Сорбционные свойства и фармакологическая активность некрахмальных полисахаридов

Актуальность проблемы. Поиск соединений с высокой фармакологической активностью и разработка на их основе новых лекарственных препаратов являются важными задачами современной экспериментальной фармакологии и фармации. Актуальность поисковых исследований обусловлена необходимостью пополнения арсенала лекарственных средств более эффективными и менее токсичными препаратами, предназначенными для лечения и профилактики социально-значимых заболеваний. Наряду с медицинскими задачами, необходимость в создании новых фармацевтических субстанций и лекарственных средств диктуется социальными и экономическими причинами. По данным агентства «DSM Group», в 2008 г. на Российском фармацевтическом рынке 75,8% лекарственных препаратов в стоимостном объеме были представлены средствами импортного производства [Кузин, 2008]. Большинство лекарственных средств отечественного производства является препаратами-дженериками, эффективность которых по сравнению с оригинальными препаратами, как правило, значительно ниже. В настоящее время примерно 80% отечественных лекарственных препаратов производится из фармацевтических субстанций импортного производства. В период с 1991 г. до 2005 г. объем производства фармацевтических субстанций в Российской Федерации сократился с 17,5 тыс. усл. тонн до 0,98 тыс. усл. тонн. Все это негативно отражается на состоянии здоровья населения и требует более интенсивного развития биомедицинских исследований, направленных на создание новых эффективных лекарственных средств.

По разным оценкам от 40 до 70% новых лекарственных препаратов создается на основе природных молекул или их синтетических аналогов и производных. На основе природных соединений могут быть разработаны лекарственные средства с принципиально иными фармакологическими свойствами, обладающие большей терапевтической активностью или качественно новыми фармакологическими эффектами по сравнению с химически синтезированными лекарственными веществами. Существенными преимуществами лекарственных веществ из природных источников являются доступность сырья, меньшая сложность технологических процессов выделения и очистки, выраженная фармакологическая активность и, как правило, низкая токсичность. В этом отношении большой интерес вызывают представители морской флоры и фауны, которые можно рассматривать как источник новых лекарств и фармакологически активных субстанций [Bowling et al., 2007; Martinez A., 2007; Kinghorn A. et al., 2009]. В отличие от показателей видового обилия, филогенетическое (макротаксоиомическое) разнообразие в море гораздо выше, чем на суше. Из 33 типов многоклеточных животных 31 тип встречается в морских водах, 17 типов — в пресных водах и только 11 типов — на суше [Адрианов A.B., 2004]. По-видимому, благодаря многочисленным адаптациям к разнообразным факторам окружающей среды, ряд морских животных и растений вырабатывает уникальные вторичные метаболиты, нехарактерные для наземных организмов, многие из которых обладают экстремально высокой фармакологической активностью [Haefner В., 2003; Muller W. et al., 2003; Alonso D. et al., 2005; Newman D., Cragg G., 2006; Стоник B.A., Толстиков Г. А., 2008].

Основными источниками новых биологически активных соединений морского происхождения являются беспозвоночные животные, водоросли, грибы и бактерии [Belarbi Е. et al., 2003; Newman D., Hill, 2006; Saleem M. et al., 2007]. Кроме хорошо известных соединений липидной природы [Masson М. et al., 2000], объектами фармакологических исследований в последние годы стали представители таких классов химических веществ, как поликетиды, стероиды, терпены и пептиды (Florence G. et al., 2008; Mayer A., Gustafson K., 2008]. Ha стадии доклинических испытаний находятся более 200 веществ морского происхождения, проявляющих антибактериальную, антигельминтную, противогрибковую, противомалярийную, анткоагулянтную, антиагрегантную, противовоспалительную, противотуберкулезную и антивирусную активности. Ряд соединений оказывает выраженные эффекты на сердечно-сосудистую, иммунную и нервную системы [Mayer А., Hamann М., 2005; De Souza М., 2006; Laurent D., Pietra F., 2006; Mayer A. et al., 2007]. Более десятка природных соединения из морских гидробионтов и их синтетические производные находятся на стадиях клинических испытаний в качестве противоопухолевых агентов. Структура этих веществ чрезвычайно разнообразна — от простых линейных пептидов до сложных макроциклических полиэфиров [Simmons В. et al., 2005; Kinghorn А. et al., 2009]. Среди этих веществ найдены соединения, такие как спонгистатин из морских губок, которые по токсичности в отношении раковых клеток на два-три порядка превосходят применяемые противоопухолевые препараты [Gerber-Lemaire S., Vogel P., 2008].

