Теоретическое и научно-методическое обоснование использования белковых фракций чумного микроба при создании новых диагностических препаратов и тест-систем

Актуальность проблемы. Существующие природные очаги чумы обусловливают необходимость систематического контроля за степенью их активности и характером эпизоотического проявления. Без этих данных невозможно осуществление эффективного эпиднадзора и предупреждение заболеваемости людей чумой. Помимо этого, особое значение приобрела проблема биотерроризма, которая диктует необходимость совершенствования методов экспресс-диагностики для работы в обычных условиях и чрезвычайных ситуациях в лабораториях СПЭБ и CHJIK.

Для проведения эпизоотологического контроля и работы в чрезвычайных ситуациях необходимо располагать набором по возможности методически простых, но высокочувствительных и высокоспецифичных методов лабораторной диагностики. Одно из направлений, позволяющее решать эти вопросы, связано с изучением и совершенствованием диагностики и индикации чумного микроба, анализ состава и структуры антигенов которого помогает проводить внутривидовую дифференциацию штаммов, совершенствовать серодиагностику чумы (Вейнблат В.И., 1974; Канатов Ю. В., 1974; Леви М. И., 1985; Анисимов П. И. с соавт., 1986; Анисимов А. П. с соавт., 1992; Щербаков A.A., 1991 и др.). В то же время необходимо проведение дальнейших исследований, направленных на изучение белковых биополимеров возбудителя чумы, определяющих видоспецифичность возбудителя.

Хотя первые работы, посвященные иммунохимическому анализу биополимеров чумного микроба в реакции иммунодиффузии (Пустовалов B.JI. с соавт., 1962; Lawton W.D. et al., I960 и др.) и физико-химическому анализу в диск-электрофорезе (Hudson B.W. et al., 1970 и др.), появились относительно давно, до настоящего времени четко не определена дальнейшая перспектива использования этих методов для лабораторной диагностики чумы. Очевидно, что необходимо продолжить изучение структуры и свойств биополимеров с помощью современных методов иммунохимического и физико-химического анализа.

С помощью серологической диагностики выявляют природные очаги чумы и устанавливают их границы, изучают активность эпизоотического процесса, осуществляют экспресс-диагностику в чрезвычайных ситуациях. Преимущественно для этих целей до настоящего времени широко используют эритроцитарные диагно-стикумы, которые во многом оправдали себя (Канатов Ю.В., 1974; Кузнецова К. А. и Леви М. И., 1983; Атшабар Б. Б. с со-авт., 2000 и др.).

В процессе широкого использования гемагглютинационных тестов для серодиагностики возбудителя чумы выявлены и их недостатки: нестандартность эритроцитарных диагностикумов (Леви М.И. с соавт., 1982), отсутствие абсолютной специфичности для диагностикума чумного эритроцитарного поликлональ-ного (Айманова О.Я. с соавт., 1986; Малецкая О. В. с соавт., 1986), возможность получения неспецифического результата за счет наличия в исследуемом материале протеолитических ферментов (Сучков Ю.Г. с соавт., 1984 и др.), гетероагглютини-нов (Топорков В.П. с соавт., 1980) или некоторых химических примесей (Ходаковская В.Н. с соавт., 1986).

Получение моноклональных антител (МКА) к фракции I (Ф1) дало возможность повысить специфичность гемагглютинационных тестов (Айманова О.Я. с соавт., 1986; Темиралиева Г. А. с соавт., 1986). Однако некоторые недостатки гемагглютинационных тестов, связанные с использованием эритроцитов, остались.

Одно из направлений дальнейшей оптимизации серодиагностики возбудителя чумы связано с разработкой ТИФА для обнаружения антигена как на поликлональных антителах «П» к Ф1 (Голубинский Е.П. с соавт., 1980, 1986; Рудник М. П., 1985; Дробков В. И. с соавт., 1991; Рудник М. П. с соавт., 1999 и др.), так и на МКА к Ф1 — ТИФА «М» (Леви М.И. с соавт., 1984, 1987; Коссе Л. В. 'с соавт., 1992 и др.), а также ТИФА для обнаружения противочумных антител (Венгеров Ю.Ю. с соавт., 1987; Рудник М. П. с соавт., 1999 и др.).

