Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов

Актуальность проблемы. Ротавирусы (семейство Reoviridae, род Rotavirus) являются основным этиологическим агентом острого гастроэнтерита у детей первых лет жизни. Анализ исследований, опубликованных в период с 1986 по 2000 годы показал, что каждый год в мире регистрируется 111 млн эпизодов ротавирусного гастроэнтерита, 25 млн визитов в клинику, 2 млн госпитализаций и 352,000−592,000 (в среднем 440 тыс.) смертей среди детей в возрасте до 5 лет [144], что определяет необходимость разработки ротавирусной вакцины и совершенствования эпиднадзора за инфекцией. К настоящему времени в мире накоплена обширная информация об экстраординарном генетическом и антигенном многообразии ротавирусов. Среди ротавирусов человека группы, А различают 10 G серотипов (детерминируются гликопротеином VP7), 9 «Р"-серотипов (детерминируются протеазочувствительным белком VP4) и И [Р]-генотипов. Гены, кодирующие VP4 и VP7, могут подвергаться независимому перераспределению, что увеличивает многообразие природных штаммов ротавируса, за счет существования различных комбинаций G и [Р] [163].

К настоящему времени показано существование географических различий в распространенности различных серотипов и генотипов ротавируса, установлен факт их временного перераспределения, зафиксировано появление большого количества нетипируемых штаммов и постоянно сообщается о находках новых, эпидемически значимых вариантов ротавируса [68]. В связи с этим для разработки универсальной вакцины и оценки эффективности уже разработанных вакцин необходимо знание антигенного (генетического) спектра ротавирусов, распространенных на той или иной территории, и проведение мониторинга за циркуляцией ротавирусов разных G[P] типов. Такие исследования в мире носят широкомасштабный характер [185]. Однако в России научные работы подобного плана не проводятся. Ранее в Нижегородском НИИЭМ было проведено изучение генетических и антигенных вариантов РВ, доминировавших на Европейской территории России в 1984;96 гг. Были получены новые данные об особенностях многолетней циркуляции ротавирусов основных G серотипов и прослежены последовательные сдвиги во времени от одного доминирующего варианта вируса к другому. В тоже время исследований по изучению разнообразия [Р]-генотипов ротавируса, G[P] ассоциаций, их распределению и установлению особенностей смены [Р]-генотипа РВ, не проводилось.

Цель исследования: оптимизация метода ОТ-ПЦР для [Р]-генотипирования ротавирусов, изучение временных особенностей циркуляции ротавирусов разных G[P] типов и их молекулярно-биологическая характеристика.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать метод ОТ-ПЦР для выявления гена VP4 ротавирусов группы, А и дать оценку его эффективности.

2. Разработать праймеры для идентификации [Р]-генотипов и Р[8] субтипов ротавирусов.

3. Определить электрофоретипы РНК и G[P] типы ротавирусов, обнаруженных на территориях г. Нижнего Новгорода и г. Дзержинска в период 1997;05 гг., рассчитать их относительное распределение.

4. Изучить особенности смены доминирования субтипов Р[8]-1 и Р[8]-2 в процессе многолетней циркуляции ротавирусов G1P[8] типа.

5. Дать сравнительную характеристику клинических проявлений инфекции, вызванной ротавирусами генотипов G1P[8]-1 и GlP[8]-2.

6. Охарактеризовать молекулярно-биологические свойства ротавирусов, выделенных от новорожденных детей.

Научная новизна и практическая значимость работы:

Оптимизирован метод ОТ-ПЦР для обнаружения РНК ротавирусов разных электрофоретипов, эффективный в отношении штаммов, актуальных для России, что может служить основой для создания диагностической амплификационной тест-системы.

Впервые рассчитано распределение G[P] типов ротавируса, идентифицированных на двух территориях Нижегородской области в 1997;05 гг. Территории городов Нижний Новгород и Дзержинск являются единственными в Российской Федерации, для которых установлен антигенный профиль природных штаммов РВ, что может быть использовано для оценки эффективности применения разработанных в мире ротавирусных вакцин.

Разработан способ субтипирования аллелей гена VP4 генотипа Р[8] с использованием ПЦР. Научная новизна подтверждена патентом (Патент № 2 264 469, приоритет от 24 ноября 2003 года).