Перспективную группу веществ, преимущественно морского происхождения, составляют некрахмальные полисахариды [Хотимченко Ю.С. и др., 2005], к которым относятся альгинаты и фукоиданы морских бурых водорослей, каррагинапы красных водорослей, хитин и его производное хитозан морских ракообразных, а также пектины морских трав и наземных растений. Они широко применяются в пищевой промышленности в качестве стабилизаторов, загустителей и гелеобразователей и в меньших масштабах — в фармацевтической промышленности как формообразующие вещества [Redgwell R., Fischer М., 2005]. В последние годы эти полисахариды стали объектом нанотехнологических исследований в качестве структурных компонентов систем адресной доставки лекарственных молекул и микрокапсулирования [Liu Z. et al., 2008].

Все некрахмальные полисахариды объединены общим свойством: в желудочно-кишечном тракте они не гидролизуются амилазами слюнных и панкреатических желез и не абсорбируются из кишечника в кровь, однако, в толстой кишке подвергаются деградации под действием ферментов бактериальной микрофлоры [Wong J.M. et al., 2006]. Уникальным свойством этих полисахаридов является способность поглощать большое количество воды и в присутствии, как правило, двухвалентных ионов образовывать гели. Механизм гелеобразования лежит в основе способности некрахмальных полисахаридов связывать и прочно удерживать ионы металлов и другие ионизированные молекулы [Kohn R., 1987]. У большинства исследованных полисахаридов обнаружены те или иные фармакологические эффекты, заслуживающие внимания в плане создания новых фармацевтических субстанций. Так, пектины, альгинаты и хитозаны обладают достоверным гипохолестеринемическим и гипотриглицеридемическим эффектами [Panlasigui L.N. et al., 2003; Shields K.M. et al., 2003]. Гепатопротекторное и нефропротекотрное действие обнаружено у фукоиданов [Kawano N. et al., 2007; Veena C.K. et al., 2007]. В экспериментальных исследованиях и клинических наблюдениях была доказана терапевтическая эффективность пектинов при инфекционной патологии, проявляющаяся в снижении явлений интоксикации.

Ященя O.B. и др., 2001], а также при отравлении ртутью [Соболев М.Б. и др., 1999]. У пектинов и хитозанов выявлены бактерицидные и фунгицидные эффекты, а у фукоиданов и каррагинанов — противовирусная активность [Neurath A.R. et al. 2002; Carlucci M.J. et al., 2004; Adhikari U. et al., 2006; Buck C.B. et al., 2006], которая сочетается с иммуностимулирующим эффектом [Yoshikawa Y. et al., 2008] и способностью к индукции синтеза интерферонов [Tsuji R.F. et al., 2003]. Помимо этого, у фукоиданов и каррагинанов установлена антикоагулянтная активность [Liang A. et al., 2006; Cicala С. et al., 2007], которая y высокосульфатированных фукоиданов сопоставима с таковой препаратов гепарина [Qui X.D. et al., 2006]. Фукоидан проявляет таюке антиагрегантные свойства [Mourao P.A.S., 2004], а альгиновая кислота, наоборот, обладает протромботической активностью, что на практике реализовалось в создании перевязочных материалов с гемостатическими свойствами [Pielesz A. et al., 2008]. Результаты многих исследований указывают на наличие противоопухолевой активности у некрахмальных полисахаридов. Пектины в эксперименте снижают частоту рака толстого кишечника, что было подтверждено результатами клинических наблюдений. На моделях перевиваемых опухолей у мышей показана противоопухолевая активность альгинатов. В ряде работ продемонстрирована способность фукоиданов ингибировать рост опухолей и ' уменьшать интенсивность процессов метастазирования [Алексеенко Т.В. и др., 2007; Cumashi A. et al., 2007; Li D.Y. et al., 2008]. Получены данные о противоопухолевой активности и каррагинанов [Zhou G. et al., 2006], хотя в литературе имеются факты, указывающие на их онкогенное действие [Tobacman J.K. et al., 2001; Hata К. et al., 2006]. Весьма перспективными препаратами для лечения и профилактики язвенной болезни представляются фукоиданы, которые, с одной стороны, обладают антипептическими и противовоспалительными свойствами [Shibata H. et al., 2000; Yamamoto Y. et al., 2000], a с другой, препятствуют адгезии Helycobacter pylori на мембраны эпителиальных клеток слизистой желудка [Shibata H. et al., 1999].