В настоящее время предложено уже более 10 разных вариантов ТИФА для серодиагностики чумы, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью. Несмотря на это, ТИФА редко используется в практике, что, по-видимому, связано с трудоемкостью и неэкономичностью этого метода. Очевидно, что назрела необходимость более подробного анализа целесообразности использования различных вариантов ТИФА для серодиагностики чумы.

Совершенствование диагностических препаратов и методов серодиагностики чумы определяется не только необходимостью повышения чувствительности и специфичности, но и стремлением к упрощению их постановки, что особенно важно в чрезвычайных ситуациях. Положительный опыт использования полиакролеиновых микросфер в РНСА, вместо эритроцитов в гемагглютинационных тестах (Лукин Ю.В. с соавт., 1985, 1986; Зайцев A.A. с со-авт., 1989; Рудник М. П. с соавт., 1993, 1999, 2001 и др.), дает надежду на успешное решение этих задач и определяет необходимость разработки антительных и антигенных полиакролеиновых препаратов для проведения серологического анализа на чуму. Необходимо дальнейшее изучение перспектив практического использования этих препаратов.

В связи с тем, что для серодиагностики чумы уже предложено более 20 вариантов реакций с разными диагностикумами и тест-системами, назрела необходимость в глобальном пересмотре тактики серодиагностики с выбором наиболее перспективных направлений.

К сожалению, до настоящего времени все еще слабым звеном в экспресс-диагностике чумы является серодиагностика штаммов с измененной структурой фракции I (Ф1~) .

Дальнейшего изучения требуют факторы, влияющие на условия биосинтеза Ф1 и других биополимеров, с целью оптимизации серодиагностики чумы.

Цель исследования. Изучение белковых биополимеров чумного микроба с целью теоретического и научно — методического обоснования использования их в биотехнологических процессах при создании новых диагностических иммуносуспензионных и иммуноферментных тест — систем, направленных на совершенствование экспресс-диагностики и индикации чумного микроба, а также специфических чумных иммуноглобулинов.

Основные задачи исследования:

1. Охарактеризовать методом диск-электрофореза водорастворимые и мембранные фракции белковых биополимеров чумного микроба. Определить наиболее простые и высокоинформативные методы получения и анализа протеинограмм. Изучить’перспективы применения диск-электрофореза для внутривидовой дифференциации и уточнения филогенетического положения атипичных штаммов.

2. Изучить в совокупности физико-химические и иммунохими-ческие свойства фракции I чумного микроба для объяснения целесообразности применения различных диагностических препаратов с целью серологического обнаружения этого антигена.

3. Разработать биотехнологию изготовления диагностикумов полиакролеиновых чумных иммуноглобулиновых и диагностикума полиакролеинового чумного антигенного на основе фракции I, а также способов постановки реакций с ними и ускоренных вариантов учета результатов.

4. Повысить чувствительность и демонстративность результатов иммуноферментных реакций для экспресс-диагностики чумного микроба за счет конструирования латексных магноиммуно-сорбентов в качестве твердой фазы и использования перокси-дазных иммуноферментных конъюгатов.

5. Разработать биотехнологию приготовления конъюгата фракции I чумного микроба с пероксидазой и оптимизировать схему постановки конкурентного варианта ТИФА для обнаружения капсульного антигена возбудителя чумы и его гаптена.

6. Определить перспективы применения иммуноферментных тест-систем для индикации афракционных штаммов возбудителя чумы сочетано с другими методами.

7. Проанализировать методики культивирования чумных бактерий на искусственных питательных средах с целью оптимизации биосинтеза фракции I. Усовершенствовать для этой цели и выделения чумного микроба способы постановки биологических проб.

8. Изучить перспективы применения предлагаемых диагностикумов и тест-систем для традиционного лабораторного анализа и экспресс-диагностики в условиях работы СПЭБ и СНЛК.

Научная новизна:

1. Дана сравнительная характеристика различным вариантам получения протеинограмм водорастворимых и мембранных белков чумного микроба. Представлены новые данные о составе и элек-трофоретических свойствах общих и отдельных фракций белковых биополимеров возбудителя чумы. Разработан простой и высокоинформативный метод получения протеинограмм для эпизоотоло-гического и эпидемиологического маркирования штаммов чумного микроба. На основании анализа различных вариантов протеинограмм показано, что изученные в работе «новообразованные» штаммы следует считать не псевдотуберкулезными, а атипичными чумными.

