Π”ΠΈΠΏΠ»ΠΎΠΌ, курсовая, ΠΊΠΎΠ½Ρ‚Ρ€ΠΎΠ»ΡŒΠ½Π°Ρ Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚Π°
ΠŸΠΎΠΌΠΎΡ‰ΡŒ Π² написании студСнчСских Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚

Π Π΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½Ρ‚Π½Ρ‹Π΅ Π°Π½Π°Π»ΠΎΠ³ΠΈ Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ Π³Π»ΡƒΡ‚Π°Ρ€ΠΈΠ»-7-аминоцСфалоспорановой кислоты Π±Π°ΠΊΡ‚Π΅Ρ€ΠΈΠΈ Brevundimonas diminuta

Π”ΠΈΡΡΠ΅Ρ€Ρ‚Π°Ρ†ΠΈΡΠŸΠΎΠΌΠΎΡ‰ΡŒ Π² Π½Π°ΠΏΠΈΡΠ°Π½ΠΈΠΈΠ£Π·Π½Π°Ρ‚ΡŒ ΡΡ‚ΠΎΠΈΠΌΠΎΡΡ‚ΡŒΠΌΠΎΠ΅ΠΉ Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚Ρ‹

Π˜ΠΌΠΌΠΎΠ±ΠΈΠ»ΠΈΠ·Π°Ρ†ΠΈΡ Π½Π° Ρ€Π°Π·Π»ΠΈΡ‡Π½Ρ‹Ρ… носитСлях являСтся распространСнным способом создания Π±ΠΎΠ»Π΅Π΅ ΡΡ‚Π°Π±ΠΈΠ»ΡŒΠ½Ρ‹Ρ… Π±ΠΈΠΎΠΊΠ°Ρ‚Π°Π»ΠΈΠ·Π°Ρ‚ΠΎΡ€ΠΎΠ² Π½Π° ΠΎΡΠ½ΠΎΠ²Π΅ ОПАБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·. Π’ Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚Π°Ρ… иммобилизация ΠΎΡΡƒΡ‰Π΅ΡΡ‚Π²Π»ΡΠ»Π°ΡΡŒ Π½Π° ΠΌΠΎΠ΄ΠΈΡ„ΠΈΡ†ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠΌ силикагСлС. НСсмотря Π½Π° ΡƒΡ…ΡƒΠ΄ΡˆΠ΅Π½ΠΈΠ΅ кинСтичСских характСристик ΠΈΠΌΠΌΠΎΠ±ΠΈΠ»ΠΈΠ·ΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π° (сниТСниС Vmax, ΠΏΠΎΠ²Ρ‹ΡˆΠ΅Π½ΠΈΠ΅ Km), ΠΏΠΎ ΡΡ€Π°Π²Π½Π΅Π½ΠΈΡŽ со ΡΠ²ΠΎΠ±ΠΎΠ΄Π½Ρ‹ΠΌ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚ΠΎΠΌ, иммобилизованная 017АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Π° Π±Ρ‹Π»Π° Π°ΠΊΡ‚ΠΈΠ²Π½Π°… Π§ΠΈΡ‚Π°Ρ‚ΡŒ Π΅Ρ‰Ρ‘ >

Π‘ΠΎΠ΄Π΅Ρ€ΠΆΠ°Π½ΠΈΠ΅

  • БПИБОК Π‘ΠžΠšΠ ΠΠ©Π•ΠΠ˜Π™
  • Π“Π»Π°Π²Π° 1. ΠžΠ‘Π—ΠžΠ  Π›Π˜Π’Π•Π ΠΠ’Π£Π Π«
    • 1. 1. ΠžΠ±Ρ‰Π°Ρ характСристика вПАБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·
      • 1. 1. 1. БистСматика цСфалоспорин-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·
      • 1. 1. 2. Гомология ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Ρ‚Π΅Π»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚Π΅ΠΉ цСфалоспорин-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·
      • 1. 1. 3. Бвойства цСфалоспорин-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·
      • 1. 1. 4. Π‘Ρ‚Ρ€ΡƒΠΊΡ‚ΡƒΡ€Π° Π³Π΅Π½ΠΎΠ² цСфалоспорин-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·
      • 1. 1. 5. ΠŸΡ€ΠΎΡ†Π΅ΡΡΠΈΠ½Π³ G17АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·
      • 1. 1. 6. ΠšΠ»ΠΎΠ½ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ ΠΈ Π³Π΅Ρ‚Срологичная экспрСссия цСфалоспорин-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·
      • 1. 1. 7. ΠšΠΎΡΠΊΡΠΏΡ€Π΅ΡΡΠΈΡ ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ† G17 АБ Π-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π· in vivo
    • 1. 2. ΠŸΡ€ΠΎΡΡ‚Ρ€Π°Π½ΡΡ‚Π²Π΅Π½Π½Ρ‹Π΅ структуры вПАБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π· 23 1.2.1. ΠšΠΎΠ½Ρ„ΠΎΡ€ΠΌΠ°Ρ†ΠΈΡ спСйсСрного ΠΏΠ΅ΠΏΡ‚ΠΈΠ΄Π°
    • 1. 3. АминокислотныС остатки сущСствСнныС для ΠΊΠ°Ρ‚Π°Π»ΠΈΠ·Π° ΠΈ Π°ΠΊΡ‚ΠΈΠ²Π°Ρ†ΠΈΠΈ 26 Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π° 017АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹
    • 1. 4. Роль, Π° -Π°ΠΌΠΈΠ½ΠΎΠ³Ρ€ΡƒΠΏΠΏΡ‹ N-ΠΊΠΎΠ½Ρ†Π΅Π²ΠΎΠ³ΠΎ сСрина Ρ€-ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ†Ρ‹ Π² ΠΊΠ°Ρ‚Π°Π»ΠΈΠ·Π΅ 28 ΠΈ Π°ΠΊΡ‚ΠΈΠ²Π°Ρ†ΠΈΠΈ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π° Π‘17АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹
    • 1. 5. ΠœΠ΅Ρ…Π°Π½ΠΈΠ·ΠΌ ΠΈ ΡΠ°ΠΉΡ‚Ρ‹ Π°Π²Ρ‚ΠΎΠΏΡ€ΠΎΡ‚Π΅ΠΎΠ»ΠΈΠ·Π° ОПАБА-Π°Ρ†Π½Π»Π°Π·Ρ‹
    • 1. 6. Активный Ρ†Π΅Π½Ρ‚Ρ€ GlTACA-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹
    • 1. 7. ΠœΠ΅Ρ‚ΠΎΠ΄Ρ‹ Π½Π°ΠΏΡ€Π°Π²Π»Π΅Π½Π½ΠΎΠΉ ΡΠ²ΠΎΠ»ΡŽΡ†ΠΈΠΈ Π² ΠΈΡΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠΈ 017АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·
    • 1. 8. ΠœΠ΅Ρ‚ΠΎΠ΄Ρ‹ сайт-Π½Π°ΠΏΡ€Π°Π²Π»Π΅Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΠΌΡƒΡ‚Π°Π³Π΅Π½Π΅Π·Π° для ΠΏΠΎΠ²Ρ‹ΡˆΠ΅Π½ΠΈΡ активности 40 ΠΈ ΡΡ‚Π°Π±ΠΈΠ»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚ΠΈ цСфалоспорин-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·
      • 1. 8. 1. Π‘Π°ΠΉΡ‚-Π½Π°ΠΏΡ€Π°Π²Π»Π΅Π½Π½Ρ‹ΠΉ ΠΌΡƒΡ‚Π°Π³Π΅Π½Π΅Π· повСрхностных остатков для 41 ΠΏΠΎΠ²Ρ‹ΡˆΠ΅Π½ΠΈΡ ΡΡ‚Π°Π±ΠΈΠ»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚ΠΈ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π° Π² Ρ‰Π΅Π»ΠΎΡ‡Π½Ρ‹Ρ… условиях
      • 1. 8. 2. Π‘Π°ΠΉΡ‚-Π½Π°ΠΏΡ€Π°Π²Π»Π΅Π½Π½Ρ‹ΠΉ ΠΌΡƒΡ‚Π°Π³Π΅Π½Π΅Π· ΠΊΠ»ΡŽΡ‡Π΅Π²Ρ‹Ρ… остатков для ΠΏΠΎΠ²Ρ‹ΡˆΠ΅Π½ΠΈΡ 43 активности 017АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·
    • 1. 9. Π‘Π΅Π»ΠΎΠΊ-Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ²Ρ‹Π΅ взаимодСйствия
      • 1. 9. 1. ΠšΠ»Π°ΡΡΠΈΡ„ΠΈΠΊΡ†ΠΈΡ Π±Π΅Π»ΠΎΠΊ-Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ²Ρ‹Ρ… взаимодСйствий
      • 1. 9. 2. ΠžΠ±Π»Π°ΡΡ‚ΡŒ ΠΌΠ΅ΠΆΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ‡Π½Ρ‹Ρ… взаимодСйствий Π±Π΅Π»ΠΎΠΊ-Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ 44 комплСкса
      • 1. 9. 3. ΠœΠ΅Ρ‚ΠΎΠ΄Ρ‹ исслСдований Π±Π΅Π»ΠΎΠΊ-Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ²Ρ‹Ρ… взаимодСйствий
      • 1. 9. 4. Π’ΠΈΡ€Ρ‚ΡƒΠ°Π»ΡŒΠ½ΠΎΠ΅ Π°Π»Π°Π½ΠΈΠ½ΠΎΠ²ΠΎΠ΅ сканированиС

Π Π΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½Ρ‚Π½Ρ‹Π΅ Π°Π½Π°Π»ΠΎΠ³ΠΈ Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ Π³Π»ΡƒΡ‚Π°Ρ€ΠΈΠ»-7-аминоцСфалоспорановой кислоты Π±Π°ΠΊΡ‚Π΅Ρ€ΠΈΠΈ Brevundimonas diminuta (Ρ€Π΅Ρ„Π΅Ρ€Π°Ρ‚, курсовая, Π΄ΠΈΠΏΠ»ΠΎΠΌ, ΠΊΠΎΠ½Ρ‚Ρ€ΠΎΠ»ΡŒΠ½Π°Ρ)

Ацилазы Π³Π»ΡƒΡ‚Π°Ρ€ΠΈΠ»-7-аминоцСфалоспорановой кислоты (вПАБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹, Π•Π‘ 3.5.1.93) — ΠΏΡ€ΠΎΠΌΡ‹ΡˆΠ»Π΅Π½Π½Ρ‹Π΅ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Ρ‹, наряду с ΠΏΠ΅Π½ΠΈΡ†ΠΈΠ»Π»ΠΈΠ½Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Π°ΠΌΠΈ, способныС ΠΏΡ€Π΅Π²Ρ€Π°Ρ‰Π°Ρ‚ΡŒ цСфалоспорины Π² Ρ†Π΅Π½Π½Ρ‹Π΅ ΠΏΡ€ΠΎΠΌΠ΅ΠΆΡƒΡ‚ΠΎΡ‡Π½Ρ‹Π΅ соСдинСния, ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡŒΠ·ΡƒΠ΅ΠΌΡ‹Π΅ для производства Π½ΠΎΠ²Ρ‹Ρ… Π°Π½Ρ‚ΠΈΠ±ΠΈΠΎΡ‚ΠΈΠΊΠΎΠ². вПАБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Π° ΠΊΠ°Ρ‚Π°Π»ΠΈΠ·ΠΈΡ€ΡƒΠ΅Ρ‚ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π°Ρ‚ΠΈΠ²Π½ΠΎΠ΅ ΠΏΡ€Π΅Π²Ρ€Π°Ρ‰Π΅Π½ΠΈΠ΅ Π³Π»ΡƒΡ‚Π°Ρ€ΠΈΠ»-7-АБА (G17ACA) Π² 7-Π°ΠΌΠΈΠ½ΠΎΡ†Π΅Ρ„Π°Π»ΠΎΡΠΏΠΎΡ€Π°Π½ΠΎΠ²ΡƒΡŽ кислоту (7-АБА), ΠΏΡ€ΠΈ ΠΊΠΎΡ‚ΠΎΡ€ΠΎΠΌ происходит расщСплСниС Π°ΠΌΠΈΠ΄Π½ΠΎΠΉ связи с ΠΎΠ±Ρ€Π°Π·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π³Π»ΡƒΡ‚Π°Ρ€Π°Ρ‚Π° ΠΈ 7-АБА [Ichikawa et al, 1981Π°Ichikawa et al., 1981b],.

