео8), кодирующего фермент алкан-монооксигеназу. В геноме каждого штамма геобацилл присутствовало от 3-х до 6-и гомологов гена а1кВ, из которых только а1кВ-%ео1 и а1кВ^ео4 были универсальны для всех штаммов. Последовательности alkB-geol — а1кВ^еоб гомологов геобацилл имеют 87.7−99.2% сходства с генами а1кВ бактерий рода Шойососсш, что позволяет использовать эти гены для детекции геобацилл в природном местообитании только совместно с анализом генов 168 рРНК. Впервые выявлено доминирование последовательностей геобацилл в библиотеках клонов генов 168 рРНК и а1кВ, созданных на основе ДНК из пластовой воды призабойной зоны нагнетательной скважины высокотемпературного нефтяного пласта. Биодеградация нефти в пласте сопровождается увеличением содержания растворенных минеральных.

12 карбонатов, обогащенных изотопом С, и летучих кислот в пластовой воде. Выявлены последовательности 168 рРНК мезофильных и термофильных аэробных органотрофных и бродильных бактерий, а также микроорганизмов цикла серы, что свидетельствует о метаболической активности этих микроорганизмов в нефтяном пласте.

Научно-практическая значимость работы. Выделенные бактерии рода ОеоЬасШш могут использоваться в биотехнологиях очистки от нефти при высокой температуре, а также в биотехнологиях повышения нефтеизвлечения для интродукции в высокотемпературные нефтяные пласты. Метод анализа ДНКи РНК-библиотек клонов генов 168 рРНК и 168 крДНК микроорганизмов пластовой воды, позволяющий полнее охарактеризовать микробное сообщество и выявить метаболически активные микроорганизмы, может быть рекомендован для выбора участков пласта, пригодных для применения биотехнологии повышения нефтеизвлечения, основанной на активации пластовой микрофлоры. Результаты изучения генов биодеградации н-алканов у термофильных прокариот и экологии микроорганизмов нефтяных пластов могут быть использованы при чтении лекций по микробиологии в высших учебных заведениях.

Исследования выполняли в 2002;2012 годах при поддержке РФФИ (гранты №№ 02−439 002, 05−04−39 029 и 06−04−49 128), Китайской национальной нефтяной компании (контракт DFT04−122-IM-18−20RU), Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF RBO-1364-MO и RBO-1364-M0−02) и Миннауки РФ (Ведущая научная школа академика РАНМ.В. Иванова, 2006;РИ-112.0/001/367 и НШ-1189.2012.4).

Материалы диссертации были представлены на 3-м Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), II и III Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006, 2007) и симпозиумах (International Symposium for Subsurface Microbiology) (Джексон-Холл, США, 2005; Шизуока, Япония, 2008).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 статей и 5 тезисов.

Место проведения работы. Работа проводилась в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского Российской академии наук (лаборатория нефтяной микробиологии) под руководством д.б.н. Т. Н. Назиной и в Федеральном государственном бюджетном учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук (ЦКП «Геном») под руководством к.б.н. А. Б. Полтарауса. В отдельных этапах работы принимали участие Н. М. Шестакова, B.C. Ивойлов и Д. Ш. Соколова. В полевых исследованиях на нефтяном месторождении участвовали Фенг Циньсян и Ни Фангтиан (Даганская нефтяная компания, КНР). Геносистематические работы проводили совместно с д.б.н. Т. П. Туровой, жирные кислоты клеточной стенки анализировали под руководством д.б.н. Г. А. Осипова.

Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю д.б.н. Т. Н. Назиной, профессору, д.б.н. С. С. Беляеву, к.б.н. А. Б. Полтараусу и д.б.н. Т. П. Туровой за помощь при выполнении работы и обсуждении результатов. Автор благодарит всех коллег, друзей и свою семью за полезные советы и постоянную поддержку.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 144 страницах машинописного текста и включают 17 рисунков и 19 таблиц. Диссертация состоит их разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», включающая главы «Объекты и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы», содержащий 54 отечественных и 215 зарубеж наименование.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Экспериментальные статьи.

1. Назина Т. Н., Соколова Д. Ш., Шестакова Н. М., Григорьян А. А., Михайлова Е. М., Бабич Т. Л., Лысенко A.M., Турова Т. П., Полтараус А. Б., Циньсян Фенг, Фангтиан Ни, Беляев С. С. Филогенетическое разнообразие аэробных органотрофных бактерий из высокотемпературного нефтяного месторождения Даган // Микробиология. 2005. Т. 74. № 3. С. 401−409.

2. Nazina, T.N., Sokolova, D.Sh., Grigoryan, A.A., Shestakova, N.M., Mikhailova, E.M., Poltaraus, A.B., Tourova, T.P., Lysenko, A.M., Osipov, G.A., Belyaev, S.S. 2005. Geobacillus jurassicus sp. nov., a new thermophilic bacterium isolated from a high-temperature petroleum reservoir, and the validation of the Geobacillus species // Syst. Appl. Microbiol. 28. 43−53.

3. Назина Т. Н., Шестакова H.M., Григорьян A.A., Михайлова Е. М., Турова Т. П., Полтараус А. Б., Циньсян Фен, Фангтиан Ни, С. С. Беляев. Филогенетическое разнообразие и активность анаэробных микроорганизмов высокотемпературных горизонтов нефтяного месторождения Даган (КНР) // Микробиология. 2006. Т. 75. № 1. С. 70−81.