Разработана новая технология G[P] генотипирования ротавирусов с использованием полимеразной цепной реакции, включающая: набор оригинальных праймеров, совместимых для мультиплексной постановки, контрольную постановку и универсальную программу амплификации. Рекомендована к утверждению расширенным заседанием Секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии Ученого совета МЗ РФ (Пр. № 168-уч. от 6 декабря 2004 года).

Впервые показаны связанные с субгенотипом Р[8] различия в клинических проявлениях ротавирусной инфекции, свидетельствующее о существовании «респираторного» (G1P[8]-1) и «кишечного» вариантов ротавируса GlP[8]-2.

Выявлен и охарактеризован новый вариант ротавируса генотипа G9P[6]NSP4(A), вызывающий бессимптомную инфекцию у новорожденных детей.

Впервые определена первичная структура гена NSP4 трех российских изолятов ротавируса с генотипом G9P[6]NSP4(A) (DQ270101, DQ270102, DQ270103), что расширяет представления о вариабельности гена энтеротоксина NSP4 ротавируса в мире.

Внедрение результатов исследования в практику:

В процессе работы была установлена этиологическая роль РВ в возникновении 2454 эпизодов ОКИ. Результаты использованы в официальной статистике. При оперативном проведении исследований результаты использовались лечащим врачом для выбора адекватной стратегии лечения детей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизированные и разработанные праймеры для обнаружения РНК ротавирусов группы A (Ro4-l, Ro4−2), для идентификации [Р]-генотипа (P[4]R, P[8]R) и субгенотипа Р[8] (R-P[8]-l, R-P[8]-2), обеспечивают генотипирование штаммов ротавируса, актуальных для территорий России.

2. Спектр G[P] типов ротавирусов циркулировавших среди детей на территории Нижегородской области в период 1997;05 гг. включает основные G1−4 серотипы и Р[4], Р[6], Р[8], Р[9] генотипы, представленные семью G[P] комбинациями, распределение которых изменяется во времени.

3. Особенностью циркуляции ротавируса G1P[8] является постоянное доминирование, поддерживаемое сменой субтипа Р[8]-генотипа, сопровождающейся изменениями в клинических проявлениях инфекции.

4. Ротавирус, обнаруженный у новорожденных детей с бессимптомной формой инфекции имеет генотип G9P[6]NSP4(A) и реорганизованный 11-й геномный сегмент.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены:

• на VII Нижегородской сессии молодых ученых (г. Н. Новгород, 2002 г.);

• на заседании Нижегородского научного биохимического общества (г. Н.

Новгород, 2004 г.);

• на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И. Н. Блохиной и проблемных научнопрактических семинарах института.

Диссертация апробирована на межлабораторной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии 15 декабря 2005 г.

Объем и структура диссертации:

Материалы диссертации изложены на 145 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 192 источника литературы отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 9 таблицами.

VI. ВЫВОДЫ:

1. Показано, что метод ОТ-ПЦР для выявления гена VP4 ротавируса группы, А на основе оптимизированных праймеров Ro4-l и Ro4-l универсален в отношении ротавирусов разных [Р]-генотипов и позволяет повысить относительную чувствительность выявления ротавирусов в клиническом материале по сравнению с РНК-ПААГ на 18,9%, по сравнению с ИФА на 24,5%.

2. Разработаны оригинальные версии праймеров для идентификации генотипов Р[4], Р[8] и субгенотипов Р[8]-1 и Р[8]-2, адаптированные к вариантам ротавируса, актуальным для территорий России.

3. Установлено, что в период 1997;05 гг. на территории Нижегородской области циркулировали ротавирусы семи G[P] типов: G1P[8] (78,6%), G1P[6] (2,6%), G2P[4] (9,0%), G3P[8] (4,6%), G3P[6] (0,9%), G3P[9] (1,3%) G4P[8] (2,6%), н/т (0,4%). В сезон 2004;05 гг. зафиксировано перераспределение генотипов ротавируса: G1P[8] (24%), G2P[4] (37%), G3P[8] (21%), G3P[9] (3,8%), G4P[8] (12%), н/т (2%).

4. Показано, что ротавирус G1P[8] типа имеет как минимум два субгенотипа Р[8], перераспределение которых во времени поддерживает активную циркуляцию вариантов ротавируса серотипа G1. Период 1997;05 гг. в Нижегородской области характеризовался доминированием ротавирусов генотипа Р[8]-2 (75,1%) .