АктивныС Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Ρ‹ ΡΠ²Π»ΡΡŽΡ‚ΡΡ Π³Π΅Ρ‚Π΅Ρ€ΠΎΡ‚Π΅Ρ‚Ρ€Π°ΠΌΠ΅Ρ€Π°ΠΌΠΈ, состоящими ΠΈΠ· 2Ρ… Π°ΠΈ 2Ρ… Π -ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ†, ΠΊΠΎΡ‚ΠΎΡ€Ρ‹Π΅ Ρ„ΠΎΡ€ΠΌΠΈΡ€ΡƒΡŽΡ‚ΡΡ ΠΈΠ· ΠΎΠ΄Π½ΠΎΡ†Π΅ΠΏΠΎΡ‡Π΅Ρ‡Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΏΠ΅ΠΏΡ‚ΠΈΠ΄Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΠΏΡ€Π΅Π΄ΡˆΠ΅ΡΡ‚Π²Π΅Π½Π½ΠΈΠΊΠ° Π² Ρ€Π΅Π·ΡƒΠ»ΡŒΡ‚Π°Ρ‚Π΅ спСцифичСского процСссинга Π±Π΅Π»ΠΊΠ°-ΠΏΡ€Π΅Π΄ΡˆΠ΅ΡΡ‚Π²Π΅Π½Π½ΠΈΠΊΠ° ΠΈ Ρ…Π°Ρ€Π°ΠΊΡ‚Π΅Ρ€ΠΈΠ·ΡƒΡŽΡ‚ΡΡ высокой Π°ΠΊΡ‚ΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡ‚ΡŒΡŽ ΠΏΠΎ ΠΎΡ‚Π½ΠΎΡˆΠ΅Π½ΠΈΡŽ ΠΊ G17ACA, ΠΏΡ€ΠΈ Π½ΠΈΠ·ΠΊΠΎΠΉ активности ΠΏΠΎ ΠΎΡ‚Π½ΠΎΡˆΠ΅Π½ΠΈΡŽ ΠΊ Ρ†Π΅Ρ„алоспорину Π‘ [Ichikawa et al., 1981Π°Matsuda et al., 1985; Ishii et al., 1994].

ВысокоС биотСхнологичСскоС Π·Π½Π°Ρ‡Π΅Π½ΠΈΠ΅ вПАБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π· опрСдСляСт интСрСс ΠΊ Ρ€Π°Π·Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚ΠΊΠ΅ эффСктивных ΠΈ ΡΠΊΠΎΠ½ΠΎΠΌΠΈΡ‡Π½Ρ‹Ρ… систСм ΠΏΡ€ΠΎΠ΄ΡƒΠΊΡ†ΠΈΠΈ этого Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π°. Π’ Ρ‚ΠΎΠΆΠ΅ врСмя, ΡΡƒΡ‰Π΅ΡΡ‚Π²ΡƒΡŽΡ‰ΠΈΠ΅ ΠΌΠ΅Ρ‚ΠΎΠ΄Ρ‹ получСния Ρ€Π΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½Ρ‚Π½Ρ‹Ρ… 017АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π· нСльзя ΠΏΡ€ΠΈΠ·Π½Π°Ρ‚ΡŒ достаточно эффСктивными, Ρ‡Ρ‚ΠΎ связано со ΡΠ»ΠΎΠΆΠ½ΠΎΠΉ структурой ΠΏΡ€Π΅Π΄ΡˆΠ΅ΡΡ‚Π²Π΅Π½Π½ΠΈΠΊΠ° ΠΈ Π½Π΅Π΄ΠΎΡΡ‚Π°Ρ‚ΠΎΡ‡Π½ΠΎΠΉ ΠΈΠ·ΡƒΡ‡Π΅Π½Π½ΠΎΡΡ‚ΡŒΡŽ закономСрности процСссинга ΠΈ ΡΠ±ΠΎΡ€ΠΊΠΈ Ρ„ΡƒΠ½ΠΊΡ†ΠΈΠΎΠ½Π°Π»ΡŒΠ½ΠΎ-Π°ΠΊΡ‚ΠΈΠ²Π½ΠΎΠ³ΠΎ Ρ‚Π΅Ρ‚Ρ€Π°ΠΌΠ΅Ρ€Π° Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π° [Li et al., 1998; Li et al., 2004]. ΠΠ΅ΠΎΠ±Ρ…ΠΎΠ΄ΠΈΠΌΠΎΡΡ‚ΡŒ освобоТдСния ΠΈΠΌΠΌΠΎΠ±ΠΈΠ»ΠΈΠ·ΠΎΠ²Π°Π½Π½Ρ‹Ρ… ΠΏΡ€Π΅ΠΏΠ°Ρ€Π°Ρ‚ΠΎΠ² Π‘17АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π· ΠΎΡ‚ ΠΏΡ€ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ΅ΠΉ нСспСцифичСских Π±Π΅Ρ‚Π°-Π»Π°ΠΊΡ‚Π°ΠΌΠ°Π· ΠΈ ΡΡΡ‚Π΅Ρ€Π°Π·, ΠΎΡ‚Π½ΠΎΡΠΈΡ‚Π΅Π»ΡŒΠ½ΠΎ нСвысокая каталитичСская Π°ΠΊΡ‚ΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡ‚ΡŒ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π°, Π½Π΅ΡΡ‚Π°Π±ΠΈΠ»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚ΡŒ Ρ‚Π΅Ρ‚Ρ€Π°ΠΌΠ΅Ρ€Π° Π±Π΅Π»ΠΊΠ° ΠΏΠΎΠ΄ дСйствиСм мягких Π΄Π΅Π½Π°Ρ‚ΡƒΡ€ΠΈΡ€ΡƒΡŽΡ‰ΠΈΡ… Π°Π³Π΅Π½Ρ‚ΠΎΠ², ΠΏΡ€ΠΈ ΡƒΠΌΠ΅Ρ€Π΅Π½Π½Ρ‹Ρ… Ρ‚Π΅ΠΌΠΏΠ΅Ρ€Π°Ρ‚ΡƒΡ€Π°Ρ…, частичная инактивация Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π° ΠΏΠΎΠ΄ дСйствиСм «ΡΡˆΠΈΠ²Π°ΡŽΡ‰ΠΈΡ…» Π°Π³Π΅Π½Ρ‚ΠΎΠ², ΠΎΡΠ»ΠΎΠΆΠ½ΡΡŽΡ‚ ΠΏΠΎΠ»ΡƒΡ‡Π΅Π½ΠΈΠ΅ эффСктивных ΠΈΠΌΠΌΠΎΠ±ΠΈΠ»ΠΈΠ·ΠΎΠ²Π°Π½Π½Ρ‹Ρ… ΠΏΡ€Π΅ΠΏΠ°Ρ€Π°Ρ‚ΠΎΠ² вПАБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π· [Friehs et al., 1993; Vethanayagam et al., 2005].

Π’ ΡΡ‚ΠΎΠΉ связи вСсьма Π°ΠΊΡ‚ΡƒΠ°Π»ΡŒΠ½Ρ‹ΠΌ являСтся ΠΏΡ€ΠΎΠ²Π΅Π΄Π΅Π½ΠΈΠ΅ исслСдований, посвящСнных созданию Π½ΠΎΠ²Ρ‹Ρ… ΡˆΡ‚Π°ΠΌΠΌΠΎΠ²-ΠΏΡ€ΠΎΠ΄ΡƒΡ†Π΅Π½Ρ‚ΠΎΠ² ΠΈ ΡƒΡΠΎΠ²Π΅Ρ€ΡˆΠ΅Π½ΡΡ‚Π²ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡŽ 7 извСстных ΠΌΠ΅Ρ‚ΠΎΠ΄ΠΎΠ² получСния ΠΏΡ€Π΅ΠΏΠ°Ρ€Π°Ρ‚ΠΎΠ² GlVACA-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹, Π° Ρ‚Π°ΠΊΠΆΠ΅ исслСдований, Π½Π°ΠΏΡ€Π°Π²Π»Π΅Π½Π½Ρ‹Ρ… Π½Π° ΡƒΠ³Π»ΡƒΠ±Π»Π΅Π½Π½Ρ‹ΠΉ структурно-Ρ„ΡƒΠ½ΠΊΡ†ΠΈΠΎΠ½Π°Π»ΡŒΠ½Ρ‹ΠΉ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ· этого Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π° ΠΈ ΡΠΎΠ·Π΄Π°Π½ΠΈΠ΅ Π½ΠΎΠ²Ρ‹Ρ… Π°Π½Π°Π»ΠΎΠ³ΠΎΠ² GnACA-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ с ΡƒΠ»ΡƒΡ‡ΡˆΠ΅Π½Π½Ρ‹ΠΌΠΈ Ρ„ΠΈΠ·ΠΈΠΊΠΎ-химичСскими ΠΈ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π°Ρ‚ΠΈΠ²Π½Ρ‹ΠΌΠΈ свойствами, с ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡŒΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΠΌΠ΅Ρ‚ΠΎΠ΄ΠΎΠ² Π±ΠΈΠΎΠΈΠ½Ρ„ΠΎΡ€ΠΌΠ°Ρ‚ΠΈΠΊΠΈ ΠΈ Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ²ΠΎΠΉ ΠΈΠ½ΠΆΠ΅Π½Π΅Ρ€ΠΈΠΈ.

ЦСлью настоящСй Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚Ρ‹ являлось созданиС систСм экспрСссии Π°Π½Π°Π»ΠΎΠ³ΠΎΠ² 017АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹, ΠΎΠ±Π΅ΡΠΏΠ΅Ρ‡ΠΈΠ²Π°ΡŽΡ‰ΠΈΡ… эффСктивный синтСз Π΄Π°Π½Π½Ρ‹Ρ… Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚ΠΎΠ² Π² ΠΊΠ»Π΅Ρ‚ΠΊΠ°Ρ… E. coli ΠΈ ΡƒΠΏΡ€ΠΎΡ‰Π°ΡŽΡ‰ΠΈΡ… ΠΏΡ€ΠΎΡ†Π΅Π΄ΡƒΡ€Ρ‹ ΠΈΡ… ΠΎΡ‡ΠΈΡΡ‚ΠΊΠΈ ΠΈ ΠΈΠΌΠΌΠΎΠ±ΠΈΠ»ΠΈΠ·Π°Ρ†ΠΈΠΈ, Π° Ρ‚Π°ΠΊΠΆΠ΅ Ρ€Π°Π·Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚ΠΊΠ° ΠΏΠΎΠ΄Ρ…ΠΎΠ΄ΠΎΠ² для получСния Π±ΠΎΠ»Π΅Π΅ ΡΡ‚Π°Π±ΠΈΠ»ΡŒΠ½Ρ‹Ρ… Π°Π½Π°Π»ΠΎΠ³ΠΎΠ² Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π°, ΠΈΠ·ΡƒΡ‡Π΅Π½ΠΈΠ΅ особСнностСй процСссов формирования Ρ‡Π΅Ρ‚Π²Π΅Ρ€Ρ‚ΠΈΡ‡Π½ΠΎΠΉ структуры 017АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹. Для этого Π² Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚Π΅ Ρ€Π΅ΡˆΠ°Π»ΠΈΡΡŒ ΡΠ»Π΅Π΄ΡƒΡŽΡ‰ΠΈΠ΅ Π·Π°Π΄Π°Ρ‡ΠΈ:

1. ΠšΠ»ΠΎΠ½ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ Π³Π΅Π½Π° GnACA-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ Π±Π°ΠΊΡ‚Π΅Ρ€ΠΈΠΈ Brevundimonas diminuta (BrdGIA), конструированиС Π²Π°Ρ€ΠΈΠ°Π½Ρ‚ΠΎΠ² Π³Π΅Π½Π° BrdGIA, ΠΌΠΎΠ΄ΠΈΡ„ΠΈΡ†ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½Π½Ρ‹Ρ… присоСдинСниСм Π°Ρ„Ρ„ΠΈΠ½Π½Ρ‹Ρ… остатков ΠΊ Ρ€Π°Π·Π»ΠΈΡ‡Π½Ρ‹ΠΌ участкам ΠΊΠΎΠ΄ΠΈΡ€ΡƒΡŽΡ‰Π΅ΠΉ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Ρ‚Π΅Π»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚ΠΈ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π°.