2. Представлены новые данные о физико-химических и имму-нохимических свойствах фракции I чумного микроба. На их основе дано объяснение целесообразности применения различных диагностических препаратов и тест-систем с целью иммунологического обнаружения этого антигена в прикладных микробиологических исследованиях.

3. Разработана биотехнология приготовления диагностикума полиакролеинового чумного антигенного. Приоритетность вышеизложенного подтверждается патентом на изобретение РФ «Способ получения диагностикума суспензионного чумного антигенного на основе фракции I», № 2 199 750 от 27.02.2003 г. Изучены перспективы его использования для обнаружения противочумных антител и фракции I в серологических реакциях.

4. Оптимизированы параметры и биотехнология получения диагностикумов полиакролеиновых иммуноглобулиновых на основе поли — и моноклональных антител к Ф1, приоритетность чего подтверждается патентом на изобретение РФ «Способ получения латексного диагностикума»,№ 2 012 888 от 15.05.1994 г. Разработана оригинальная методика постановки серологических реакций с ними в прикладной микробиологии, приоритетность которой подтверждена патентом на изобретение РФ «Способ постановки реакции латексной агглютинации», № 2 198 407 от 10.02.2003 г. У представленных диагностических препаратов выявлены уникальные свойства, позволяющие рекомендовать их для индикации и ускоренной идентификации в лабораториях СПЭБ и СНЛК. Приоритетность вышеизложенного подтверждена 3 патентами на изобретение РФ: «Способ серодиагностики кап-сульного антигена чумного микроба», № 2 092 852 от 10.10.1997 г., «Способ индикации бактериальных антигенов», № 2 101 356 от 10.01.1998 г. и «Способ индикации бактериальных антигенов», № 2 102 761 от 20.01.1998 г.

5. Впервые получена иммуноферментная чумная тест-система по типу двойного антительного сэндвича на основе полиакро-леиновых магноиммуносорбентов и иммуноферментного конъюга-та. Показана перспектива ее использования для обнаружения в объектах внешней среды Ф1 во взвесях Y. pestis концентрацией 1*102 — 1-Ю3 м.к./мл. (патент на изобретение РФ «Способ получения магноиммунсорбента для обнаружения бактериальных антигенов», № 2 246 968 от 27.02.2005 г.).

Разработана биотехнологическая схема приготовления тест-системы по типу двойного антительного сэндвича на основе алюмосиликатных магноиммуносорбентов и пероксидазного иммунолипосомного конъюгата. Предложено ее использовать для обнаружения в объектах внешней среды Ф1 во взвесях Y. pestis концентрацией 1−102 — 1"103 м.к./мл.

6. Разработана биотехнология приготовления тест-системы для обнаружения чумных бактерий непрямым методом. флуоресцирующих антител и определены перспективы ее применения для экспресс-диагностики.

7. Проведен сравнительный анализ чувствительности и специфичности различных иммуносуспензионных и иммуноферментных тест-систем при изучении «штаммов чумного микроба и других близкородственных микробов, суспензий внутренних органов животных, павших от чумной инфекции, а также материала из объектов внешней среды (почвы) на наличие Ф1 чумного микроба. Определена степень их экономичности и параметры практического использования.

8. Получены МКА к 43 КД антигену чумного микроба и изучены перспективы их использования для серодиагностики без-фракционных штаммов. Определена целесообразность сочетанного использования на определенных этапах исследования для экспресс-диагностики Ф1~ штаммов возбудителя чумы метода флуоресцирующих антител (МФА) и серологических методов с полиме-разной цепной реакцией (ПЦР). Предложен новый способ обнаружения чумного микроба в объектах внешней среды, защищенный патентом на изобретение РФ «Способ обнаружения чумного микроба в объектах внешней среды», № 2 149 407 от 20.05.2000 г., сочетающий усовершенствованную постановку биологической пробы с ПЦР, МФА и серологическим анализом.

9. Оптимизированы методики подращивания чумных бактерий на искусственных питательных средах с целью накопления фракции Ф1. Усовершенствован для этой цели способ постановки биологической пробы, приоритетность чего подтверждена патентом на изобретение РФ «Способ лабораторной диагностики чумы», № 2 077 591 от 20.04.1997 г. Дополнительная модификация вышеуказанного способа позволяет восстанавливать биосинтез фракции I у штаммов чумного микроба, утративших этот признак в результате фенотипической изменчивости, на что получен патент на изобретение РФ «Способ восстановления способности к биосинтезу капсульного антигена чумного микроба», № 2 155 962 от 10.09.2000 г.