Следует подчеркнуть, что представители каждой группы некрахмальных полисахаридов представляют собой гетерогенные соединения, различающиеся не только источниками происхождения, но и параметрами физико-химических свойств, таких как молекулярная масса, вязкость, растворимость в воде, степень этерификации и сульфатирования, что, к сожалению, не учитывается в большинстве работ по оценке биологической активности углеводных биополимеров и, на наш взгляд, является причиной многочисленных противоречивых фактов, имеющихся в литературе, посвященной фармакологии этих полисахаридов. Отсутствие общепринятых количественных показателей для стандартизации препаратов некрахмальных полисахаридов затрудняет проведение сравнительной оценки фармакологической эффективности полисахаридов друг с другом, а также с лекарственными препаратами аналогичного действия. Сформулированные проблемы определили цели и задачи настоящей работы.

Цель работы:

Изучить сорбционные свойства, фармакологические эффекты и механизмы действия некрахмальных полисахаридов и обосновать возможности использования данных веществ для разработки новых фармацевтических субстанций и лекарственных средств.

Задачи работы:

1. Изучить металлсвязывающие свойства природных пектинов, альгинатов, хитозанов, каррагинанов и фукоидана при взаимодействии с ионами меди, ртути, кадмия, свинца, цинка и стронция и определить с помощью математических моделей сорбции основные константы связывания.

2. Провести сравнительный анализ количественных параметров связывания тяжелых металлов некрахмальными полисахаридами и лекарственными препаратами из группы энтеросорбентов и определить наиболее перспективные образцы для дальнейшей разработки на их основе новых лекарственных средств.

3. Исследовать металлсвязывающую активность образцов пектинов с различной степенью этерификации при взаимодействии с ионами меди, ртути, кадмия, свинца, цинка и стронция и установить зависимость сорбционной емкости полисахаридов от степени этерификации.

4. На модели свинцовой нагрузки у лабораторных животных оценить влияние пектинов, альгинатов, хитозана, каррагинанов и фукоидана на депонирование и экскрецию тяжелых металлов.

5. Оценить гипохолестеринемическую, гипотриглицеридемическую и антиоксидантную активность пектинов, альгинатов, каррагинанов и фукоидана на различных моделях экспериментальной гиперлипидемии.

6. Исследовать биохимические характеристики наличия и выраженности гепатопротекторного эффекта пектинов и альгинатов у животных с экспериментальным тетрахлорметановым поражением печени, а также оценить их антиоксидантные свойства на данной модели.

7. На экспериментальных моделях повреждения слизистой желудка оценить гастропротективные эффекты пектинов, альгинатов, хитозана и каррагинанов.

8. Определить сорбционную емкость пектинов и альгинатов в отношении мочевины и креатинина и изучить лечебные и профилактические эффекты этих полисахаридов при экспериментальной почечной недостаточности.

9. Провести анализ зависимости сорбционных свойств и фармакологических эффектов некрахмальных полисахаридов от их физико-химических свойств на примере высокоэтерифицированных и низкоэтерифицированных пектинов с целью стандартизации полисахаридных препаратов.

Научная новизна и теоретическое значение работы:

Работа является комплексным научным исследованием, посвященным фармакологии некрахмальных полисахаридов. Дана сравнительная оценка сорбционных свойств, антитоксической, липиднормализующей, гепатопротективной, гастропротективной и нефропротектиновной активности пектинов, альгинатов, хитозана, каррагинанов и фукоидана.

На основе математического аппарата моделей сорбции Лэнгмюра, Фрейндлиха и Брюне-Эммета-Таллера определены параметры максимальной сорбционной емкости, аффинитета и прочности связывания металлов природными и модифицированными некрахмальными полисахаридами. Установлена зависимость количественных значений констант связывания от степени этерификации пектинов, содержания кальция в молекуле альгинатов и пектинов, от степени сульфатирования каррагинанов. Определены наиболее эффективные образцы некрахмальных полисахаридов, препятствующих накоплению металлов в организме и ускоряющих их выведение.

Установлены константы связывания желчных кислот, билирубина, мочевины и креатинина пектинами и альгинатами. Показана зависимость гипохолестеринемического и гипотриглицеридемического действия пектинов и альгинатов от молекулярной массы и характеристической вязкости полисахаридов. Определены образцы пектинов, альгинатов, хитозана и каррагинанов, обладающие лечебным и профилактическим действием при экспериментальном токсическом поражении печени и почек.