2. ΠžΠΏΡ‚ΠΈΠΌΠΈΠ·Π°Ρ†ΠΈΡ процСссов биосинтСза созданных Π²Π°Ρ€ΠΈΠ°Π½Ρ‚ΠΎΠ² BrdGIA Π² ΡˆΡ‚Π°ΠΌΠΌΠ°Ρ… E. col/-ΠΏΡ€ ΠΎΠ΄Ρƒ Ρ†Π΅Π½Ρ‚Π°Ρ…, ΠΎΡ‚Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚ΠΊΠ° условий получСния ΠΈ ΠΎΡ‡ΠΈΡΡ‚ΠΊΠΈ Ρ€Π΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½Ρ‚Π½Ρ‹Ρ… Π°Π½Π°Π»ΠΎΠ³ΠΎΠ² BrdGIA ΠΈ ΠΈΠ·ΠΎΠ»ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½Π½Ρ‹Ρ… ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ† Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π°.

3. Π Π°Π·Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚ΠΊΠ° схСмы одностадийной Π°Ρ„Ρ„ΠΈΠ½Π½ΠΎΠΉ очистки Π°Π½Π°Π»ΠΎΠ³Π° BrdGIA с ΠΏΡ€ΠΈΡΠΎΠ΅Π΄ΠΈΠ½Π΅Π½Π½Ρ‹ΠΌ N-ΠΊΠΎΠ½Ρ†Π΅Π²Ρ‹ΠΌ Ρ…ΠΈΡ‚ΠΈΠ½-ΡΠ²ΡΠ·Ρ‹Π²Π°ΡŽΡ‰ΠΈΠΌ Π΄ΠΎΠΌΠ΅Π½ΠΎΠΌ Π½Π° Ρ…ΠΈΡ‚ΠΈΠ½ΠΎΠ²Ρ‹Ρ… сорбСнтах, ΠΎΠΏΡ€Π΅Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ кинСтичСских ΠΈ Ρ„ΠΈΠ·ΠΈΠΊΠΎ-химичСских ΠΏΠ°Ρ€Π°ΠΌΠ΅Ρ‚Ρ€ΠΎΠ² ΠΎΡ‡ΠΈΡ‰Π΅Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π°.

4. ИсслСдованиС закономСрностСй рСконструкции ΠΈ ΡΠ±ΠΎΡ€ΠΊΠΈ Ρ„ΡƒΠ½ΠΊΡ†ΠΈΠΎΠ½Π°Π»ΡŒΠ½ΠΎ-Π°ΠΊΡ‚ΠΈΠ²Π½ΠΎΠΉ BrdGIA in vitro с ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡŒΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΠΈΠ·ΠΎΠ»ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½Π½Ρ‹Ρ… Ρ€Π΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½Ρ‚Π½Ρ‹Ρ… Π°ΠΈ Ρ€-ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ†.

5. Π˜Π·ΡƒΡ‡Π΅Π½ΠΈΠ΅ области ΠΊΠΎΠ½Ρ‚Π°ΠΊΡ‚Π° ΠΌΠ΅ΠΆΠ΄Ρƒ ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ†Π°ΠΌΠΈ GnACA-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹, ΠΎΠΏΡ€Π΅Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΎΡ‚Π½ΠΎΡΠΈΡ‚Π΅Π»ΡŒΠ½ΠΎΠ³ΠΎ Π²ΠΊΠ»Π°Π΄Π° Π³ΠΈΠ΄Ρ€ΠΎΡ„ΠΎΠ±Π½Ρ‹Ρ… ΠΈ ΡΠ»Π΅ΠΊΡ‚ростатичСских взаимодСйствий Π² ΠΏΠΎΠ΄Π΄Π΅Ρ€ΠΆΠ°Π½ΠΈΠ΅ Ρ‡Π΅Ρ‚Π²Π΅Ρ€Ρ‚ΠΈΡ‡Π½ΠΎΠΉ структуры Ρ‚Π΅Ρ‚Ρ€Π°ΠΌΠ΅Ρ€Π° 017АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹.

Π’Π«Π’ΠžΠ”Π«:

1. ΠšΠ»ΠΎΠ½ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½ Π³Π΅Π½ GlVACA-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ Π±Π°ΠΊΡ‚Π΅Ρ€ΠΈΠΈ Brevnndimonas diminuta (BrdGlA), ΠΎΠΏΡ‚ΠΈΠΌΠΈΠ·ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½Ρ‹ систСмы экспрСссии для получСния «Π½Π°Ρ‚ΠΈΠ²Π½ΠΎΠΉ» Ρ€Π΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½Ρ‚Π½ΠΎΠΉ BrdGlA ΠΈ Π΅Π΅ Π°Π½Π°Π»ΠΎΠ³ΠΎΠ² Π² ΠΊΠ»Π΅Ρ‚ΠΊΠ°Ρ… E.coli.

2. Показано, Ρ‡Ρ‚ΠΎ ΠΏΡ€ΠΎΠ΄ΡƒΡ†ΠΈΡ€ΡƒΠ΅ΠΌΡ‹Π΅ Π² ΠΊΠ»Π΅Ρ‚ΠΊΠ°Ρ… E. coli Ρ€Π΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½Ρ‚Π½Ρ‹Π΅ Π°Π½Π°Π»ΠΎΠ³ΠΈ GlVACA-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹, нСсущиС NΠΈ Π‘-ΠΊΠΎΠ½Ρ†Π΅Π²Ρ‹Π΅ Π°Ρ„Ρ„ΠΈΠ½Π½Ρ‹Π΅ ΠΌΠΎΠ΄ΠΈΡ„ΠΈΠΊΠ°Ρ†ΠΈΠΈ, ΠΏΠΎΠ΄Π²Π΅Ρ€Π³Π°ΡŽΡ‚ΡΡ ΠΏΡ€Π°Π²ΠΈΠ»ΡŒΠ½ΠΎΠΌΡƒ автопротСолитичСскому процСссингу с ΠΎΠ±Ρ€Π°Π·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Ρ„ΡƒΠ½ΠΊΡ†ΠΈΠΎΠ½Π°Π»ΡŒΠ½ΠΎ-Π°ΠΊΡ‚ΠΈΠ²Π½Ρ‹Ρ… Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚ΠΎΠ².

3. Π Π°Π·Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚Π°Π½Π° схСма одностадийной Π°Ρ„Ρ„ΠΈΠ½Π½ΠΎΠΉ очистки Π°Π½Π°Π»ΠΎΠ³Π° GlVACA-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ с ΠΏΡ€ΠΈΡΠΎΠ΅Π΄ΠΈΠ½Π΅Π½Π½Ρ‹ΠΌ N-ΠΊΠΎΠ½Ρ†Π΅Π²Ρ‹ΠΌ Ρ…ΠΈΡ‚ΠΈΠ½-ΡΠ²ΡΠ·Ρ‹Π²Π°ΡŽΡ‰ΠΈΠΌ Π΄ΠΎΠΌΠ΅Π½ΠΎΠΌ Π½Π° Ρ…ΠΈΡ‚ΠΈΠ½ΠΎΠ²Ρ‹Ρ… сорбСнтах, ΠΏΠΎΠ·Π²ΠΎΠ»ΡΡŽΡ‰Π°Ρ ΠΏΠΎΠ»ΡƒΡ‡Π°Ρ‚ΡŒ ΡΡ‚Π°Π±ΠΈΠ»ΡŒΠ½Ρ‹ΠΉ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚ с Π²Ρ‹ΡΠΎΠΊΠΈΠΌ Π²Ρ‹Ρ…ΠΎΠ΄ΠΎΠΌ. Показано, Ρ‡Ρ‚ΠΎ Ρ‚Π°ΠΊΠΎΠΉ Π°Π½Π°Π»ΠΎΠ³ GnACA-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ ΠΎΠ±Π»Π°Π΄Π°Π΅Ρ‚ ΠΏΠΎΠ²Ρ‹ΡˆΠ΅Π½Π½Ρ‹ΠΌΠΈ Ρ‚Π΅Ρ€ΠΌΠΎΡΡ‚Π°Π±ΠΈΠ»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚ΡŒΡŽ ΠΈ ΡƒΠ»ΡƒΡ‡ΡˆΠ΅Π½Π½Ρ‹ΠΌΠΈ энзиматичСскими характСристиками ΠΏΠΎ ΡΡ€Π°Π²Π½Π΅Π½ΠΈΡŽ смодифицированными Ρ€Π΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½Ρ‚Π½Ρ‹ΠΌΠΈ Π²Π°Ρ€ΠΈΠ°Π½Ρ‚Π°ΠΌΠΈ этого Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π°.

4. Показано, Ρ‡Ρ‚ΠΎ Ρ„ΠΎΡ€ΠΌΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ Π½Π°Ρ‚ΠΈΠ²Π½ΠΎΠΉ пространствСнной ΠΊΠΎΠ½Ρ„ΠΎΡ€ΠΌΠ°Ρ†ΠΈΠΈ ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ† Π‘17АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ происходит Π² ΠΏΡ€ΠΎΡ†Π΅ΡΡΠ΅ синтСза ΠΈ ΠΏΡ€ΠΎΡ†Π΅ΡΡΠΈΠ½Π³Π° Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π° ΠΈ Π²Π·Π°ΠΈΠΌΠΎΠ΄Π΅ΠΉΡΡ‚вия вновь синтСзируСмых ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ†.

5. Π‘ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡ‰ΡŒΡŽ структурно-графичСского Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ·Π° Π΄ΠΈΠΌΠ΅Ρ€Π° ΠΈ Ρ‚Π΅Ρ‚Ρ€Π°ΠΌΠ΅Ρ€Π° GlVACA-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ ΠΏΠΎΠΊΠ°Π·Π°Π½ΠΎ, Ρ‡Ρ‚ΠΎ Π΄ΠΎΠΌΠΈΠ½ΠΈΡ€ΡƒΡŽΡ‰ΠΈΠΌ Ρ‚ΠΈΠΏΠΎΠΌ взаимодСйствий Π² ΠΎΠ±Π»Π°ΡΡ‚ΠΈ ΠΊΠΎΠ½Ρ‚Π°ΠΊΡ‚Π° Π΄Π²ΡƒΡ… ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ† ΡΠ²Π»ΡΡŽΡ‚ΡΡ соотвСтствСнно Π³ΠΈΠ΄Ρ€ΠΎΡ„ΠΎΠ±Π½Ρ‹Π΅ ΠΈ ΡΠ»Π΅ΠΊΡ‚ростатичСскиС взаимодСйствия.

1.10.

Π—Π°ΠΊΠ»ΡŽΡ‡Π΅Π½ΠΈΠ΅

.