Теоретическая и практическая значимость результатов исследований.

Основные результаты диссертации отражены в 2-х инструк-, тивно-методических документах федерального и 14-ти учрежденческого или регионального уровня внедрения.

1. Из различных вариантов получения протеинограмм выбран простой и высокоинформативный способ подготовки штаммов У. реБЬ1Б для диск-электрофореза и проведения его, который включен в «Методические рекомендации по внутривидовой дифференциации чумного микроба с помощью электрофореза белков» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от' 31.05.1999 г.). Предлагаемый метод имеет большие перспективы использования в качестве маркера для штаммов чумного микроба при эпизоотологическом и эпидемиологическом анализах в прикладной микробиологии.

Благодаря использованию различных вариантов диск-электрофореза уточнено филогенетическое положение некоторых «новообразованных» штаммов.

2. В «Методических рекомендациях по изучению свежевыде-ленных штаммов чумного микроба из Центрально-Кавказского природного очага чумы» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 30.05.2002 г.), «Методических рекомендациях по индикации возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва, холера) в СПЭБ и СНИК в условиях чрезвычайных ситуаций» (одобрены Ученым советом и утверждены зам. директора по научной работе СтавНИПЧИ, протокол № 2 от 27.02.2003 г.) и «Методических рекомендациях по индикации и первичной идентификации фракционных и афракционных штаммов чумного микроба в условиях работы СНЛК» (одобрены Ученым советом и утверждены зам. директора по научной работе СтавНИПЧИ, протокол № 10 от 27.11.2003 г.) предложены схемы, определяющие перспективы использования различных вариантов иммуносуспензионных диагностикумов и тест-систем ТИФА для серодиагностики чумы при эпизоотологическом обследовании и в чрезвычайных ситуациях, из которых вытекают потребности в этих диагностических препаратах. Данные схемы конкретно показывают, какие из них и по каким технологиям необходимо производить, а также наиболее целесообразно использовать в первую или во вторую очередь на разных этапах исследования и в зависимости от изучаемого материала. Оптимизация серодиагностики чумы в пределах предложенных схем позволит при экономии материальных средств на производство препаратов получать наиболее достоверные результаты.

Разработанные диагностические критерии оценки эпизоото-логической ситуации на основе сочетанности признаков по иммунологическим тестам, схема оценки и информативности методов, критерии целесообразности выбора приемов лабораторного анализа при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы включены в «Методические рекомендации по оценке информативности методов диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы» (утверждены Госкомсанэпиднад-зором РФ в 1995 г.).

3. Разработанные и усовершенствованные способы приготовления диагностических препаратов использованы при составлении «Методических рекомендаций по получению и контролю диаг-ностикума суспензионного чумного моноклонального сухого к Ф1 антигену возбудителя чумы (одобрены Ученым советом и утверждены директором Института биомедицинской технологии, г.

Москва, протокол № 13 от 13.09.1988 г.), «Инструкции по изготовлению и контролю диагностикума суспензионного чумного моноклонального сухого к Ф1-антигену возбудителя чумы» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 11.05.1989 г.), «Регламента производства, ФСП и инструкции по применению на диагностикум полиакролеи-новый чумной иммуноглобулиновый жидкий» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 8 от 26.09.2002 г.), «Инструкции по изготовлению и контролю тест-системы диагностической для определения возбудителей чумы, сапа, мелиоидоза, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы непрямым иммунофлуоресцентным методом (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 13 от 23.11.1990 г.), «Регламента производства, ФСП и инструкции по применению на тест-систему иммуноферментную липосомальную для выявления возбудителя чумы с помощью магноиммуносорбен-тов» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 27.05.2005 г.), «Методических рекомендаций по иммобилизации в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом» (утверждены первым заместителем министра здравоохранения РФ, главным государственным санитарным врачем России Г. Г. Они-щенко 06.04. 2002 г.).

Оптимизированные способы постановки серологических реакций отражены в «Методических рекомендациях по применению диагностикума чумного полиакролеинового иммуноглобулинового (поликлонального) в серологических реакциях» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 30.05.1994 г.) и «Методических рекомендациях по ускоренному учету РИГА при поиске капсульного антигена чумного микроба» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 7 от 26.09.1997 г.).