5. Впервые показаны связанные с субгенотипом Р[8] особенности в клинических проявлениях РВГЭ. Установлено, что эпидемически значимый вариант ротавируса GlP[8]-2−61 вызывает гастроэнтерит, характеризующийся интенсивным диарейным синдромом и отсутствием или слабой выраженностью симптомов ОРВИ.

6. Обнаружен и охарактеризован новый необычный вариант ротавируса генотипа G9P[6]NSP4(A) с реорганизованным 11-м геномным сегментом, вызывающий бессимптомную инфекцию у новорожденных детей.

V.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Отсутствие знаний о G[P] типах природных штаммов ротавируса, распространенных на территориях России, и необходимость оптимизации методик [Р]-генотипирования, определили актуальность проведения настоящего исследования.

Работа посвящена изучению разнообразия G[P] типов ротавируса группы, А человека, анализу их временного распределения и комплексной характеристике природных штаммов ротавируса, изолированных на двух относительно удаленных территориях России в период 1997;05 гг., с использованием оптимизированных и разработанных методик ОТ-ПЦР для обнаружения и [Р]-генотипирования РНК.

Необходимость периодического проведения исследований по оптимизации методик ОТ-ПЦР для обнаружения и генотипирования РНК ротавируса и адаптации их к местным штаммам постулируется в научной литературе, так как в процессе длительной циркуляции ротавирусов может произойти накопление мутаций в области типовых праймеров, что снижает эффективность применяемых методик. Наиболее актуальны такие исследования в отношении гена VP4 ротавируса, т.к. праймеры, используемые для идентификации G типа находятся в консервативных областях, кодирующих серотиповые детерминанты.

На первом этапе работы была проведена оптимизация метода ОТ-ПЦР для обнаружения РНК гена VP4. С использованием программы «GeneDoc» был проведен сравнительный анализ 56-ти выровненных нуклеотидных последовательностей гена VP4, представленных в GenBank/EMBL/DDBJ к началу наших исследований. Установлено, что в области универсальных праймеров для обнаружения РНК гена VP4, предложенных ранее Gentsch J. R. с соавторами (праймеры conl и соп2) наблюдается вариабельность последовательностей. Мы оптимизировали данные праймеры с учетом имеющихся нуклеотидных замен путем введения вырожденных оснований и создали собственную версию универсальных праймеров. Праймеры Ro4-l и.

Ro4−2, предложенные нами, фланкируют фрагмент гена VP4 размером 211 н.о., расположенный в области с 676 по 887 н.о. Проведена теоретическая оценка специфичности разработанных праймеров путем сравнительного анализа последовательностей праймеров и 15-ти нуклеотидных последовательностей генома ряда кишечных вирусов (энтеровирусов, астровирусов, калицивирусов, аденовирусов, ротавирусов групп, А и С). Анализ показал, что оптимизированные олигонуклеотиды специфичны в отношении гена VP4 ротавирусов группы, А человека и животных и не имеют существенной гомологии с другими нуклеотидными последовательностями генома кишечных вирусов.

Теоретическая специфичность праймеров была подтверждена экспериментально на 150-ти коллекционных природных штаммах ротавируса группы А, имеющих различные электрофоретипы РНК — «длинные», геногруппа Wa- «короткие», геногруппа DS-1- «широкие», геногруппа AU-1- «аномальные». В результате однораундовой ПЦР с использованием собственной версии праймеров РНК ротавируса данных геногрупп была обнаружена в 100% случаев, что подтверждает их универсальность в отношении различных аллелей гена VP4.

Проведено сравнение эффективности обнаружения ротавирусов у больных с диагнозом острый гастроэнтерит с использованием разработанной методики ОТ-ПЦР и методов РНК-ПААГ и ИФА на основе поликлональных антител. При исследовании случайной выборки из 233 образцов фекалий от детей с ОКИ ротавирусы были обнаружены методом ИФА в 47,6±3,3% случаев, методом РНК-ПААГ — в 45,9±3,3%, с использованием ОТ-ПЦР гена VP4 — в 57,9±3,2% случаев (р<0,01). Достоверно более высокий процент положительных находок, полученных при использовании ОТ-ПЦР, наглядно демонстрирует относительно большую результативность метода генодиагностики, которая, несомненно, связана с его высокой аналитической чувствительностью. В наших исследованиях результаты обнаружения ротавирусов с использованием ОТ-ПЦР и РНК-ПААГ совпали на 88,4%, ОТ.