На различных моделях повреждения слизистой желудка крыс показано антиульцерогенное действие альгината кальция, альгината натрия, пектата кальция, хитозана, фукоидана и каррагинанов.

Проведен всесторонний анализ зависимости фармакологических эффектов некрахмальных полисахаридов от их химической структуры, молекулярной массы, вязкости и других физико-химических параметров. Количественные характеристики физико-химических свойств предложены в качестве показателей стандартизации препаратов некрахмальных полисахаридов.

Теоретическое значение работы заключается в установлении новых, не известных ранее закономерных связей структуры и физико-химических свойств некрахмальных полисахаридов с их биологической активностью. Установлены новые механизмы фармакологического действия углеводных биополимеров.

Практическая значимость работы и реализация результатов исследования:

Практическим итогом проведенного исследования стало базирующееся на полученных результатах обоснование дальнейшей разработки лекарственных средств на основе низкоэтерифицированных пектинов, солей пектовой и альгиновой кислот, предназначенных для применения в качестве энтеросорбентов. Высокая сорбционная емкость пектинов и альгинатов по тяжелым металлам, значительно превышающая таковую препаратов активированного угля и лигнина, сочетающаяся с возможностью их длительного безопасного приема, позволяют рассматривать эти вещества как перспективные препараты для профилактики и лечения хронических отравлений тяжелыми металлами. Пектат кальция может быть рекомендован для дальнейшей разработки в качестве гастропротективного средства.

Препараты некрахмальных полисахаридов с энтеросорбционными свойствами могут рассматриваться в качестве дополнительных средств в комплексном лечении заболеваний, сопровождающихся явлениями интоксикации.

На основании проведенных экспериментальных исследований, анализа физико-химических характеристик и технологических процессов выделения, очистки и химической модификации полисахаридов разработана и зарегистрирована в установленном порядке нормативная документация на производство и реализацию биологически активных добавок к пище, действующим компонентом которых является пектин со степенью этерификации менее 5%, комбинация пектинов с суммарной степенью этерификации 50% и альгинат кальция. Действующие компоненты рассматриваются в качестве основы для разработки лекарственных средств с энтеросорбционными свойствами.

Разработанные технологии получения модифицированных некрахмальных полисахаридов и способы их применения защищены четырьмя патентами Российской Федерации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Некрахмальные полисахариды обладают выраженной металлсвязывающей способностью в отношении токсичных металлов, таких как свинец, кадмий, ртуть, стронций и могут стать основой для разработки новых лекарственных средств, предназначенных для лечения и профилактики заболеваний, обусловленных действием тяжелых металлов. Наиболее перспективными для дальнейшего изучения в качестве средств профилактики и лечения хронических поражений тяжелыми металлами деэтерифицированный пектин, альгинат натрия, пектат кальция, альгинат кальция.

2. Механизмы связывания ионов меди, свинца, кадмия и цинка пектинами и альгинатами отличаются от процессов связывания ионов ртути и стронция. Сорбция ионов меди, свинца, кадмия и цинка происходит за счет образования координационных связей между карбоксильными и гидроксильными группами галактуроновых кислот в пектине и гулуроновых кислот в альгинате и ионом метала с формированием упорядоченной структуры гомогенных активных связывающих центров. Связывание ртути и стронция происходит за счет образования координационных связей между карбоксильными и гидроксильными группами галактуроновых кислот в пектине и гулуроновых кислот в альгинате, приводящего к хаотичному формированию гетерогенных активных связывающих центров. Дополнительное введение ионов кальция в сорбционную систему связывания ртути и стронция приводит к упорядочиванию структуры активных связывающих центров.

3. Препараты пектинов, альгинатов, хитозана и фукоидана при энтеральном введении оказывают липиднормализующее действие, позволяющее рассматривать их в качестве основы для разработки средств профилактики атеросклероза.

4. Препараты пектинов, альгинатов и хитозана оказывают гастропротективное действие на различных моделях поражения слизистой желудка и является перспективной основой для создания новых противоязвенных средств.

5. Препараты пектинов, альгинатов и хитозана способствуют нормализации биохимических параметров печеночной интоксикации при экспериментальной поражении печени, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных гепатопротекторов. Одним из механизмов антитоксического действия некрахмальных полисахаридов является их антиоксидантная активность.