4. Усовершенствованные способы подготовки материала через биопробу для серологического исследования использованы в «Методических рекомендациях по раннему выделению и идентификации возбудителя чумы из объектов, содержащих единичные клетки этого микроба» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 2 от 26.02.1993 г.), «Методических рекомендациях по раннему выявлению и идентификации возбудителя чумы с измененными свойствами» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 12 от 28.12.1998 г.) и «Методических рекомендациях по обнаружению афракционных штаммов чумного микроба в организме лабораторных животных» (одобрены Ученым советом и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 20.05.2003 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Научно — методическое обоснование применения различных вариантов диск-электрофореза для изучения белковых биополимеров чумного микроба и использования его для дифференциальной диагностики штаммов.

2. Методические приемы конструирования суспензионных, иммуноферментных и иммунофлуоресцентных диагностикумов и тест — систем, обеспечивающих высокую эффективность обнаружения капсульного антигена (Ф1) возбудителя чумы и антител к нему в экспериментальных и полевых условиях.

3. Научно — методические основы биотехнологии изготовления твердофазных микрогранулированных композиционных аффинных полиакролеиновых магносорбентов для избирательного концентрирования чумного микроба и его капсульного антигена с последующим определением в экспрессных методах (ТИФА, количественном иммунофлуоресцентным анализе — КИФА, ПЦР).

4. Методические подходы совершенствования способов подготовки материала, содержащего чумной микроб для последующего изучения серологическими и иммунолюминесцентными методами.

5. Научно — методическое обоснование использования им-муносуспензионных, иммуноферментных и иммунофлуоресцентных диагностикумов и тест — систем на этапах индикации и идентификации чумного микроба в полевых условиях и условиях работы СПЭБ и СНЛК.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции «Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций» (Ставрополь, 1986) — на научной конференции «Моноклональные антитела в изучении и диагностике природноочаговых заболеваний» (Ростов-на-Дону, 1989) — на Российской научной конференции «Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций» (Саратов, 1993) — на научно-практической конференции «60 лет противочумной службы Кавказа» (Ставрополь, 1995) — на научно-практической конференции, посвященной 75-летию санэпидслужбы России «Здоровье населения и среда обитания» (Ставрополь, 1997) — научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997) — на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ «Диагностика, лечение, профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария» (Киров, 1998) — на региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы особо опасных инфекций» (Нальчик, 2000) — на научно-практической конференции «Противоэпидемическое обеспечение населения в условиях возникновения чрезвычайных ситуаций в Северо-Кавказском регионе» (Ставрополь, 2001) — на межлабораторных конференциях Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (Ставрополь, 2004, 2005).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 44 опубликованных научных работах «(в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК — 5 статей, депонированных — 15 статей, в 10 патентах РФ на изобретения, в иностранных журналах — 4 публикации).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, б глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 274 работы отечественных и 41 работу зарубежных авторов, практических рекомендаций. Работа изложена на 343 страницах компьютерного текста, содержит 26 таблиц и 79 рисунков .

288 ВЫВОДЫ.

1. Протеинограммы водорастворимых и мембранных белков чумных микробов, культивируемых при фиксированной температуре (б, 28, 37°С), являются характерным и стабильным признаком для каждого штамма. Спектр белковых биополимеров, изолированных из клеток возбудителя чумы, может насчитывать свыше 4 0 зон при диск-электрофорезе в 7−10% полиакриламидном геле в присутствии 0,1% доду-цилсульфата натрия, что позволяет его использовать для изучения внутривидовой изменчивости штаммов и в качестве эпидемиологического и эпизоотологического маркеров.

2. Сочетанное применение диск-электрофореза белков микроорганизмов и иммунохимического анализа водно-солевых экстрактов бактерий в реакции иммунодиффузии в агаре позволило установить чумную природу 8 изученных «новообразованных» штаммов, отдифференцировав их от близкородственных псевдотуберкулезных.

3. Использование эритроцитарных и латексных полии моноклональных иммуноглобулиновых диагностикумов к фракции I чумного микроба в иммуносуспензионных реакциях позволяет эффективно обнаруживать в штаммах и объектах внешней среды нативный капсульный антиген (Ф1) возбудителя чумы с подтверждением специфичности результата в реакциях торможения. В случаях необходимости уточнения специфичности результата целесообразно использовать твердофазный иммуноферментный анализ и реакцию нейтрализации антител.