ΠžΡΠ½ΠΎΠ²Π½Ρ‹ΠΌ Π½Π°ΠΏΡ€Π°Π²Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ²ΠΎΠΉ ΠΈΠ½ΠΆΠ΅Π½Π΅Ρ€ΠΈΠΈ ОПАБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π· являСтся созданиС Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚ΠΎΠ² с ΡƒΠ»ΡƒΡ‡ΡˆΠ΅Π½Π½Ρ‹ΠΌΠΈ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π°Ρ‚ΠΈΠ²Π½Ρ‹ΠΌΠΈ ΠΈ Ρ„ΠΈΠ·ΠΈΠΊΠΎ-химичСскими характСристиками, ΠΎΠ±Π»Π°Π΄Π°ΡŽΡ‰ΠΈΡ… ΠΏΠΎΠ²Ρ‹ΡˆΠ΅Π½Π½ΠΎΠΉ ΡΡ‚Π°Π±ΠΈΠ»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚ΡŒΡŽ пространствСнной структуры, ΡƒΡΡ‚ΠΎΠΉΡ‡ΠΈΠ²ΠΎΡΡ‚ΡŒΡŽ ΠΊ Ρ‚Π΅ΠΌΠΏΠ΅Ρ€Π°Ρ‚ΡƒΡ€Π½Ρ‹ΠΌ измСнСниям, химичСским Π°Π³Π΅Π½Ρ‚Π°ΠΌ.

Π˜ΠΌΠΌΠΎΠ±ΠΈΠ»ΠΈΠ·Π°Ρ†ΠΈΡ Π½Π° Ρ€Π°Π·Π»ΠΈΡ‡Π½Ρ‹Ρ… носитСлях являСтся распространСнным способом создания Π±ΠΎΠ»Π΅Π΅ ΡΡ‚Π°Π±ΠΈΠ»ΡŒΠ½Ρ‹Ρ… Π±ΠΈΠΎΠΊΠ°Ρ‚Π°Π»ΠΈΠ·Π°Ρ‚ΠΎΡ€ΠΎΠ² Π½Π° ΠΎΡΠ½ΠΎΠ²Π΅ ОПАБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π· [Alonso-Morales et al. 2004, Park et al., 2002a, 2003b]. Π’ Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚Π°Ρ… [Park et al., 2002b, 2003a] иммобилизация ΠΎΡΡƒΡ‰Π΅ΡΡ‚Π²Π»ΡΠ»Π°ΡΡŒ Π½Π° ΠΌΠΎΠ΄ΠΈΡ„ΠΈΡ†ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠΌ силикагСлС. НСсмотря Π½Π° ΡƒΡ…ΡƒΠ΄ΡˆΠ΅Π½ΠΈΠ΅ кинСтичСских характСристик ΠΈΠΌΠΌΠΎΠ±ΠΈΠ»ΠΈΠ·ΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π° (сниТСниС Vmax, ΠΏΠΎΠ²Ρ‹ΡˆΠ΅Π½ΠΈΠ΅ Km), ΠΏΠΎ ΡΡ€Π°Π²Π½Π΅Π½ΠΈΡŽ со ΡΠ²ΠΎΠ±ΠΎΠ΄Π½Ρ‹ΠΌ Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚ΠΎΠΌ, иммобилизованная 017АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Π° Π±Ρ‹Π»Π° Π°ΠΊΡ‚ΠΈΠ²Π½Π° Π² Π±ΠΎΠ»Π΅Π΅ ΡˆΠΈΡ€ΠΎΠΊΠΎΠΌ рН Π΄ΠΈΠ°ΠΏΠ°Π·ΠΎΠ½Π΅ ΠΈ ΠΎΡ‚Π»ΠΈΡ‡Π°Π»Π°ΡΡŒ ΠΏΠΎΠ²Ρ‹ΡˆΠ΅Π½Π½ΠΎΠΉ Ρ‚Π΅ΠΌΠΏΠ΅Ρ€Π°Ρ‚ΡƒΡ€Π½ΠΎΠΉ ΡΡ‚Π°Π±ΠΈΠ»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚ΡŒΡŽ. ΠœΠ½ΠΎΠΆΠ΅ΡΡ‚Π²ΠΎ исслСдований посвящСно ΠΏΠΎΠ»ΡƒΡ‡Π΅Π½ΠΈΡŽ Π±ΠΎΠ»Π΅Π΅ ΡΡ‚Π°Π±ΠΈΠ»ΡŒΠ½Ρ‹Ρ… Π°Π½Π°Π»ΠΎΠ³ΠΎΠ² 017АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ ΠΌΠ΅Ρ‚ΠΎΠ΄Π°ΠΌΠΈ Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ²ΠΎΠΉ ΠΈΠ½ΠΆΠ΅Π½Π΅Ρ€ΠΈΠΈ [Seung et al., 2001; Oh et al, 2003; Saito et al., 1996; Yamada et al, 1996].

НСсмотря Π½Π° ΠΈΠ·Π²Π΅ΡΡ‚Π½Ρ‹Π΅ Π΄Π°Π½Π½Ρ‹Π΅ ΠΎ Π»Π°Π±ΠΈΠ»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚ΠΈ Ρ‡Π΅Ρ‚Π²Π΅Ρ€Ρ‚ΠΈΡ‡Π½ΠΎΠΉ структуры Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹, [Kim et al, 2000] Π½Π΅Ρ‚ Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚, посвящСнных ΠΈΠ·ΡƒΡ‡Π΅Π½ΠΈΡŽ ΠΌΠ΅ΠΆΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ‡Π½Ρ‹Ρ… взаимодСйствий ΠΊΠ°ΠΊ Π² Π΄ΠΈΠΌΠ΅Ρ€Π΅ Π‘17АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹, Ρ‚Π°ΠΊ ΠΈ Π² Π³Π΅Ρ‚Π΅Ρ€ΠΎΡ‚Π΅Ρ‚Ρ€Π°ΠΌΠ΅Ρ€Π΅. Π’ Ρ‚ΠΎ ΠΆΠ΅ врСмя, прСдставляСтся ΠΎΡ‡Π΅Π²ΠΈΠ΄Π½Ρ‹ΠΌ, Ρ‡Ρ‚ΠΎ Π·Π½Π°Π½ΠΈΠ΅ закономСрностСй Ρ„ΠΎΠ»Π΄ΠΈΠ½Π³Π° Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π°, сборки Π°ΠΊΡ‚ΠΈΠ²Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π³Π΅Ρ‚Π΅Ρ€ΠΎΡ‚Π΅Ρ‚Ρ€Π°ΠΌΠ΅Ρ€Π½ΠΎΠ³ΠΎ комплСкса, ΠΎΠΏΡ€Π΅Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ констант взаимодСйствия ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ† Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π° Π±ΡƒΠ΄ΡƒΡ‚ ΡΠΏΠΎΡΠΎΠ±ΡΡ‚Π²ΠΎΠ²Π°Ρ‚ΡŒ Ρ€Π°Ρ†ΠΈΠΎΠ½Π°Π»ΡŒΠ½ΠΎΠΌΡƒ Π΄ΠΈΠ·Π°ΠΉΠ½Ρƒ ΠΈ ΠΏΠΎΠ»ΡƒΡ‡Π΅Π½ΠΈΡŽ ΡƒΠ»ΡƒΡ‡ΡˆΠ΅Π½Π½Ρ‹Ρ… Π°Π½Π°Π»ΠΎΠ³ΠΎΠ² Π‘17АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ для создания Π±ΠΎΠ»Π΅Π΅ ΡΡ‚Π°Π±ΠΈΠ»ΡŒΠ½Ρ‹Ρ… Π±ΠΈΠΎΠΊΠ°Ρ‚Π°Π»ΠΈΠ·Π°Ρ‚ΠΎΡ€ΠΎΠ².

ГЛАВА 2. ΠœΠΠ’Π•Π Π˜ΠΠ›Π« И ΠœΠ•Π’ΠžΠ”Π«.

2.1 Π Π΅Π°ΠΊΡ‚ΠΈΠ²Ρ‹.

Π”ΠΎΠ΄Π΅Ρ†ΠΈΠ» ΡΡƒΠ»ΡŒΡ„Π°Ρ‚ натрия (ДБН) — (Fluka, ГСрмания), Π’Π²ΠΈΠ½ 20, ΠšΡƒΠΌΠ°ΡΡΠΈ R-250, гидроксид натрия, Ρ‚Π΅Ρ‚Ρ€Π°Π±ΠΎΡ€Π°Ρ‚ натрия, ΠΊΠ°Ρ€Π±ΠΎΠ½Π°Ρ‚ натрия, Ρ…Π»ΠΎΡ€ΠΈΠ΄ ΠΌΠ°Ρ€Π³Π°Π½Ρ†Π° (II), Ρ…Π»ΠΎΡ€ΠΈΠ΄ калия, Ρ…Π»ΠΎΡ€ΠΈΠ΄ ΠΊΠ°Π»ΡŒΡ†ΠΈΡ, фосфат натрия, Ρ…Π»ΠΎΡ€ΠΈΠ΄ натрия, Π³ΠΈΠ΄Ρ€ΠΎΠΊΠ°Ρ€Π±ΠΎΠ½Π°Ρ‚ натрия, (3-мСркаптоэтанол, этилСндиаминтСтрауксусная кислота (ЭДВА) (Sigma-Aldrich, UK), Π³Π»ΠΈΡ†Π΅Ρ€ΠΈΠ½ — (Serva, ГСрмания), ΠΈΠ·ΠΎΠΏΡ€ΠΎΠΏΠ°Π½ΠΎΠ» (Ос.Ρ‡., «Π­ΠΊΠΎΡ-1», Россия), ΠΏΠΈΡ‚Π°Ρ‚Π΅Π»ΡŒΠ½Ρ‹Π΅ срСды (Difco, БША). Π₯ΠΈΡ‚ΠΈΠ½ΠΎΠ²Ρ‹Π΅ Π³Ρ€Π°Π½ΡƒΠ»Ρ‹ для Π°Ρ„Ρ„ΠΈΠ½Π½ΠΎΠΉ Ρ…Ρ€ΠΎΠΌΠ°Ρ‚ΠΎΠ³Ρ€Π°Ρ„ΠΈΠΈ Π³ΠΈΠ±Ρ€ΠΈΠ΄Π½Ρ‹Ρ… Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ² с Ρ…ΠΈΡ‚ΠΈΠ½-ΡΠ²ΡΠ·Ρ‹Π²Π°ΡŽΡ‰ΠΈΠΌ Π΄ΠΎΠΌΠ΅Π½ΠΎΠΌ (New England Biolabs, БША).

2.2. Π€Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Ρ‹ ΠΈ ΠΊΠΎΠΌΠΌΠ΅Ρ€Ρ‡Π΅ΡΠΊΠΈΠ΅ Π½Π°Π±ΠΎΡ€Ρ‹.

Π­Π½Π΄ΠΎΠ½ΡƒΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ‹ рСстрикции, Taq-ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅Ρ€Π°Π·Π°, Pfu-Π”ΠΠš-ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅Ρ€Π°Π·Π° (MBI Fermentas, Π’ΠΈΠ»ΡŒΠ½ΡŽΡ, ЛитваБибэнзим, Новосибирск, Россия), Π’4Π”ΠΠš Π»ΠΈΠ³Π°Π·Π° (Roche Diagnostics, East Sussex, Англия). Набор для выдСлСния ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Π½ΠΎΠΉ Π”ΠΠš QIAprep Miniprep Kit (Qiagen, West Sussex, Англия). Набор для выдСлСния Ρ„Ρ€Π°Π³ΠΌΠ΅Π½Ρ‚ΠΎΠ² Π”ΠΠš ΠΈΠ· Π°Π³Π°Ρ€ΠΎΠ·Π½ΠΎΠ³ΠΎ гСля QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, West Sussex, Англия).

2.3. Π‘Π°ΠΊΡ‚Π΅Ρ€ΠΈΠ°Π»ΡŒΠ½Ρ‹Π΅ ΡˆΡ‚Π°ΠΌΠΌΡ‹.