ПЦР и ИФА на 76,0%, электрофореза РНК и ИФА — в 80,2% случаев. Совпадение положительных и отрицательных результатов в трех используемых методах составило 72,1 ±2,9%. Для установления относительной чувствительности метода ОТ-ПЦР был исследован 151 образец фекалий, положительный на ротавирусы по итогам трех методов. Установлено, что метод ОТ-ПЦР, основанный на праймерах Ro4-l и Ro4−2, при индикации РВ в клиническом материале обладает относительной чувствительностью, превосходящей метод РНК-ПААГ на 18,9%, метод ИФА — на 24,5%. Полученные результаты имеют практическое значение, т.к. оптимизированная лабораторная методика, адаптированная к российским штаммам ротавируса, может служить основой для конструирования диагностической тест-системы на основе ОТ-ПЦР.

Проведенная теоретическая разработка и лабораторные испытания показали, что метод ОТ-ПЦР на основе праймеров Ro4-l и Ro4−2 универсален в отношении ротавирусов различных [Р]-генотипов, что позволило использовать его для контрольной постановки, подтверждающей наличие гена VP4 в пробе при генотипировании природных штаммов ротавируса.

Следующим этапом работы явилась оценка эффективности известных методик и схем G и [Р]-генотипирования и их применимости для анализа местных штаммов ротавируса.

Методология определения G серотипа с использованием ОТ-ПЦР, представленная в научной литературе, основана на праймерах, расположенных консервативных областях последовательности гена VP7, кодирующих серотиповые детерминанты. При этом показана строгая корреляция между G генотипом и G серотипом ротавируса. В наших исследованиях была применена схема G типирования, разработанная Das В.К. с соавторами (1994 г.). Однако в процессе работы возникла необходимость ее модификации. Если праймеры, предложенные для определения Gl, G2, G4, и G9, на наших штаммах работали стабильно, то праймер для G3 серотипа давал неоднозначные результаты. В совместной работе с Н. В. Епифановой была сконструирована оригинальная стабильно работающая версия праймера G3R. В качестве прямого общего праймера GF также была использована другая версия, предложенная И. Н. Бессараб с соавторами (1990 г.).

Для определения [Р]-генотипа штаммов ротавируса использовали схему, предложенную Gentch J.R. с соавторами (1992 г.). Однако при работе с праймерами 2Т-1 и 1Т-1 для идентификации генотипов Р[4] и Р[8], соответственно, возникли сомнения в их специфичности. Так, при анализе выборок штаммов ротавируса, выделенных в один эпидсезон на одной территории и имеющих один ЭФ-тип РНК, что предполагает их клональное родство, часть штаммов типировалась с использованием праймеров, предложенных Gentch J.R., а часть нет. В связи с этим был проведен сравнительный анализ 56 полных выровненных нуклеотидных последовательностей гена VP4 в области типовых праймеров. Установлено, что наибольшее количество нуклеотидных замен находится в регионах, принадлежащих олигонуклеотидам, определяющим генотипы Р[8] и Р[4], что свидетельствовало о необходимости их оптимизации. Праймеры для идентификации генотипов Р[6] и Р[9] не требовали модификации. С учетом обнаруженной вариабельности последовательности нуклеотидов в регионах типовых праймеров нами сконструированы модифицированные праймеры R-Р[4]т и R-P[8]m, имеющие в ряде позиций вырожденные основания и нуклеотидные замены. Апробация собственных версий олигонуклеотидов показала их эффективность в отношении штаммов РВ, актуальных для изучаемых территорий и дававших неоднозначные результаты при использовании исходных версий праймеров.

Кроме модификации праймеров для обнаружения РНК гена VP4 и идентификации генотипов Р[8], Р[4] и G3, была разработана универсальная программа амплификации специфических фрагментов кДНК и подобраны пулы совместимых типовых праймеров для мультиплексной постановки. Разработанная методология определения G[P] типа и метод электрофоретипирования РНК ротавирусов были использованы для изучения природных штаммов ротавируса группы, А человека, обнаруженных на территориях России (г. Н. Новгород, г. Дзержинск и г. Омск) в период 1997;05 г.