Подверженная обработке кипячением фракция I чумного микроба диссоциирует на отдельные олигомеры, обнаружить которые удается только в реакциях нейтрализации антител и твердофазном иммуноферментном анализе.

4. Впервые разработана биотехнология приготовления диагностикума суспензионного чумного антигенного путем сенсибилизации при комнатной температуре 100 мг окрашенных пиронином — Г полиакролеиновых микросфер размером 1,2−1,8 мкм 0,1−0,3 мг фракцией I в течение 3 ч при рН 7,0−7,4, с последующим прогреванием смеси до 70−80°С и дополнительным перемешиванием в течение 30−40 мин, и отделением несвязавшихся биополимеров центрифугированием. Полученный диагностикум в реакции непрямой суспензионной агглютинации на стекле выявляет высокоаффинные антитела к фракции I чумного микроба в течение 2−5 мин.

5. Конъюгация 5 мг фермента пероксидазы с равным количеством прогретой при 70−80°С в течение 30−40 мин фракцией I чумного микроба обеспечивает получение стабильного препарата с рабочим разведением до 1:2000, сохраняющим свои свойства после лиофилизации свыше 1,5 лет. В конкурентном варианте твердофазного иммунофер-ментного анализа полученный конъюгат позволяет выявлять 20−40 нг/мл фракции I и ее гаптена или 1″ 10б-1'107 м.к./мл чумного микроба.

6. Разработана биотехнология получения диагностикумов суспензионных чумных иммуноглобулиновых путем сенсибилизации 1 мл 5% взвеси полиакролеиновых частиц 150 мкг полиили моноклональных антител к фракции I чумного микроба. Для обеспечения стабильности препарата после ковалентной фиксации на носителе специфических иммуноглобулинов препарат обрабатывали 2,5% раствором инертно— го протеина (альбумина). Консервирование диагностикума осуществляли 1% формалином или азидом натрия в конечной концентрации 1:500, а также путем лиофильного высушивания. Диагностикум сохранял свою специфическую активность в течение 1 года (срок наблюдения). Чувствительность отдельных серий препаратов позволяла обнаруживать чумной микроб в концентрации 31,2 тыс. — 312 тыс. м.к./мл или 0,6−2,5 нг/мл фракции I чумного микроба.

7. Оптимизирована биотехнология постановки серологических реакций макрои микрометодом с полиакролеиновы-ми чумными антительными и антигенными диагностикумами, обеспечивающая стабильность и воспроизводимость результатов. Для этого следует использовать впервые разработанную разводящую жидкость, состоящую из 0,05 М фосфатного — солевого буфера рН 7,0−7,4, содержащую неполный гидролизат белка куриного яйца в разведении 1:50−1:100 и неионный детергент твин-8 0 в конечной концентрации 1:50 000−1:100 000. Для ускорения времени учета серологических реакций при вывлении фракции I чумного микроба целесообразно использовать малое увеличение светового микроскопа для определения формирования латексного агг-лютината в течение 5−25 мин или лазерный денситометр, при прохождении луча которого через слой полиакролеино-вых частиц начало их конгломерации можно наблюдать через 1−2 мин от времени постановки реакции.

8. Биотехнология получения магнитных иммуносорбентных частиц путем включения оксида железа в полиакролеиновые микросферы с последующей сенсибилизацией их чумными иммуноглобулинами к фракции I обеспечила получение магни-тоуправляемого диагностикума, способного фиксировать на своей поверхности капсульный антиген и клетки возбудителя чумы, находящиеся в нестерильной почве. После удаления несвязавшихся с магноиммуносорбентами посторонних частиц и биополимеров путем сепарации микросфер с помощью магнитного поля возбудитель чумы обнаруживался в иммуноферментном анализе с чувствительностью 1″ 102−1″ 103 м.к./мл.

9. Для повышения чувствительности иммунофлуоресцирующей тест-системы, с целью выявления в мазках клеток чумного микроба, их последовательно обрабатывают кроличьей сывороткой к фракции I чумного микроба в разведении 1:100−1:200, инкубируют 20−30 мин, промывают, и прокрашивают люминесцирующими антивидовыми (антикроличьими) бараньими иммуноглобулинами в рабочем разведении в течение 20−30 мин. Такая диагностическая люминес-цирующая тест-система позволяет специфически обнаруживать только чумной микроб в концентрации 1″ 106−1″ 107 м.к./мл.