6. Препараты альгинатов и пектинов при энтеральном введении уменьшают явления уремической интоксикации и могут найти применение в комплексном лечении почечной недостаточности.

Апробация работы:

Основные результаты работы были доложены и обсуждены на IV Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище: XXI век» (С.-Петербург, 2000), Русско-японском международном медицинском симпозиуме (Благовещенск, 2000), X-XVI Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009), 2-ом Съезде российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003), Международном симпозиуме «International Conference on Development Pharmacology» (Harbin, China, 2004), Международном симпозиуме «China-Russia International Conference on Pharmacology» (Harbin, China,.

2005), XV Мировом фармакологическом конгрессе «Pharmacology in the 21st Century: A Bridge between the Past and the New Molecular Frontiers» (Beijing, China,.

2006), V Дальневосточном региональном конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, 2008), XVI Мировом конгрессе базисной и клинической фармакологии «WorldPharma 2010» (Copenhagen, Denmark, 2010).

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на заседании Проблемной комиссии по фармакологии, клинической фармакологии и фармации Владивостокского государственного медицинского университета. По результатам обсуждения диссертация была рекомендована к защите.

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 62 печатные работы, в том числе 1 монография, 36 статей, в том числе 16 в журналах, рекомендованных ВАК к защите докторских диссертаций, 21 тезис докладов, 4 патента Российской Федерации.

Финансовая поддержка.

Работа выполнялась при финансовой поддержке грантов РФФИ № 01−449 413 «Сравнительная эффективность и механизмы сорбционной активности высокоэтерифицированных и низкоэтерифицированных пектинов», ДВО РАН — СО РАМН № 06-III-A-05−468 «Первичные фармакологические исследования, токсикологические испытания, стандартизация и разработка лекарственных препаратов на основе некрахмальных полисахаридов», РФФИ-ДВО № 09−03−98 512 «Условия и механизмы образования комплексов наночастиц некрахмальных полисахаридов с ионами поливалентных металлов», Государственных контрактов в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007;2012 годы»: Государственный контракт № 02.512.11.2090 «Разработка фармакологических средств защиты человека от действия радионуклидов, токсических металлов и эндогенных метаболитов на основе биопрепаратов из морских животных и растений», Государственный контракт № 02.512.12.2043 «Разработка фармакологических средств на основе модифицированных некрахмальных полисахаридов для использования в терапии злокачественных новообразований».

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 327 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 8 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.

Заключение

.

Результаты проведенных исследований показали, что при взаимодействии с ионами двухвалентных металлов все некрахмальные полисахариды проявляют связывающую активность, которая существенно превышает таковую у зарегистрированных лекарственных препаратов энтеросорбентов — активированного угля, полифепана и микрокристаллической целлюлозы. Сорбционная емкость полисахаридов находится в зависимости от значений рН. Как правило, наибольшая связывающая активность проявляется в диапазоне рН от 4,0 до 8,0. Исключением является образец хитозана, который при рН ниже 5,0 находится в неионизированной форме и не проявляет связывающей активности [Jodra Y., Mijangos F., 2001]. В связи с этим максимальная эффективность хитозана проявлялась при рН около 7,0. Следует отметить, что многие металлы при рН 7,0 и выше образуют нерастворимые гидроксиды и не могут образовывать связи с полимерными сорбентами, вследствие чего металл-связывающая активность хитозана во всех экспериментах оставалась ниже, чем у других полимеров. Комплексная оценка связывающей активности некрахмальных полисахаридов при помощи математических моделей сорбции показала, что при взаимодействии с ионами всех изученных металлов, за исключением ртути и стронция, связывание происходит за счет образования активных связывающих центров однородной структуры, каждый из которых взаимодействует с одним ионом металла. Подтверждением этого вывода является применимость к описанию сорбционных процессов в этих случаях модели Лэнгмюра. Невозможность описания сорбционных взаимодействий при помощи модели БЭТ для оценки связывания всех металлов указывает на то, что один активный центр молекул всех изучаемых полисахаридов, также как и препаратов энтеросорбентов, может взаимодействовать только с одним ионом металла. В случае взаимодействия водорастворимых полисахаридов, активные центры которых в водных растворах диссоциируют с высвобождением катионов натрия, с ионами ртути и стронция, как правило, не происходит формирования однородных связывающих центров, что, вероятно, объясняется свойствами ионов металла. Стронций и ртуть не образуют с карбоксильными группами координационных связей, которые, в конечном счете, образуют контактную ячейку по типу «egg-box» .