С использованием молекулярно-генетических методов были исследованы 4950 образец фекалий от детей в возрасте до 14 лет с диагнозом ОКИ из г. Н. Новгорода и 1595 образцов из г. Дзержинска. Ротавирусы обнаружены в 1774 (35,8+0,68%) и 748 (46,9+1,25%) случаях, соответственно. Среди заболевших 91% составили дети в возрасте до 3-х лет. Среднемноголетний показатель заболеваемости РВГЭ детей в данной возрастной группе составил для г. Н. Новгорода — 7 о/оо, для г. Дзержинска — 15 о/оо. По всей вероятности высокий уровень заболеваемости РВГЭ детей г. Дзержинска связан с экологическим фактором, т.к. территория г. Дзержинска является зоной экологического неблагополучия. Результаты обнаружения ротавирусов у детей с ОКИ сообщались в Центр СЭН в Нижегородской области, где использовались в официальной статистике. При оперативном проведении исследований результаты сообщались лечащему врачу для выбора адекватной стратегии лечения детей.

Проведено изучение генетической гетерогенности обнаруженных ротавирусов. С использованием электрофоретипирования в ПААГ было идентифицировано 60 профилей миграции сегментов РНК: 35 вариантов «длинных» Wa-подобных, 12 вариантов «коротких» DS-1-подобных и 13 вариантов «широких» Аи-1 подобных ЭФ-типов РНК. Доминирующим генетическим вариантом на обеих территориях явился 61-й ЭФ-тип РНК, на долю которого пришлось 39,0% и 38,5% на территории г. Н. Новгорода и г. Дзержинска, соответственно. Следует отметить, что доминирующие генетические варианты ротавируса, обнаруженные в г. Н. Новгороде и г. Дзержинске, были идентичны. Идентифицировано 28 общих вариантов ротавируса. В тоже время в г. Н. Новгороде выявлено 26 вариантов РВ, которые не обнаружены в изолятах из г. Дзержинска. Среди штаммов РВ из г. Дзержинска обнаружено только 6 вариантов вируса, характерных для данной территории. Большая гетерогенность популяции РВ в г. Н. Новгороде может быть связана как с большим числом типированных изолятов РВ, так и с более интенсивной миграцией населения.

Проведено определение G серотипа и [Р]-генотипа природных штаммов ротавируса с доминирующими и необычными ЭФ-типами РНК, собранных в анализируемый период времени на обеих территориях. Проанализирован 1721 ротавирус-содержащий образец из г. Н. Новгорода и 733 изолята РВ из г. Дзержинска. В ходе исследования установлено, что на обеих территориях выявляются ротавирусы основных глобально распространенных G1−4 серотипов в комбинациях с одинаковым спектром [Р]-генотипов. Эти результаты послужили основанием для расчета распределения антигенных типов РВ по суммарным данным обеих территорий.

Рассчитано распределение G серотипов ротавируса: G1 — 81,3%- G2 -8,9%- G3 — 6,8%- G4 — 2,6%- G9 — 0%- и/т — 0,4%.

Рассчитано распределение [Р]-генотипов ротавируса: Р[8] - 85,8%- Р[4] -8,9%- Р[6] - 3,5%- Р[9]-1,3%- н/т- 0,4%.

Рассчитано распределение G[P] типов ротавируса: G1P[8] — 78,6%- G1P[6] - 2,6%- G2P[4] - 9,0%- G3P[8] - 4,6%- G3P[6] - 0,9%- G3P[9] - 1,3%- G4P[8] - 2,6%- h/T — 0,4%.

Из представленных результатов видно, что на территориях г. Н. Новгорода и г. Дзержинска Нижегородской области России циркулируют ротавирусы, относящиеся как минимум к 7-ми антигенным типам. Данное распределение, рассчитанное нами впервые и свидетельствующее об абсолютном доминировании на изученной территории Нижегородской области ротавируса G1P[8], соответствует распределению типов ротавируса, рассчитанному для территорий Европы, Северной Америки и Австралии в аналогичный период времени.