Π Π°Π·Π»ΠΈΡ‡Π½Ρ‹Π΅ ΡˆΡ‚Π°ΠΌΠΌΡ‹ псСвдомонад Π½Π°Ρ…ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈΡΡŒ Π² ΠΊΠΎΠ»Π»Π΅ΠΊΡ†ΠΈΠΈ Π¦Π΅Π½Ρ‚Ρ€Π° «Π‘иоинТСнСрия» РАН. Π¨Ρ‚Π°ΠΌΠΌ Brevundimonas diminuta Π’ΠšΠœ Π’-1297 Π±Ρ‹Π» ΠΏΠΎΠ»ΡƒΡ‡Π΅Π½ ΠΈΠ· Π’сСроссийской ΠΊΠΎΠ»Π»Π΅ΠΊΡ†ΠΈΠΈ ΠΌΠΈΠΊΡ€ΠΎΠΎΡ€Π³Π°Π½ΠΈΠ·ΠΌΠΎΠ².

Для конструирования Ρ€Π΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½Ρ‚Π½Ρ‹Ρ… ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄ использовали ΡˆΡ‚Π°ΠΌΠΌ Escherichia coli XLl-Blue recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relAl lac [FyproAB lacPZAM15 TnlO (Tet1)] (Stratagene, БША). Π­ΠΊΡΠΏΡ€Π΅ΡΡΠΈΡŽ Π²Π°Ρ€ΠΈΠ°Π½Ρ‚ΠΎΠ² 017АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ осущСствляли Π² ΡˆΡ‚Π°ΠΌΠΌΠ΅ E. coli BL21 (DE3) [F-, ompT, hsdSB (Π³Π²-, Ρ‚Π²-), dcm, gal, dcm (DE3)] (Novagen, БША), ΠΊΠΎΡ‚ΠΎΡ€Ρ‹ΠΉ синтСзируСт РНК-ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅Ρ€Π°Π·Ρƒ Ρ„Π°Π³Π° Π’7, Π° Ρ‚Π°ΠΊΠΆΠ΅ ΠΎΠ±Π»Π°Π΄Π°Π΅Ρ‚ сниТСнной ΠΏΡ€ΠΎΡ‚Π΅Π°Π·Π½ΠΎΠΉ Π°ΠΊΡ‚ΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡ‚ΡŒΡŽ, Ρ‡Ρ‚ΠΎ способствуСт ΠΏΠΎΠ²Ρ‹ΡˆΠ΅Π½ΠΈΡŽ Π²Ρ‹Ρ…ΠΎΠ΄Π° Ρ†Π΅Π»Π΅Π²Ρ‹Ρ… Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ².

2.4. Π‘Π°ΠΊΡ‚Π΅Ρ€ΠΈΠ°Π»ΡŒΠ½Ρ‹Π΅ срСды.

Для выращивания E. coli использовали срСду LB (Luria-Bertani): 0.5% Π΄Ρ€ΠΎΠΆΠΆΠ΅Π²ΠΎΠ³ΠΎ экстракта, 1% Π±Π°ΠΊΡ‚ΠΎ-Ρ‚Ρ€ΠΈΠΏΡ‚ΠΎΠ½Π°, 1% NaCl, рН 7,5. Для получСния Ρ‚Π²Π΅Ρ€Π΄Ρ‹Ρ… срСд ΠΏΡ€ΠΈ ΠΏΡ€ΠΈΠ³ΠΎΡ‚ΠΎΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΠΈ Ρ‡Π°ΡˆΠ΅ΠΊ ΠŸΠ΅Ρ‚Ρ€ΠΈ Π² ΡΠΎΠΎΡ‚Π²Π΅Ρ‚ΡΡ‚Π²ΡƒΡŽΡ‰ΡƒΡŽ ΠΆΠΈΠ΄ΠΊΡƒΡŽ срСду добавляли Π°Π³Π°Ρ€ Π΄ΠΎ ΠΊΠΎΠ½Ρ†Π΅Π½Ρ‚Ρ€Π°Ρ†ΠΈΠΈ 1.5%.

Для выращивания ΡˆΡ‚Π°ΠΌΠΌΠΎΠ² E. coli BL21(DE3) — ΠΏΡ€ΠΎΠ΄ΡƒΡ†Π΅Π½Ρ‚ΠΎΠ² ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ† вПАБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π· использовали срСду Overnight Express Π’Π’ medium (Novagen, БША).

Антибиотики: Π°ΠΌΠΏΠΈΡ†ΠΈΠ»Π»ΠΈΠ½, ΠΊΠ°Π½Π°ΠΌΠΈΡ†ΠΈΠ½.

ΠœΠ΅Ρ‚ΠΎΠ΄Ρ‹.

2.5. Π”ΠΠš манипуляции ΠΈ ΠΊΠΎΠΌΠΏΡŒΡŽΡ‚Π΅Ρ€Π½Ρ‹Π΅ ΠΏΡ€ΠΎΠ³Ρ€Π°ΠΌΠΌΡ‹.

ΠžΠΏΡ€Π΅Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ Π½ΡƒΠΊΠ»Π΅ΠΎΡ‚ΠΈΠ΄Π½Ρ‹Ρ… ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Ρ‚Π΅Π»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚Π΅ΠΉ ПЦР-Ρ„Ρ€Π°Π³ΠΌΠ΅Π½Ρ‚ΠΎΠ² ΠΈ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄ ΠΏΡ€ΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ ΠΏΡƒΡ‚Π΅ΠΌ автоматичСского сСквСнирования Π½Π° ΠΏΡ€ΠΈΠ±ΠΎΡ€Π΅ ABIPrizm 3100 DNA Sequencer с ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡŒΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π½Π°Π±ΠΎΡ€Π° Applera «fluorescent Big dye Cycle sequencing kit». НуклСотидныС ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Ρ‚Π΅Π»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚ΠΈ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ·ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ с ΠΏΠΎΠΌΠΎΡ‰ΡŒΡŽ ΠΏΠ°ΠΊΠ΅Ρ‚Π° ΠΏΡ€ΠΎΠ³Ρ€Π°ΠΌΠΌ Vector NTI8 (Informax Inc., БША).

2.6. Π’ΠΈΡ€Ρ‚ΡƒΠ°Π»ΡŒΠ½ΠΎΠ΅ Π°Π»Π°Π½ΠΈΠ½ΠΎΠ²ΠΎΠ΅ сканированиС.

Π‘ Ρ†Π΅Π»ΡŒΡŽ опрСдСлСния аминокислотных остатков, ΠΎΠ±Ρ€Π°Π·ΡƒΡŽΡ‰ΠΈΡ… ΠΎΠ±Π»Π°ΡΡ‚ΡŒ ΠΊΠΎΠ½Ρ‚Π°ΠΊΡ‚Π° ΠΌΠ΅ΠΆΠ΄Ρƒ ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ†Π°ΠΌΠΈ Π² Π΄ΠΈΠΌΠ΅Ρ€Π΅ ΠΈ Ρ‚Π΅Ρ‚Ρ€Π°ΠΌΠ΅Ρ€Π΅ вПАБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π· ΠΈ Π²Ρ‹ΡΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΡ срСди Π½ΠΈΡ… Π·Π½Π°Ρ‡ΠΈΠΌΡ‹Ρ…, Π±Ρ‹Π» Π²Ρ‹ΠΏΠΎΠ»Π½Π΅Π½ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ· Π·ΠΎΠ½Ρ‹ ΠΊΠΎΠ½Ρ‚Π°ΠΊΡ‚Π° ΠΌΠ΅ΠΆΠ΄Ρƒ ΠΌΠΎΠ½ΠΎΠΌΠ΅Ρ€Π°ΠΌΠΈ с ΠΏΠΎΠΌΠΎΡ‰ΡŒΡŽ Π²ΠΈΡ€Ρ‚ΡƒΠ°Π»ΡŒΠ½ΠΎΠ³ΠΎ Π°Π»Π°Π½ΠΈΠ½ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ сканирования Π½Π° ΡΠ΅Ρ€Π²Π΅Ρ€Π΅ Robetta Oittp://robetta.bakerlab.org). Для этого ΠΊΠ°ΠΆΠ΄Ρ‹ΠΉ аминокислотный остаток ΠΏΠΎΠΎΡ‡Π΅Ρ€Π΅Π΄Π½ΠΎ замСняли Π½Π° Π°Π»Π°Π½ΠΈΠ½ ΠΈ ΠΎΡ†Π΅Π½ΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΈΠ·ΠΌΠ΅Π½Π΅Π½ΠΈΠ΅ энСргии взаимодСйствия ΠΌΠ΅ΠΆΠ΄Ρƒ ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ†Π°ΠΌΠΈ Π² Ρ€Π΅Π·ΡƒΠ»ΡŒΡ‚Π°Ρ‚Π΅ Π·Π°ΠΌΠ΅Π½Ρ‹ ΠΏΠΎ ΡƒΡ€Π°Π²Π½Π΅Π½ΠΈΡŽ, ΠΏΡ€ΠΈΠ²Π΅Π΄Π΅Π½Π½ΠΎΠΌΡƒ Π² ΠΎΠ±Ρ‰Π΅ΠΌ Π²ΠΈΠ΄Π΅ [Kortemme et al., 2004Π°]:

AG А/Π’ = (GA/Π’ — Ga — ΠžΠ” — (G'A/B «G'A «G'B), Π³Π΄Π΅: AGa/B ~ ΠΈΠ·ΠΌΠ΅Π½Π΅Π½ΠΈΠ΅ энСргии связывания ΠΌΠ΅ΠΆΠ΄Ρƒ ΠΏΠ°Ρ€Ρ‚Π½Π΅Ρ€Π°ΠΌΠΈ Π±Π΅Π»ΠΎΠΊ-Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ взаимодСйствия Π΄ΠΎ ΠΈ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅ Π·Π°ΠΌΠ΅Π½Ρ‹GΠ°/Π’ — свободная энСргия комплСкса Π΄ΠΈΠΊΠΎΠ³ΠΎ Ρ‚ΠΈΠΏΠ°Ga — свободная энСргия Π±Π΅Π»ΠΊΠ°-ΠΏΠ°Ρ€Ρ‚Π½Π΅Ρ€Π°, А Π΄ΠΈΠΊΠΎΠ³ΠΎ Ρ‚ΠΈΠΏΠ°Gg — свободная энСргия Π±Π΅Π»ΠΊΠ°-ΠΏΠ°Ρ€Ρ‚Π½Π΅Ρ€Π° Π’ Π΄ΠΈΠΊΠΎΠ³ΠΎ Ρ‚ΠΈΠΏΠ°G’a/B ~ свободная.

52 энСргия комплСкса ΠΌΡƒΡ‚Π°Π½Ρ‚Π½ΠΎΠ³ΠΎ Ρ‚ΠΈΠΏΠ°Π‘’Π΄ — свободная энСргия Π±Π΅Π»ΠΊΠ°-ΠΏΠ°Ρ€Ρ‚Π½Π΅Ρ€Π°, А ΠΌΡƒΡ‚Π°Π½Ρ‚Π½ΠΎΠ³ΠΎ Ρ‚ΠΈΠΏΠ°G’g — свободная энСргия Π±Π΅Π»ΠΊΠ°-ΠΏΠ°Ρ€Ρ‚Π½Π΅Ρ€Π° Π’ ΠΌΡƒΡ‚Π°Π½Ρ‚Π½ΠΎΠ³ΠΎ Ρ‚ΠΈΠΏΠ°.

ΠŸΡ€ΠΎΠ³Ρ€Π°ΠΌΠΌΠ°, ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡŒΠ·ΡƒΠ΅ΠΌΠ°Ρ для Π²ΠΈΠ·ΡƒΠ°Π»ΠΈΠ·Π°Ρ†ΠΈΠΈ Ρ€Π΅Π·ΡƒΠ»ΡŒΡ‚Π°Ρ‚ΠΎΠ² сканирования ΠΈ ΡΡ‚Ρ€ΡƒΠΊΡ‚ΡƒΡ€Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ·Π° — ViewerLite v.5.0.