Gant G.T. et al., 1973], состоящую и четырех остатков карбоксильных групп. Связывание происходит с отдельными карбоксильными группами, которые не складываются в упорядоченную структуру. Данное предположение, прежде всего, подтверждается высокими значениями R2, полученными при расчете уравнения Фрейндлиха. Поскольку модель Фрейндлиха не позволяет рассчитать параметры относительного количества активных связывающих центров и аффинитета, качественная сравнительная характеристика ртутьи стронций-связывающей активности была затруднена и были использованы данные зависимости сорбционной емкости полисахаридов от рН, позволяющие оценить сравнительную сорбционную емкость полисахаридов и энтеросорбентов в данных условиях. Результаты показали, что наибольшая сорбционная емкость по ртути и стронцию характерна для препаратов пектата кальция и альгината кальция. При этом связывание стронция двумя этими препаратами происходит по типу модели Лэнгмюра, что отличает их от других образцов полисахаридов. Данное явление можно объяснит тем, что ионы кальция, находящиеся в молекуле полимера формируют активные связывающие центры, состоящие из четырех остатков карбоксильных групп. Далее процесс связывания ионов стронция или ртути происходит по типу ионообмена: ион кальция в каждой ячейке связывания заменяется на ион ртути или стронция без нарушения структуры самой ячейки. Пектины и альгинаты, молекулы которых не содержат ионов кальция, в растворе образуют ионизированные формы и при добавлении ионов стронция или ртути происходит хаотичный процесс формирования «неполноценных» связывающих центров. Несмотря на то, что образцы деэтерифицированного пектина и альгината натрия проявляли большую связывающую активность в отношении ионов стронция, образцы альгината и пектата кальция следует признать более активными в отношении ионов ртути и стронция, поскольку с практической точки зрения наиболее перспективными являются соединения, обладающие способностью связывать ионы металла в условиях их малых концентраций в сорбционной системе.

Сравнительная оценка коэффициентов сорбционной активности показала, что наиболее перспективными соединениями с точки зрения связывания двухвалентных металлов являются производные пектинов и альгинатов. Такие полисахариды, как фукоидан, хитозан и каррагинан, хотя и проявляют активность при взаимодействии с металлами, но их связывающая способность отличается специфичностью. Они активно взаимодействуют с одними металлами и не проявляют заметной активности в отношении других. Помимо этого, несмотря на большое количество активных связывающих центров, хитозан и фукоидан отличаются крайне низкими значениями коэффициента аффинитета, что не позволяет рассматривать их в качестве эффективных сорбентов в отношении металлов. Каррагинан по всем параметрам сорбционной активности значительно уступает другим некрахмальным полисахаридам. Оценка металл-связывающей активности пектинов и альгинатов показала, что для связывания большинства металлов наиболее эффективны натриевые формы этих полисахаридов — альгинат натрия и пектин со степенью этерификации 1%.

Введение

в молекулу ионов кальция, конкурирующего за активные центры полимера, значительно снижает активность полисахаридов, что проявляется уменьшением значений коэффициентов сорбции. Как было отмечено выше, исключением является взаимодействие полисахаридов с ионами стронцияи ртути. Степень этерификации пектинов также является фактором, определяющим их металл-связывающую способность. Наличие метальных радикалов, присоединенных к карбоксильным группам остатков галактуроновой кислоты, уменьшает количество активных связывающих центров, также приводит к формированию «неполноценных» связывающих центров, состоящих не из четырех карбоксильных групп, а трех, или даже двух, что в итоге проявляется снижением выраженности аффинитета.

В результате проведенных исследований был сделан вывод о том, что наиболее активными в отношении ионов двухвалентных металлов являются-альгинат натрия и пектин со степенью этерификации около 1%.

Глава IV.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ С МЕТАЛЛАМИ В.

УСЛОВИЯХ IN VIVO.

Тяжелые металлы в виде солей всегда находятся в окружающем воздухе, накапливаются в почвах [Nadal М. et al., 2004], присутствуют в водных источниках [Harada М., 1995], содержаться в предметах обихода [Fisher A.A., Le Coutuer D.G., 2000; Su M. et al., 2002]. Вследствие этого жители развитых промышленных стран, в особенности урбанизированных районов, постоянно подвергаются воздействию тяжелых металлов, которые попадают в организм через органы дыхания (ингаляционный путь), желудочно-кишечный тракт (энтеральный путь) и кожные покровы. Одним из путей эффективного решения проблемы токсического воздействия тяжелых металлов на организм жителей промышленных районов является поиск средств, препятствующих проникновению ионов металлов во внутренние среды организма, а также способствующих их эффективному выведению через желудочно-кишечный тракт и мочевыделительную систему.