4. Турова Т. П., Назина Т. Н., Михайлова Е. М., Родионова Т. А., Екимов А. Н., Машукова А. В., Полтараус А. Б. Гомологи alkB гена термофильных бактерий рода Geobacillus II Молекулярная биология. 2008. № 2. С. 247−257.

2 5.

5. Назина Т. Н., Михайлова Е. М., Шестакова Н. М., Соколова Д. Ш., Ивойлов B.C., Коршунова А. В., Турова Т. П., Полтараус А. Б., Беляев С. С., Иванов М. В. Биодеградация нефти и гены alkB аэробных термофильных бактерий из нефтяных пластов. Труды Института микробиологии имени С. Н. Виноградского РАН. Вып. 16. Термофильные микроорганизмы. / Ин-т микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН. Отв. редактор В. Ф. Гальченко. М.: МАКС Пресс, 2011.С.193−216.

Тезисы конференций.

6. Михайлова Е. М., Соколова Д. Ш., Григорьян А. А., Гавура М. А., Павлова Н. К., Ивойлов B.C., Божонг My, Назина Т. Н. Биодеградация нефти и образование биосурфактантов термофильными аэробными бактериями. Материалы третьего московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, Россия, 14−18 марта 2005 г. ч. 2. с. 239.

7. Nazina T.N., Grigoryan А.А., Shestakova N.M., Sokolova D.S., Babich T.L., Mikhailova E.M., Feng Q., Ni F., Poltaraus А.В., Belyaev S.S., Ivanov M.V. From microbial ecology to the microbial enhancement of oil recovery (MEOR) of high-temperature petroleum reservoirs. 1. Characterization of a microbial community from the Dagang high-temperature oil field (P.R. China) by culture-based, radioisotopic and molecular methods. // Abstracts of the Joint International.

Symposia for Subsurface Microbiology (ISSM 2005) and Environmental Biogeochemistry (ISEB XVII). P. 121. Jackson Hole, Wyoming, August 14−19, 2005. P. 121.

8. Михайлова E.M., Турова Т. П., Назина Т. Н., Родионова Т. А., Екимов А. Н., Машукова А. В., Полтараус А. Б. Гомологи алкан-гидроксилаз термофильных бактерий рода Geobacillus. Тезисы III Международной молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», 22−23 ноября 2007 г., Москва: Макс-Пресс. С. 77−78.

9. Михайлова Е. М., Соколова Д. Ш., Ивойлов B.C., Назина Т. Н., Полтараус А. Б. Биодеградация нефти и гены биодеградации углеводородов у термофильных бактерий рода Geobacillus. Тезисы II Международной молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (1−3 ноября 2006 г., г. Москва). М.: Макс-Пресс. С. 98−99.

10. Mikhailova Е.М., Shestakova N.M., Rodionova Т.A., Mashukova A.V., Tourova Т.Р., Nazina T.N., Poltaraus A.B. Alkane hydroxylase homologues and its localization in thermophilic bacteria of the genus Geobacillus. In Abstract Book: 7th Int. Symp. for Subsurface Microbiology. Shizuoka, Japan, November 16−21, 2008. P. 172.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

6. выводы.

1. Бактерии рода ОеоЬасШия являются наиболее многочисленной группой культивируемых аэробных термофильных прокариот в высокотемпературном заводняемом нефтяном пласте. Представители рода СеоЬасШия (С. stearothermophilus, О. яиЫеггапеиз, & thermoglucosidans, О. (оеЬИ), выделенные из пластов, приспособлены к среде обитания, используют широкий спектр органических субстратов и С10-С29−31 н-алканы нефти в интервале температуры от 45 до 65−75°С.

2. У бактерий рода ОеоЪасШш обнаружено 8 различных гомологов гена а1кВ (сйкВ-geol — а1кВ^ео8), кодирующего фермент алкан-монооксигеназу. Впервые у термофильных бактерий показано наличие 3−6 гомологов в геноме одного штамма. Последовательности шести а1кВ-гоюпогов геобацилл имеют 87.7−99.2% сходства с генами а1кВ бактерий рода Шюйососст, что позволяет использовать эти гены для детекции геобацилл в природном местообитании только совместно с анализом генов 168 рРНК.

3. Впервые выявлено доминирование последовательностей геобацилл в библиотеках клонов генов 168 рРНК и а1кВ, созданных на основе ДНК из пластовой воды призабойной зоны нагнетательной скважины высокотемпературного нефтяного пласта. Биодеградация нефти в пласте сопровождается увеличением содержания растворенных минеральных карбонатов, обогащенных изотопом 12С, и летучих кислот в пластовой воде.

4. Впервые на основе тотальных ДНК и РНК, выделенных из пластовой воды, выявлены последовательности гена 168 рРНК и 168 крДНК мезофильных и термофильных аэробных органотрофных и сероокисляющих бактерий, бродильных, сульфат-, серои железо-редуцирующих бактерий, что свидетельствует о метаболической активности этих микроорганизмов в нефтяном пласте.

5. Геохимическая активность микроорганизмов цикла серы в нефтяном пласте, изначально лишенном сульфатов, подтверждается появлением сульфатов в пластовой воде и регистрацией термофильных и мезофильных процессов сульфатредукции в призабойной зоне нагнетательных скважин. Термофильный метаногенез доминирует в зоне добывающих скважин нефтяного пласта.