2.7. Π Π΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½Ρ‚Π½Ρ‹Π΅ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ‹.

Для экспрСссии 017АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ ΠΈ Π΅Π΅ Ρ€Π°Π·Π»ΠΈΡ‡Π½Ρ‹Ρ… Π°Π½Π°Π»ΠΎΠ³ΠΎΠ² использовали ΡΠΊΠΎΠ½ΡΡ‚Ρ€ΡƒΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½Π½ΡƒΡŽ Π½Π°ΠΌΠΈ Ρ€Π°Π½Π΅Π΅ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρƒ рАБВ7 [Π­Π»ΡŒΠ΄Π°Ρ€ΠΎΠ² с ΡΠΎΠ°Π²Ρ‚., Π½Π΅ΠΎΠΏΡƒΠ±Π».] ΠΈ Π²Π΅ΠΊΡ‚ΠΎΡ€ Ρ€Π•Π’28Π‘ (Novagen, БША). Π’ ΠΊΠ°Ρ‡Π΅ΡΡ‚Π²Π΅ источника Ρ…ΠΈΡ‚ΠΈΠ½-ΡΠ²ΡΠ·Ρ‹Π²Π°ΡŽΡ‰Π΅Π³ΠΎ Π΄ΠΎΠΌΠ΅Π½Π° использовали ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρƒ pTYB4 (New England Biolabs, БША).

Π’ Ρ…ΠΎΠ΄Π΅ Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚Ρ‹ Π±Ρ‹Π»ΠΈ ΠΏΠΎΠ»ΡƒΡ‡Π΅Π½Ρ‹ ΡΠ»Π΅Π΄ΡƒΡŽΡ‰ΠΈΠ΅ конструкции для экспрСссии Π²Π°Ρ€ΠΈΠ°Π½Ρ‚ΠΎΠ² Π˜Π›ΠΠ‘Π-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ ΠΈ ΠΎΡ‚Π΄Π΅Π»ΡŒΠ½Ρ‹Ρ… ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ† Ρ„Π΅Ρ€ΠΌΠ΅Π½Ρ‚Π°:

1. pSVH0106 — Π²Π΅ΠΊΡ‚ΠΎΡ€ экспрСссии «ΠΏΠΎΠ»Π½ΠΎΡ€Π°Π·ΠΌΠ΅Ρ€Π½ΠΎΠΉ» BrdGlA.

2. pSVH1811 — Π²Π΅ΠΊΡ‚ΠΎΡ€ экспрСссии Π²Π°Ρ€ΠΈΠ°Π½Ρ‚Π° BrdGlA Π±Π΅Π· ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Ρ‚Π΅Π»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚ΠΈ сигнального ΠΏΠ΅ΠΏΡ‚ΠΈΠ΄Π°.

3. pSVH1811/H — Π²Π΅ΠΊΡ‚ΠΎΡ€ экспрСссии BrdGlA с Π³Π΅ΠΊΡΠ°Π³ΠΈΡΡ‚ΠΈΠ΄ΠΈΠ½ΠΎΠ²ΠΎΠΉ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Ρ‚Π΅Π»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚ΡŒΡŽ, присоСдинСнной ΠΊ Π‘ ΠΊΠΎΠ½Ρ†Ρƒ Π -ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ†Ρ‹ (BrdGlA/H).

4. pSVH0107 — Π²Π΅ΠΊΡ‚ΠΎΡ€ экспрСссии, Π½Π°ΠΏΡ€Π°Π²Π»ΡΡŽΡ‰ΠΈΠΉ Π² ΠΊΠ»Π΅Ρ‚ΠΊΠ°Ρ… E. coli синтСз BrdGlA с Ρ…ΠΈΡ‚ΠΈΠ½-ΡΠ²ΡΠ·Ρ‹Π²Π°ΡŽΡ‰ΠΈΠΌ Π΄ΠΎΠΌΠ΅Π½ΠΎΠΌ присоСдинСнным ΠΊ Π‘-ΠΊΠΎΠ½Ρ†Ρƒ Π°-ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ†Ρ‹ (BrdGLA/ChBD).

5. pSVH0108 — Π²Π΅ΠΊΡ‚ΠΎΡ€ экспрСссии Π½Π°ΠΏΡ€Π°Π²Π»ΡΡŽΡ‰ΠΈΠΉ Π² ΠΊΠ»Π΅Ρ‚ΠΊΠ°Ρ… E. coli синтСз BrdGlA с ΠΏΡ€ΠΈΡΠΎΠ΅Π΄ΠΈΠ½Π΅Π½Π½Ρ‹ΠΌ N-ΠΊΠΎΠ½Ρ†Π΅Π²Ρ‹ΠΌ ΠΌΠΎΠ΄ΠΈΡ„ΠΈΡ†ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½Π½Ρ‹ΠΌ Ρ…ΠΈΡ‚ΠΈΠ½-ΡΠ²ΡΠ·Ρ‹Π²Π°ΡŽΡ‰ΠΈΠΌ Π΄ΠΎΠΌΠ΅Π½ΠΎΠΌ (BrdGlA/NmChBD).

6. pSVHCm — рСкомбинантная ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Π° с ΠΏΡ€ΠΈΡΠΎΠ΅Π΄ΠΈΠ½Π΅Π½Π½Ρ‹ΠΌ ΠΌΡƒΡ‚Π°Π½Ρ‚Π½Ρ‹ΠΌ Ρ…ΠΈΡ‚ΠΈΠ½-ΡΠ²ΡΠ·Ρ‹Π²Π°ΡŽΡ‰ΠΈΠΌ Π΄ΠΎΠΌΠ΅Π½ΠΎΠΌ ΠΊ Π‘-ΠΊΠΎΠ½Ρ†Ρƒ Π°-ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ†Ρ‹ (BrdGlA/CmChBD).

7. pMTVl — Π²Π΅ΠΊΡ‚ΠΎΡ€ экспрСссии Π°-ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ†Ρ‹ с N-ΠΊΠΎΠ½Ρ†Π΅Π²Ρ‹ΠΌ ChBD (ChBDa).

8. Ρ€ΠœΠ’Π£Π— — Π²Π΅ΠΊΡ‚ΠΎΡ€ экспрСссии Ρ€Π΅ΠΊΠΎΠΌΠ±ΠΈΠ½Π°Π½Ρ‚Π½ΠΎΠΉ BrdGlA с Π΄Π΅ΠΊΠ°ΠΏiстидиновой ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Ρ‚Π΅Π»ΡŒΠ½ΠΎΡΡ‚ΡŒΡŽ HaN-ΠΊΠΎΠΈΡ†Π΅ Ρ€-ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ†Ρ‹ (G1A10H).

2. 8. БинтСтичСскиС ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡƒΠΊΠ»Π΅ΠΎΡ‚ΠΈΠ΄Ρ‹.

ΠŸΡ€ΠΈ конструировании Π²Π΅ΠΊΡ‚ΠΎΡ€ΠΎΠ² экспрСссии ΠΈΠ·ΠΎΠ»ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½Π½Ρ‹Ρ… Π°ΠΈ (3-ΡΡƒΠ±ΡŠΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡ† 017АБА-Π°Ρ†ΠΈΠ»Π°Π·Ρ‹ использовали синтСтичСскиС ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡƒΠΊΠ»Π΅ΠΎΡ‚ΠΈΠ΄Ρ‹, структура ΠΈ Π½ΠΎΠΌΠ΅Π½ΠΊΠ»Π°Ρ‚ΡƒΡ€Π° ΠΊΠΎΡ‚ΠΎΡ€Ρ‹Ρ… ΠΏΡ€ΠΈΠ²Π΅Π΄Π΅Π½Ρ‹ Π² Ρ‚Π°Π±Π»ΠΈΡ†Π΅ 2.