Проведен анализ многолетней динамики частоты обнаружения РВ разных G[P] типов на территориях г. Н. Новгорода и г. Дзержинска. Установлено, что на фоне стабильного доминирования РВ G1P[8] типа в период 1997;05 гг., в последние годы отмечено перераспределение доминирования типов ротавируса. В сезоны РВГЭ 2003;04 гг. в Н. Новгороде и 2004;05 гг. в г. Дзержинске зафиксирована смена доминирования PB-G1P[8] на G1P[6] и G2P[4], соответственно. Зафиксировано пять G[P] типов, распределение которых в сезон 2004;05 гг. по суммарным данным было следующим: G1P[8]-24%, G2P[4]-37%, G3P[8]-21%, G3P[9]-3,8%, G4P[8]-12%, н/т-2%. Увеличение активности циркуляции новых вариантов ротавируса может свидетельствовать о формировании иммунной прослойки населения, устойчивой к ротавирусу G1P[8], и являться предвестником смены доминирующего типа ротавируса. Представленные результаты изучения спектра G[P] типов ротавируса с использованием разработанной методологии ОТ-ПЦР для обнаружения и генотипирования РНК являются первым сообщением по изучению распределения G[P] типов ротавируса на одной из территорий России, что имеет значение для теоретической оценки эффективности созданных в мире ротавирусных вакцин и разработки стратегии вакцинопрофилактики РВГЭ. Представляется вероятным, что предсказываемая нами смена доминирующего G[P] типа ротавируса может снизить эффективность использования моновалентной вакцины Rotarix в последующие годы.

При анализе ЭФ-типов РНК изолятов ротавируса одного G[P] типа было установлено существование в пределах PB-G1P[8] генетических вариантов, кардинально различающихся электрофоретической подвижностью 4-го геномного сегмента. Обнаружены варианты вируса с медленно-мигрирующим и быстромигрирующим геном VP4, что свидетельствовало о существовании у исследуемых нами штаммов ротавируса как минимум двух аллелей гена, определяющих Р[8] генотип. К началу наших исследований было уже известно существование, по данным разных авторов, 2−3-х субгенотипов Р[8], которые определяли с использованием секвенирования соответствующих участков гена VP4. Учитывая возможности лаборатории, была поставлена задача сконструировать праймеры для идентификации субгенотипов Р[8] методом ПЦР. Проведен сравнительный анализ 33-х выровненных нуклеотидных последовательностей гена VP4 ротавируса Р[8] генотипа. Сравнивали области нуклеотидной последовательности гена VP4, кодирующей консервативные аминокислоты, соответствующие трем известным субтипам. По результатам анализа нами впервые сконструированы праймеры P[8]-1R и P[8]-2R, которые позволяют проводить дифференциацию субтипов ротавируса генотипа Р[8] с использованием ПЦР, не применяя при этом секвенирование. Предложенные праймеры в однораундовой ПЦР с общим F-праймером, фланкируют участок гена VP4 размером 410 п.н. Оценку специфичности предложенных праймеров проводили с использованием референтного ротавируса человека — шт. Wa, имеющего субтип Р[8]-1. В настоящем исследовании нами установлена строгая корреляция между электрофоретической подвижностью четвертого геномного сегмента и субтипом последовательности гена VP4. РНК всех исследуемых штаммов РВ (3, 4, 34 ЭФ-тип РНК), имеющая медленно мигрирующий четвертый сегмент, амплифицировалась с использованием праймера, специфичного в отношении субгенотипа Р[8]-1, а РНК, имеющая быстро мигрирующий четвертый сегмент, амплифицировалась только с праймером, специфичным в отношении субгенотипа Р[8]-2. Способ определения субгенотипов Р[8]-1 и Р[8]-2 с использованием ПЦР предложен нами впервые. Новизна подтверждена патентом № 2 264 469, приоритет от 24 ноября 2003 года.

Разработка нового методического приема дифференциации субаллелей Р[8] позволила нам более углубленно изучить штаммы PB-G1P[8]. Проведен анализ ассоциаций различных субгенотипов Р[8] с G серотипом. Анализ комбинаций различных G серотипов с субтипами Р[8] показал, что и тот и другой субтипы были ассоциированы с серотипами Gl, G3 и G4, основная масса которых была связана с субтипом Р[8]-2. Комбинации G3P[8]-1 и G4P[8]-1 были представлены только единичными изолятами (два G3P[8]-1- в г. Н. Новгороде и один G4P[8]-1- в г. Дзержинске). Соотношение субгенотипов Р[8] в изучаемый нами период времени 1997;2005 гг. было следующим: в г. Н. Новгороде 12,3% изолятов составляли РВ с субгенотипом Р[8]-1 и 73,5% - РВ с субгенотипом Р[8]-2- в г. Дзержинске частота обнаружения субаллелей Р[8] составила 7,0% для РВ-Р[8]-1 и 78,6% для РВ-Р[8]-2. В суммарном распределении G[P] типов ротавируса на долю вариантов ротавируса с генотипом Р[8]-1 пришлось 10,7%, с генотипом Р[8]-2 — 75,0%. Наиболее часто обнаруживались варианты ротавируса GlP[8]-2, доля которого составила 68,0% в выборке изученных штаммов ротавируса. Определение доминирующего субгенотипа Р[8] ротавируса проведено впервые.