Некрахмальные полисахариды обладают способностью связывать и удерживать ионы тяжелых металлов за счет образования ковалентных и водородных связей. Наибольшая связывающая активность некрахмальных полисахаридов проявляется в среде, кислотность которой близка к таковой тонкого кишечника. Таким образом, нахождение некрахмальных полисахаридов в просвете кишечника может препятствовать абсорбции тяжелых металлов в кровь, а также ускорять их выведение из организма через пищеварительный тракт.

Оценку металлсвязывающей способности некрахмальных полисахаридов в условиях in vivo проводили на модели энтеральной свинцовой интоксикации у белых беспородных крыс.

4.1. Влияние некрахмальных полисахаридовна абсорбцию свинца в кишечнике.

Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150−200 г. Крыс рандомизировали на группы в соответствии с изучаемыми полисахаридами. Первая группа — контрольная, получала обычную диету. Вторую группу составили животные, которым энтерально с помощью металлического зонда вводили ацетат свинца в дозе 50 г/кг массы тела один раз в сутки. Остальные животные входили в опытные группы, которым за 40−60 мин до введения ацетата свинца также энтерально вводили один из полисахаридов в виде раствора или суспензии в дозах 0,1 г/кг или 0,5 г/кг массы тела. Эксперимент продолжали в течение 18 дней при использовании полисахаридов в дозе 0,1 г/кг и 21 день при использовании полисахаридов в дозе 0,5 г/кг. По истечении этих сроков животных декапитировали под легким эфирным наркозом. Навески органов массой около 500 мг высушивали в термостате при температуре 60−80°С в течение суток и определяли содержание свинца.

Ниже приведены результаты определения количества депонированного свинца в печени, сердце, почках и бедренной кости у крыс, в кишечнике которых ацетат свинца и исследованные полисахариды находились одновременно и в одинаковых условиях. Полученные результаты позволяют судить об эффективности некрахмальных полисахаридов в условиях in vivo и сопоставить ее с выраженностью сорбционной активности в in vitro условиях.

В печени за 18 и 21 день эксперимента концентрация свинца увеличилась с 3,6 ± 0,6 мкг/г сухой ткани до 12,4 ± 1,8 мкг/г и с 4,2 ± 0,8 мкг/г до 14,8 ±1,7 мкг/г, соответственно. Таким образом, концентрация свинца увеличилась в среднем в 3,4 и 3,5 раза, соответственно. При одновременном введении ацетата свинца и альгината кальция в дозе 0,1 г/кг концентрация свинца в печени увеличилась только в 2,2 раза, а в дозе 0,5 г/кг — только 1,5 раза. Уменьшение концентрации свинца в группах «ацетат свинца + альгинат кальция» статистически достоверно по сравнению с животными группы «ацетат свинца». В результате одновременного введения ацетата свинца и деэтерифицированного пектина в дозе 0,1 г/кг концентрация свинца в печени увеличилась в 2,0 раза, а в дозе 0,5 г/кг — в 1,4 раза. Различия в концентрации свинца в группах «ацетат свинца» и «ацетат свинца + деэтерифицированный пектин» статистически достоверны. Вследствие введения ацетата свинца и пектата кальция в дозе 0,1 г/кг депонирование свинца в печени возросло в 2,1 раза по сравнению с контрольной группой. Применение пектата кальция в дозе 0,5 г/кг привело к накоплению свинца в 1,4 раза по сравнению с контролем. Снижение депонирования свинца по сравнению с нелеченными животными статистически достоверны. Препараты высокоэтерифицированного пектина, полифепана и активированного угля в дозах 0,1 и 0,5 г/кг не уменьшали накопление свинца в печени (табл. 8 и 9).