ΠŸΠΎΠΊΠ°Π·Π°Ρ‚ΡŒ вСсь тСкст

Бписок Π»ΠΈΡ‚Π΅Ρ€Π°Ρ‚ΡƒΡ€Ρ‹

  1. Arroyo, M., Acebal, C., & Castillon, M.P. 2003. Biotechnological applications of penicillin acylases: state-of-the-art. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:507−514.
  2. Aramori, I., Fukagawa, M., Tsumura, M., Iwami, M., Yokota, Y., Kojo, H., Kohsaka, M., Udea, Y., and Imenaka, H. 1991a. Isolation of soil strains producing new cephalosporin acylases. J. Ferment. Bioeng. 72:227−231.
  3. Aramori, I., Fukagawa, M., Tsumura, M., Iwami, M., Ono, H., Ishtani, Y., Hiroshi, K., Kojo, H., Kohsaka, M., Udea, Y., and Imenaka, H. 1992. Comparative characterization of new glutaryl-7-АБА acylase. J. Ferment. Bioeng. 73:185−192.
  4. Alonso-Morales, N. A., Lopez-Gallego, F., Betancor, L., Hidalgo, A., Mateo, C., Fernandez-Lafuente, R., and Guisn, J. M. 2004. Reversible immobilization ofglutaryl acylase on SEPABEADS coated with polyethylenimine. Biotechnol. Progr. 20: 533−536.
  5. Alam, M. M., N. Nikaidou, H. Tanaka, and T. Watanabe. 1995. Cloning and sequencing of chiC gene of Bacillus circulans WL-12 and relationship of its product to some other chitinases and chitinase-like proteins. J. Ferment. Bio eng. 80:454−461.
  6. Abraham, E. P., and Loader, P. B. 1972. Cephalosporin C, In: Cephalosporins: Chemistry and Biology, pp. 2−26, E. H. Flynn, ed., Academic Press, New York.
  7. Abraham, E. P., and Newton, G. G.F. 1961. The structure of cephalosporin C. Biochem. J. 79: 377−393.
  8. Barber, M.S., Giesecke, U., Reichert, A., & Minas, W. 2004. Industrial enzymatic production of cephalosporin-based beta-lactams. Adv. Biochem. Eng Biotechnol. 88:179−215.
  9. Barends, T. R., Yoshida, H., and Dijkstra, B. W. 2004. Three-dimensional structures of enzymes useful for beta-lactam antibiotic production. Curr.Opin.Biotechnol. 15: 356−363.
  10. Brannigan JA, Dodson G, Duggleby HJ, Moody PC, Smith JL, Tomchick DR, Murzin AG. A 1995: protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation. Erratum in: Nature. 378:(6557):644−638.
  11. Binder, R. G., Numata, K., Lowe, D. A., Murakami, Π’., and Brown, J. L.1993. Isolation and characterization of a Pseudomonas strain producing glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase. Appl. Environ.Microbiol. 59:3321—3326.
  12. M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal.Biochem. 72:248−254.
  13. Battistel, E., Bianchi, D., Bortolo, R., & Bonoldi, L. 1998. Purification and stability of glutaryl-7-АБА acylase from Pseudomonas sp. Appl. Biochem. Biotechnol. 69:53−67.
  14. Bruggink, A., Roos, E.C. & deVroom, E. 1998. Penicillin acylase in the industrial production of beta-lactam antibiotics. Organic Process Res. Dev. 2:128−133.
  15. Balasingham, K., Warburton, D., Dunnill, P., & Lilly, M.D. 1972. The isolation and kinetics of penicillin amidase from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta 276:250−256 .
  16. Choi, K. S., J. A. Kim, and H. S. Kang. 1992. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11 105. J. Bacteriol. 174:6270−6276.
  17. Chilov G. G, Stroganov O. V, Svedas VK. 2008. Molecular modeling studies of subbstrat binding by penicillin acylase. Biochemistry (Mosc) 3(l):56−64.
  18. Deshpande, B.S., Ambedkar, S.S., Sudhakaran, V.K. & Shewale, J.G. 1994 Molecular biology of p-lactam acylases. World J. Microbiol. Biotechnol. 10:129 138.
  19. Deshpande, B. S., Ambedkar, S. S., and Shewale, J. G. 1996. Cephalosporin Π‘ and penicillin V acylase formation by Aeromonas sp. ACY 95. World J. Microbiol. Biotechnol. 12:373−378.
  20. Diez, Π’., E. Mellado, R. Fouces, M. Rodriguez, and J.I.Barredo. 1996. Recombinant Acremonium clirysogenum strain for the industrial production of cephalosporin. Microbiologia. 12:359−370.
  21. Duggleby H. J, Tolley S. P, Hill C. P, Dodson E. J, Dodson G, Moody P.C. 1995 Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre. Nature. 19:373(6511):264−8.
  22. Del Rio G, Rodriguez ME, Munguia ME, Lopez-Mungui A, Soberon X. Mutant 1995. Escherichia coli penicillin acylase with enhanced stability at alkaline pH. BiotechnolBioeng. 20:48(2): 141−8.
  23. F., Argos P. 1996.Hydrophobic regions on protein surfaces: definition based on hydration shell structure and a quick method for their computation Protein Eng. 9: 1121−1133.
  24. Friehs, K. & Reardon, K.F. 1993. Parameters influencing the productivity of recombinant E. coli cultivations. Adv. Biochem. Eng Biotechnol. 48:53−77
  25. Fersht A.R., and L.Serrano. 1993 Principals of protein stability derived from protein experiments.Curr.Opin.Struct.Biol. 3:75−83.
  26. Franzosi, G., Battistel, E., Gagliardi, I., and Van der Goes, W. 1995. Screening and characterization of microorganisms with glutaryl-7-ADCA acylase activity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43:508−513.
  27. S.J., Argos P. 1994. Cavities and packing at protein interfaces. Protein Sci. 3:№ 12. 2194−2206.
  28. Huabao Zheng, Jun Chena, Liuli Sua, Yuhua Zhaob, Yunliu Yang, HongYu Zenge, Gang Xue, Sheng Yang, Weihong Jiang. 2007. One-step purification and immobilization of his-tagged GL-7-ACA acylase. Enzyme and Microbial Technology. 41:474−479.
  29. , M. & Niwa, M. 1992. Nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of the cephalosporin acylase gene of a Pseudomonas strain. Biochim. Biophys. Acta. 1132:233−239
  30. J. 1999. Wet and dry interfaces: the role of solvent in protein-protein and protein-DNA recognition. Structure. 7: 277−279.106
  31. Jones S. and Thornton J.M. 1996. Principles of protein-protein interaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:13−20.
  32. Jin Kwang Kim, In Seok Yang, Sangkee Rhee, Zbigniev Dauter, Young Sik Lee, Sung Soo Park and Kyung Hyun Kim. 2003 Crystal Structures of Glutaryl 7-Aminocephalosporanic Acid Acylase: Insight into Autoproteolytic Activation. Biochemistry. 42:4084−4093.
  33. Guo, H. C., Xu, Q., Buckley, D., and Guan, C. 1998. Crystal structures of Flavobacterium glycosylasparaginase. An N-terminal nucleophile hydrolase activated by intramolecular proteolysis J. Biol.Chem. 273:20 205−20 212.
  34. Kim, D.W., Kang, S.M. and Yoon, K.H. 1999. Isolation of New Pseudomonas diminuta KAC-1 Strain Producing Glutaryl 7-Aminocephalosporanic Acid Acylase.J. Microbiol. 37: 200−205.
  35. Kumar, K.K., Sudhakaran, V., Deshpande, B.S., Ambedkar, S.S., & Shewale, J.G. 1993. Cephalosporin acylases: enzyme production, structure and application in the production of 7-ACA. Hindustan Antibiot. Bull. 35:111−125.
  36. AM. 2001 Improving enzymes by using them in organic solvents .Nature.409 (6817):241−6.
  37. Kim, S. and Kim, Y. 2001. Active site residues of cephalosporin acylase are critical not only for enzymatic catalysis but also for post-translational modification. J.Biol.Chem. 276:48 376−48 381.
  38. Khang, Y. H., and Yoo, Π’. H. 2000. Isolation and characterization of a novel soil strain, Pseudomonas cepacia BY21, with glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase activity. Biotech. Lett. 22:317−320.
  39. Kim, Y., Kim, S., Earnest, T. N., and Hoi, W. G. 2002. Precursor structure of cephalosporin acylase. Insights into autoproteolytic activation in a new N-terminal hydrolase family. J.Biol.Chem. 277:2823−2829.
  40. Kim D.E., Chivian D. and Baker D. 2004. Protein structure prediction and analysis using the Robetta server. Nucleic Acids Research. 32: 526−531.
  41. Kortemme T. and Baker D. 2002. A simple physical model for binding energy hot spots in protein protein complexes .PNAS. 99: 14 117 14 121.
  42. Kortemme T. and Baker D. 2004a. Computational design of protein protein interactions Current Opinion in Chemical Biology. 8: 91 97.
  43. Kortemme Π’., Kim D.E., Baker D. 2004b. Computational alanine scanning of protein protein interfaces.^/. STKE. 2004b. 219: 2−12.
  44. Keskin О., Ma B. and Nussinov R. 2005. Hot regions in protein-protein interactions: the organization and contribution of structurally conserved hot spot residues J. Mol. Biol. 345: 1281−1294.
  45. Youngsoo Kim, Wim GJ. Hoi. 2001. Structure of cephalosporin acylase in complex with glutaryl-7-aminocephalosporanic acid and glutarate: insight into the basis of its substrate specificity. Chemistry & Biology.8:1253−1264.
  46. Lee, Y. S., Kim, H. W., and Park, S. S. 2000a. The role of alpha-amino group of the N-terminal serine of beta subunit for enzyme catalysis and autoproteolytic activation of glutaryl 7- aminocephalosporanic acid acylase. J.Biol.Chem. 275:39 200−39 206.
  47. Luo Hui, Yu Huimin, Li Qiang, Shen Zhongyao. Rapid Cloning and Expression of Glutaryl-7-Aminocephalosporanic Acid Acylase Genes from Soil Samples. 2005. Tsinghua Science and Technology. 10:529−534.
  48. Ledent P, Duez C, Vanhove M, Lejeune A, Fonze E, Charlier, et al. 1997. Unexpected influence of a C-terminal-fused his-tag on the processing of an enzyme and on the kinetic and folding parameters. FEBS Letters. 413:194−196.
  49. T.A., Olson A.J., Goodsell D.S. 1998. Morphology of protein-protein interfaces. Structure. 6: 421−427.
  50. Li, Y., Chen, J., Jiang, W., Мао, X., Zhao, G., and Wang, E. 1999. In vivo post-translational processing and subunit reconstitution of cephalosporin acylase from Pseudomonas sp. 130. Eur.J.Biochem. 262:713−719.
  51. M.C., Colman P.M. 1993. Shape complementarity at protein/protein interfaces .J. Mol. Biol. 234:№ 4 946 950.
  52. Lopez Garcia et all. Process for modifying the enzyme 7 beta-(4-carboxybutanamido) cephalosporinacylase and purifying said enzyme in single chromatographic step. European patent EP0839914,1997−10−30.
  53. , A. & Komatsu, K.I. 1985. Molecular cloning and structure of the gene for 7 beta-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid acylase from a Pseudomonas strain. J. Bacteriol. 163:1222−1228.
  54. Matsuda, A., Matsumaya, K., Yamamoto, K., Ichikawa, S., and Komatsu, K. 1987a. Cloning and characterization of the genes for two distinct cephalosporin acylases froma Pseudomonas strain. J. Bacteriol. 169:5815−5820.
  55. Matsuda, A., Toma, K., and Komatsu, K. 1987b. Nucleotide sequence of the genes for two distinct cephalosporin Π‘ acylases from a Pseudomonas strain. J. Bacteriol. 169:5821−5826.
  56. McDonough, M.A., Klei, Y.E., and Kelly, J.A.I999. Crystal structer of penicillinG acylase from Brol mutant strain of Providencia rcXgXgcxi.Prot.Sci. 8:1971−1981.
  57. Matthews BW, Nicholson H, Becktel WJ. 1987 Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding. Proc Natl AcadSci USA. 84(19):6663−7.
  58. McCoy A J., Chandana Π•Ρ€Π° V., Colman P.M. 1997. Electrostatic complementarity at protein/protein interfaces .J. Mol. Biol. 268: 570−584.
  59. I., Schweins Π’., Warshel A. 1998. Electrostatic contributions to protein-protein binding affinities: application to Rap/Raf interaction.Protein. 30: 407−423.
  60. Nobbs, T. J., Ishii, Y., Fujimora, Π’., Saito Y., and Niwa, M. 1994. Chemical modification and site directed mutagenesis of tyrosine residue in cephalosporin Π‘ acylase from Pseudomonas strain N 176. J. Ferment. Bio eng. 77:604—609.
  61. Oh, Π’., Kim, K, Park, J., Yoon, J., Han, D., and Kim, Y. 2004. Modifying the substrate specificity of penicillin G acylase to cephalosporin acylase by mutating active-site residues. Biochem.Biophys.Res.Comrmm. 319:486−492.
  62. Otten, L. G., Sio, C. F., Vrielink, J., Cool, R. H., and Quax, W. J. 2002. Altering the substrate specificity of cephalosporin acylase by directed evolution of the Beta -subunit. J.Biol.Chem. 277:42 121−42 127.