С учетом данных, полученных в Нижегородском НИИЭМ при мониторинге антигенных типов РВ в 1984;1996 гг., стабильно активная циркуляция ротавирусов серотипа G1 продолжается на территории г. Н. Новгорода уже более 20 лет. Мы проанализировали многолетнюю динамику циркуляции PB-G1P[8] по материалам текущего и ретроспективного определения субгенотипов Р[8]. Установлено, что в процессе многолетней циркуляции (1984;2005 гг.) ротавирусов, происходило постепенное замещение генетических вариантов PB-G1P[8]-1 на варианты PB-GlP[8]-2. На полное замещение штаммов с новым субгенотипом Р[8] ротавирусу серотипа G1 потребовалось 15 эпидемических лет. Для этого PB-GlP[8]-2 типа сменил пять генетических вариантов. Представляется вероятным, что смена субгенотипа Р[8] поддерживала активную циркуляцию РВ G1 серотипа.

Нами установлено, что изучаемый период времени абсолютно-доминирующее положение в г. Н. Новгороде занял 61-й генетический вариант ротавируса GlP[8]-2. В период доминирования в 2001;02 гг. РВ GlP[8]-2-(61) вызвал резкий подъем заболеваемости РВГЭ, обусловив 75% госпитализаций. Представляло научный интерес оценить клинические особенности РВГЭ, вызванного ротавирусом этого типа. Проведен анализ выписок из историй болезни 51-го ребенка с моноротавирусной инфекцией, выделявших РВ G1P[8]-2-(61). Результаты частоты регистрации максимально выраженных и продолжительных симптомов РВГЭ при инфицировании GlP[8]-2-(61) сравнили с аналогичными архивными показателями, установленными для GlP[8]-l-(3). Установлено, что при инфицировании детей PB-GlP[8]-2-(61) достоверно чаще наблюдался диарейный стул в течение более 4-х дней, многократная рвота наблюдалась достоверно реже, симптомы ОРВИ зарегистрированы у меньшего числа детей и были выражены слабо. Ведущим синдромом в определении тяжести заболевания был токсикоз с эксикозом. Это отличало ротавирус GlP[8]-2-(61) от ротавируса GlP[8]-l-(3), при инфицировании которым ведущим синдромом, определяющим тяжесть течения заболевания, был токсикоз в сочетании с симптоматическими поражениями верхних отделов респираторного тракта. По всей вероятности, различия в частоте проявлений и выраженности поражений слизистых верхних дыхательных путей и выраженности диарейного синдрома при инфицировании ротавирусами G1P[8]-1 и GlP[8]-2 не связаны с G серотиповой принадлежностью вируса, а определяются субаллелями гена VP4. Ротавирус GlP[8]-l-(3) типа определен нами как респираторный вариант вируса, a G1P[8]-2-(61) — как кишечный. Различия в клинических проявлениях РВГЭ, связанные с субгенотипом Р[8], показаны нами впервые.

На следующем этапе работы проведено изучение молекулярно-генетических особенностей штаммов РВ, выделенных от новорожденных, госпитализированных в ГКПЦ г. Омска. Обследование новорожденных на ротавирусный антиген методом ИФА, проводилось сотрудниками Омской государственной медицинской академии Стасенко B.JI. и Милениной В. М., совместно с сотрудниками ЦГСЭН в Омской области. В нашей лаборатории было исследовано 82 образца фекалий детей, положительных на ротавирусы, собранных в период с мая 2002 года по сентябрь 2004 года. Изоляты РВ, были изучены с использованием молекулярно-генетических методов: G[P] типирования, ЭФ типирования РНК, секвенирования гена NSP4.