В сердце за период эксперимента концентрация свинца увеличилась с 8,9 ±1,4 мкг/г сухой ткани до 26,3 ± 3,1 мкг/г и с 10,0 ±1,6 мкг/г до 28,2 ± 2,9 мкг/г в экспериментах с использованной дозой полисахаридов 0,1 и 0,5 г/кг, соответственно. Таким образом, накопление свинца в сердце увеличилось в среднем в 3,0 и 2,8 раза, соответственно. В группе животных, которым одновременно с ацетатом свинца вводили альгинат кальция в дозе 0,1 г/кг концентрация свинца увеличилась только в 1,8 раза, а при использовании альгината кальция в дозе 0,5 г/кг — только в 1,2 раза. Уменьшение накопления свинца в сердце после применения альгината кальция является статистически достоверным. После введения ацетата свинца с деэтерифицированным пектином в дозе 0,1 г/кг концентрация свинца в сердце увеличилась в 1,9 раза, а после введения пектина в дозе 0,5 г/кг-в 1,5 раза. Различия в концентрации свинца в группах «ацетат свинца» и «ацетат свинца + деэтерифицированный пектин» достоверны.

Введение

ацетата свинца одновременно с пектатом кальция в дозе 0,1 г/кг привело к накоплению свинца в сердце в 1,6 раза превышающем контрольные поаказтели, а после введения пектата кальция в дозе 0,5 г/кг — в 1,5 раза. Увеличение в концентрации свинца в обеих группах было статистически достоверным. Препараты высокоэтерифицированного пектина, полифепана и активированного угля в дозах 0,1 и 0,5 г/кг не влияли на депонирование свинца в сердце лабораторных животных (табл. 8 и 9).

В почках за период эксперимента концентрация свинца увеличилась с 10,7 ± 2,6 мкг/г сухой ткани до 60,9 ± 8,4 мкг/г и с 12,2 ± 2,4 мкг/г до 64,3 ± 7,2 мкг/г в экспериментах с использованными дозами 0,1 и 0,5 г/кг, соответственно. Таким образом, концентрация свинца увеличилась в среднем в 5,7 и 5,3 раза.

Введение

ацетата свинца на фоне использования альгината кальция в дозе 0,1 г/кг привело к повышению уровня свинца в сердце в 4,0 раза. Применение альгината кальция в дозе 0,5 г/кг привело к накоплению свинца в сердце в 2,4 раза превышающему контрольные значения. Различия в концентрации свинца в группах «ацетат свинца» и «ацетат свинца + альгинат кальция» статистически достоверны только при сравнении параметров группы, получавшей дозу альгината 0,5 г/кг. После введения ацетата свинца одновременно с деэтерифицированным пектином в дозе 0,1 г/кг концентрация свинца в сердце увеличилась в 5,1 раза. Применение деэтерифицированного пектина в дозе 0,5 г/кг привело к увеличению содержания свинца в сердце в 1,8 раза. Статистически достоверным было расценено уменьшение накопления свинца в сердце животных, получавших 0,5 г/кг деэтерифицированного пектина.

Введение

ацетата свинца с пектатом кальция в дозе 0,1 г/кг привело к увеличению содержания в сердце металла в 4,4 раза, в то время как пектат кальция в дозе 0,5 г/кг способствовал тому, что количество свинца в сердце составило 220% от показателей контроля, что расценивалось как статистически значимое различие по сравнению с другими группами. Препараты высокоэтерифицированного пектина, полифепана, и активированного угля в обеих исследованных дозах не изменяли интенсивность накопления свинца в почках (табл. 8 и 9).

В бедренной кости за 18 и 21 день эксперимента концентрация свинца увеличилась значительно: с 34,8 ± 4,6 мкг/г сухой ткани до 364,7 ± 43,7 мкг/г в эксперименте с дозой 0,1 г/кг и с 34,8 ± 4,6 мкг/г до 377,2 ± 46,3 мкг/г в эксперименте с дозой 0,5 г/кг. Таким образом, концентрация свинца увеличилась в среднем в 10,5 и 10,8 раза, соответственно. В группе животных, которым вводили ацетат свинца вместе с альгинатом кальция в дозе 0,1 г/кг концентрация свинца в бедренной кости увеличилась в 8,6 раза. Использование дозы альгината кальция 0,5 г/кг привело к увеличению концентрации свинца всего лишь в 3,8 раза. Достоверными были различия между группой животных, получавших альгинат в большей дозе, и нелеченными животными. После введения ацетата свинца с деэтерифицированным пектином в дозе 0,1 г/кг концентрация свинца увеличилась в 7,5 раза. 0,5 г/кг деэтерифицированного пектина введенного вместе с ацетатом свинца привело к увеличению содержания свинца в бедренной кости в 4,5 раза. Различия в концентрации свинца в группах «ацетат свинца» и «ацетат свинца + деэтерифицированный пектин» достоверны при применении обеих.