  63. Otten, L. G., Sio, C. F., van der Sloot, A. M., Cool, R. H., and Quax, W. J. 2004. Mutational analysis of a key residue in the substrate specificity of a cephalosporin acylase. Chembiochem. 5:820−825.
  64. Oinonen C, Tikkanen R, Rouvinen J, Peltonen L. 1995. Three-dimensional structure of lysosomal aspartylglucosaminidase. Nat Struct Biol. 12:1102−8.
  65. Parmar, A., Kumar, H., Marwaha, S.S., & Kennedy, J.F. Recent Trends in Enzymatic 1998. Conversion of Cephalosporin Π‘ to 7-Aminocephalosporanic Acid (7-ACA). Critical Reviews in Biotechnology. 18:1−12.
  66. Politino, M., Tonzi, S. M., Burnett, W. V., Romancik, G., and Usher, J. J. 1997. Purification and characterization of a cephalosporin esterase from Rhodosporidium toruloides. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63:4807−4811.
  67. Park Seung Won, Jeewon Lee, Suk In Hong, Seung Wook Kim. 2003a. Enhancement of stability of GL-7-ACA acylase immobilized on silica gel modified by epoxide silanization. Process Biochemistiy.39:359−366.
  68. Park, S. W., Lee, J. W., Hong, S. I., and Kim, S. W. 2003b. Immobilization of glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase on silica gel and enhancement of its stability. Appl. Biochem. Biotechnol. 104: 185—198.
  69. Park Seung Won, Sang Yong Choi, Koo Hun Chungb, Suk In Honga, Seung Wook Kima. 2002a. Characteristics of GL-7-ACA acylase immobilized on silica gel through silanization. Biochemical Engineering Journal. 11:87−93.
  70. Park, S. W., Kim Y. I., Chung, К. H., Hong, S. K., and Kim, S. W. 2002b. Covalent immobilization of GL-7-ACA acylase on silica gel through silanization. Reactive and Functional Polymers 51: 79−92.
  71. Querol E, Perez-Pons JA, Mozo-Villarias A. 1996. Analysis of protein conformational characteristics related to thermostability. Protein Eng. 9(3):265−71.
  72. Reyes, F., Martinez, M.J. & Soliveri, J. 1989. Determination of cephalosporin-C amidohydrolase activity with fluorescamine^/. Pharm. Pharmacol. 41:136−137.
  73. Russell AJ, Fersht AR. 1987. Rational modification of enzyme catalysis by engineering surface charge.Nature. 328(6130):496−500.
  74. , G. W. 1975. p-Lactamases. In: Methods Enzymol. 43: 678−687.
  75. Richmond, M. H., and Sykes, R. B. 1973. The P-lactamases of gramnegative bacteria and their possible physiological role. Adv. Microbial. Physiol.9: 31−88.
  76. Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., & Dubendorff, J.W. 1990. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185:60−89.
  77. , F., 2005. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 4: 207—234.
  78. Saarela J, Laine M, Tikkanen R, Oinonen C, Jalanko A, Rouvinen J, Peltonen L. 1998. Activation and oligomerization of aspartylglucosaminidase.7″ Biol Chem. 25:273(39):25 320−8.
  79. Szwajcer, E., and Mosbach, K. 1985. Isolation and partial characterization of a D-amino acid oxidase active against cephalosporin Π‘ fromyeast Trigonopsis variabilis. Biotechnol. Letts. 7:1—7.
  80. Saito, Y., Ishii, Y., Fujimura, Π’., Sasaki, H., Noguchi, Y., Yamada, H., Niwa, M., and Shimomura, К. 1996. Protein engineering of a cephalosporin Π‘ acylase from Pseudomonas strain N176. Ann.N.Y.Acad.Sci. 782:226−240.
  81. Sio, C. F., Riemens, A. M., van der Laan, J. M., Verhaert, R. M., and Quax, W. J. 2002. Directed evolution of a glutaryl acylase into an adipyl acylase. Eur.J.Biochem. 269:4495−4504
  82. Charles F. Sio, Linda G. Otten, Robbert H. Cool and Wim J. Quax. 2003. Analysis of a substrate specificity switch residue of cephalosporin acylase // Biochemical and Biophysical Research Communications (BBRC). 312:755−760.
  83. Suzuki, H., Miwa, C., Ishihara, S., and Kumagai, H. 2004. A single amino acid substitution converts gamma-glutamyltranspeptidase to a class IV cephalosporin acylase (glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase). Appl.Environ.Microbiol. 70:6324−6328.
  84. F.B., Norel R., Honig B. 2000. Electrostatic aspects of protein-protein interactions. Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 153−159.
  85. W.E. 1997. Protein-Protein Interactions: Interface Structure, Binding Thermodynamics, and Mutational Analysis. Chem Rev. 97: 1233−1250.
  86. HM. 1990. Engineering proteins for purification. Trends Biotechnol., 8(4):88−93.
  87. Sambrook, J., Maniatis, Π’., & Fritsch, E.F. Molecular cloning a laboratory manual. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y- 1989.
  88. Sanggu Kim and Youngsoo Kim. 2001 Active Site Residues of Cephalosporin Acylase Are Critical Not Only for Enzymatic Catalysis but Also for Post-translational Modification. Journal of Biological Chemistry.276:48 376−48 381.
  89. Sudhakaran, V. K., Deshpande, B. S., Ambedkar, S. S., and Shewale, J. G. 1992. Molecular aspects of penicillins and cephalosporin acylases. Process. Biochem. 27:131−143.
  90. Sonawane, V. C., Jolly, R. S., and Vohra, R. M. 1996. Cephalosporin modification: An extracellular glutaryl 7-ACA acylase from Bacillus sp. Biotech. Lett. 18:965−968.
  91. Slade, A., A. J. Horrocks, C. D. Lindsay, B. Dunbar, and R. Virden. 1991. Site-directed chemical conversion of serine to cysteine in penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11 105. Eur. J. Biochem. 197:75−80.
  92. Seemiiller E, Lupas A, Stock D, Lowe J, Huber R, Baumeister W. 1995. Proteasome from Thermoplasma acidophilum: a threonine protease. Science. 268(5210):579−82.
  93. Tsai C.J., Lin S.L., Wolfson H.J., Nussinov R. 1997. Studies of protein-protein interfaces: a statistical analysis of the hydrophobic effect Protein Sci. 6: 53−64.
  94. Thorn K.S. and Bogan A.A. ASEdb: 2001. a database of alanine mutations and their effects on the free energy of binding in protein interactions.Bioinformatics. 17: 284−285.
  95. Tsai C.J., Lin S.L., Wolfson H.J., Nussinov R. 1996. Protein-protein interfaces: architectures and interactions in protein-protein interfaces and in protein cores. Their similarities and differences .Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 31: 127−152.
  96. Thomas RM Barends, Hiromi Yoshida and Bauke W Dijkstra. 2001. Three-dimensional structures of enzymes useful for p-lactam antibiotic production. Current Opinion in Biotechnology.15:356−363.
  97. Takimoto, A., Matsushima, K., Yagi, S., and Sonoyama, T. 1994. Purification and characterization and partial amino acid sequence of anovel cephalosporin Π‘ deacetylase from Bacillus subtilis. J. Ferment. Bioeng. 77:17—22.
  98. Tobias JW, Shrader Π’Π•, Rocap G, Yarshavsky A. 1991. The N-end rule in bacteria. Science. 254(5036): 1374−7.
  99. Veselovsky A.V., Ivanov Yu.D., Ivanov A.S., Archakov A.I., Lewi P. and Janssen P. 2002. Protein-protein interactions: mechanisms and modification by drugs. Journal of Molecular Recognition. 15: 405−422.
  100. Velasco J, Luis Adrio J, Angel Moreno M, Diez B, Soler G, Barredo JL. 2000. Environmentally safe production of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA) using recombinant strains of Acremonium chrysogenumJVcrt Biotechnol: 18(8):857−61.
  101. Valle, F., Balbas, P., Merino, E., & Bolivar, F. 1991. The role of penicillin amidases in nature and in industiy. Trends Biochem. Sci. 16:36−40.
  102. , J. & Flower, A. 2005. Decreased gene expression from T7 promoters may be due to impaired production of active T7 RNA polymerase. Microbial Cell Factories. 4:3.
  103. J.A. 1996. Binding in the growth hormone receptor complex.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 11−16.
  104. Wang, E.D., Zheng, Y.G., Li, Y., Jiang, W.H., & Yang, Y.L. Expression of gene encoding GL-7ACA acylase in Escherichia coli. 2002. Sheng Wu ΠΠΈ a Xue. Yu Sheng Wu WuLiXue. Bao. (Shanghai).34:526−531.
  105. Xu D., Lin S.L., Nussinov R. 1997b. Protein binding versus protein folding: the role of hydrophilic bridges in protein associations .J. Mol. Biol. 265: 68−84.
  106. Xu Q, Buckley D, Guan C, Guo HC. 1999. Structural insights into the mechanism of intramolecular proteolysis. Cell. 98(5):651−61.
  107. Xu D., Tsai C.J., Nussinov R. 1997a. Hydrogen bonds and salt bridges across protein-protein interfaces. Protein Eng. 10: 999−1012.
  108. Youngsoo Kim, Ki-Hong Yoon, Yongho Khang, Stewart Turley and Wim G. J. Hoi. 2000 The 2.0 A Crystal Structure of Cephalosporin Acylas^.Structure. 8:1059−1068.
  109. Yamada C, Kijima K, Ishihara S, Miwa C, Wada K, Okada T, Fukuyama K, Kumagai H, Suzuki H. 2008. Improvement of the glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase activity of a bacterial gamma-glutamyltranspeptidase^j^p/Environ Microbiol.!4(11):3400−9.
  110. Yamada, H., Ishii, Y., Noguchi, Y., Miura, Π’., Mori, Π’., and Saito, Y. 1996. Protein engineering of a cephalosporin Π‘ acylase. Ann.N.Y.Acad.Sci. 799:4−81.
  111. Y. Li., Yun, D. F., Guan, Y. Q., Peng, H. L., Chen, J. M., He, Y. S., and Jiao, R. C. 1991. Cloning of GL-7-ACA acylase gene from Pseudomonas, sp. 130 and its expression in Escherichia coli. Chin J.Biotechnol. 7: 93−104.
  112. Yoon, J., Oh, Π’., Kim, K., Park, J., Han, D., Kim, К. K, Cha, S. S., Lee, D., and Kim, Y. 2004. A bound water molecule is crucial in initiating autocatalytic precursor activation in an N-terminal hydrolase. J.Biol. Chem. 279:341−347.
  113. Yau Ming-Hon, Jun Wang, Paul W.K. Tsang, Wing-Ping Fong. 2006. J1 acylase, a glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase from Bacillus laterosporus Jl, is a member of the a/b-hydrolase fold superfamily. FEBS Letters. 580:1465−1471.
  114. Yong Li, Weihong Jiang, Yunliu Yang, Guoping Zhao, Enduo Wang. 1998. Overproduction and Purification of Glutaryl 7-Amino Cephalosporanic Acid Acylase // Protein Expression and Purification. 12:.233−238.
  115. Young S. Lee, Sung S. Park. 1998. Two-Step Autoeatalytie Processing of the Glutaryl 7-Aminocephalosporanic Acid Acylase from Pseudomonas sp. Strain GK16. 1998. Journal of Bacteriology. 180:4576−4582.
  116. Zhou, H., Wei, Z., Yang, Y., 1997. Studies on purification and properties of GL-7ACA acylase from CU334. Acta Microbiol. Sin. 37: 196−201.
  117. Zemla A. LGA: 2003 A method for finding 3D similarities in protein structures. Nucleic Acids Res. 31: 3370−3374.
  118. Zhang, Q. J., and Xu, W. X. 1993. Morphological physiological and enzymatic characteristics of cephalosporin acylase producing Arthrobacter strain 45-A. Arch. Microbiol. 159:392−395.
  119. Zhao H, Chockalingam K, Chen Z. 2002. Directed evolution of enzymes and pathways for industrial biocatalysis. Curr Opin Biotechnol. 13(2): 104−10.
  120. Wei Zhang, Xi Huang, Guoping Zhao, and Weihong Jiang. 2004. Affinity labeled glutaryl-7-amino cephalosporanic acid acylase Π‘130 can hydrolyze the inhibitor during crystallization Biochemical and Biophysical Research Communications (BBRC). 313:555—558.
  121. Zhang Wei, Yuan Liu, Huabao Zheng, Sheng Yang and Weihong. 2005. Improving the Activity and stability of Gl-7ACA-acylase CA130by site-directed mutagenesis. Appl Environ Microbiol.71:5290−6.
  122. Π’., Π€Ρ€ΠΈΡ‡ Π­., Бэмбрук Π”ΠΆ., ΠœΠ΅Ρ‚ΠΎΠ΄Ρ‹ гСнСтичСской ΠΈΠ½ΠΆΠ΅Π½Π΅Ρ€ΠΈΠΈ. ΠœΠΎΠ»Π΅ΠΊΡƒΠ»ΡΡ€Π½ΠΎΠ΅ ΠΊΠ»ΠΎΠ½ΠΈΡ€ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅. 1984. 479с.
  123. Π‘. Π’. Π₯ΠΎΡ€ΠΎΠ½Π΅Π½ΠΊΠΎΠ²Π°, Π’. И. Вишков. 2008. Оксидаза D-аминокислот: физиологичСская Ρ€ΠΎΠ»ΡŒ ΠΈ ΠΏΡ€ΠΈΠΌΠ΅Π½Π΅Π½ΠΈΠ΅. УспСхи биологичСской Ρ…ΠΈΠΌΠΈΠΈ. 48: 359 376
Π—Π°ΠΏΠΎΠ»Π½ΠΈΡ‚ΡŒ Ρ„ΠΎΡ€ΠΌΡƒ Ρ‚Π΅ΠΊΡƒΡ‰Π΅ΠΉ Ρ€Π°Π±ΠΎΡ‚ΠΎΠΉ