ЭФ-типирование РНК штаммов показало наличие двух видов профилей РНК — длинного, типичного для РВ группы, А (20,7% и аномального (79,3%). Необычный профиль миграции сегментов содержал в четвертом классе генов один сегмент, а втором классе — три. Такое изменение стандартной картины распределения сегментов РНК на классы, характерной для РВ группы А, свидетельствует о геномных перестройках у штаммов РВ.

С использованием разработанной нами методологии G[P] типирования установлено, что РВ с типичным ЭФ-типом РНК (соответствует 72-ому нижегородскому ЭФ-типу) имели генотип GlP[8]-2, а с аномальным — G9P[6]. При инфицировании новорожденных данным вариантом РВ в 75% наблюдалось бессимптомное течение инфекции, в 25% наблюдался жидкий стул (%=10,1 р=0,001). Эти значения свидетельствуют, что о существовании связи между G9P[6] типом и бессимптомным течением инфекции.

Проведено секвенирование полноразмерного гена NSP4 трех изолятов PB-G9P[6], собранных в разные годы, определенные нуклеотидные последовательности депонированы в базе данных GenBank/EMBL/DDBJ под номерами DQ270101, DQ270102, DQ270103. Сравнительный анализ полных нуклеотидных последовательностей гена NSP4 омских изолятов и штаммов РВ с известным генотипом NSP4 показал, что омские изоляты PB-G9P[6] находятся в одном кластере со штаммами РВЧ, имеющими генотип NSP4(A). Аллель гена NSP4 генотипа, А ведет свое происхождение от ротавирусов животных. Вариант РВ G9P[6] является новым в глобальной коллекции штаммов.

Полученные нами результаты обнаружения РВ с использованием молекулярно-генетических методов (ОТ-ПЦР, РНК-ПААГ) и генотипирования штаммов сообщались в Омскую медицинскую академию и ЦГСЭН в Омской области, где были учтены при расшифровке причин роста внутрибольничной заболеваемости ОКИ новорожденных детей. Эпидемиологическое расследование позволило установить, что штамм ротавируса G9P[6]NSP4(A) с реорганизованным геномом был занесен в перинатальный центр из родильного дома, где получил внутрибольничное распространение и циркулировал в течение трех лет. По результатам комплексных исследований с учетом полученных нами результатов сотрудниками Омской медицинской академии и Центра ГСЭН для предупреждения заноса и распространения РВИ в стационарах и отделениях для новорожденных детей разработан комплекс профилактических рекомендаций и проведены адекватные противоэпидемические мероприятия.

Суммируя все вышесказанное, можно заключить, что в результате проведенной работы, направленной на адаптацию методологии G[P] генотипирования к местным штаммам ротавируса, оптимизированы универсальные олигонуклеотидные праймеры Ro4-l и Ro4−2 для обнаружения гена VP4 ротавирусов группы А, предложены собственные версии праймеров для идентификации генотипов Р[4] и Р[8], разработана оригинальная пара праймеров для субгенотипирования Р[8] аллелей гена VP4 методом ОТ-ПЦР. С использованием разработанных методик установлено распределение G[P] типов ротавирусов, циркулировавших среди населения двух городов Нижегородской области в период 1997;2005 гг., свидетельствующее об абсолютном доминировании генетических вариантов ротавируса G1P[8] и отсутствии штаммов серотипа G9. В 2003;5 гг. зафиксировано увеличение активности циркуляции РВ генотипов G1P[6], G2P[4] и G3P[8], что может служить предвестником смены доминирующего G[P] типа ротавируса. Показано существование генетических вариантов PB-G1, различающихся субгенотипом Р[8], впервые продемонстрирована многолетняя динамика их смены и установлены различия в кинических проявлениях инфекции, вызванной ротавирусами G1P[8]-1 и GlP[8]-2. Обнаружен и охарактеризован новый необычный вариант ротавируса с реорганизованным 11-м сегментом G9P[6]NSP4(A) типа, наиболее часто вызывающий бессимптомное течение РВИ и явившийся причиной нозокомиальной инфекции новорожденных детей на втором этапе выхаживания.

Опыт применения G[P] генотипирования в практике здравоохранения показал эффективность разработанных методик в расшифровке локальных вспышек ОКИ в закрытых коллективахустановлении внутрибольничной циркуляции ротавирусовосуществлении мониторинга за циркулирующими вариантами ротавируса с целью установления смены доминирующего G[P] типа ротавируса, сопровождающейся ростом заболеваемости РВГЭ.