10. Методом гибридомной технологии впервые получены моноклональные антитела к белковому антигену возбудителя чумы с мол. массой 43 КД. Показано, что последний имеет одинаковое строение у чумного и псевдотуберкулезного микробов независимо от температуры выращивания, но отличается от схожего по строению антигена возбудителя кишечного иерсиниоза. Исследуемый антиген стабильно выявлялся у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов с использованием моноклональных антител в непрямом методе флуоресцирующих антител и твердофазном иммуноферментном анализе с пероксидазными и пенициллиназными конъюгатами.

11. Определены различные параметры культивирования чумного микроба на жидких и плотных питательных средах с целью максимального накопления фракции I и установлена оптимальная температура для этих целей в 37 °C.

Для совершенствования микробиологического анализа впервые разработана схема постановки биологического метода, позволяющая восстанавливать биосинтез фракции I у штаммов чумного микроба, утративших его в результате фенотипической изменчивости, а также способ постановки биологической пробы, позволяющий в течение 24−48 ч накапливать в зараженном животном единичные клетки чумного микроба, включая слабовирулентные, до количества, достаточного для их обнаружения в различных серологических реакциях и методом полимеразной цепной реакции.

12. Разработанный алгоритм использования коммерче—ских чумных диагностических препаратов, а также диагно-стикумов и тест-систем, полученных в ходе выполнения диссертационной работы, и предложенных приемов постановки биологического метода, позволяет достоверно выявлять в различных объектах внешней среды в минимальной концентрации чумной микроб, имеющий различный антигенный состав и степень вирулентности в лабораториях специализированных противоэпидемических бригад и сети наблюдения и лабораторного контроля.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Проведенные нами исследования показали, что чумной микроб синтезирует в препаративных количествах не менее 27 нативных белковых биополимеров. Это установлено путем сочетанного последовательного применения гель-фильтрации и диск-электрофореза.

Согласно полученным данным, большое значение имеет метод применяемый для изучения белковых протеинограмм. Использование для этих целей методики B.W. Hudson et al. (1970), в основе которой лежит экстракция водорастворимых белков из ацетоновых порошков и проведение электрофореза по B.J. Davis (1964), позволило нам на протеинограммах обнаруживать до 7−8 мажорных и дополнительно несколько минорных белковых зон, что, в принципе, согласуется с их данными. В то же время, по нашему мнению, от метода постановки диск-электрофореза в трубочках, предложенного B.W. Hudson et al. (1970) и использованного в последующих работах для сравнительного изучения протеинограмм разных штаммов возбудителя чумы (Hudson B.W. et al., 1973; 1975; 1976 и др.), в настоящее время следует отказаться. Дело в том, что при проведении диск-электрофореза в трубочках трудно создать идентичные условия для каждой пробы (штамма). Поэтому такой анализ необходимо проводить только в пластинчатых ПААГ.

Дополнительное использование 1% ДСНа для обработки проб и 0,1% ДСНа в ПААГ при проведении диск-электрофореза позволило нам оптимизировать эту методику. После такой обработки на пластинах полиакриламидно-го геля четко прокрашивалось до 16−18 белковых зон, что значительно повысило вероятность выявления различий между штаммами и субкультурами. Несмотря на это, данный метод не получил широкого практического использования. Дело в том, что высушивание бактериальных клеток ацетоном и последующая экстракция водорастворимых белков занимает много времени с учетом работы с соблюдением противоэпидемического режима (в среднем 1 месяц). Поэтому этот трудоемкий метод был заменен на простой и быстро воспроизводимый, где обработку взвесей микробных клеток проводили в присутствии 1% ДСНа на кипящей водяной бане. После 20−30 мин такой обработки обеззараженные пробы были пригодны для исследования в ПААГ с 0,1% ДСНа. В результате на протеинограммах четко прокрашивалось 30 — 40 и более белковых зон. Этот метод позволяет одновременно проводить сравнительный анализ по водорастворимым и мембранным белкам, что повышает вероятность выявления различий между штаммами возбудителя чумы. Поэтому мы считаем, что этому методу следует отдать предпочтение при первичном анализе протеинограмм.

Проведенные исследования показали, что в одних случаях различия между штаммами могут лучше выявляться при проведении диск-электрофореза в нативных условиях, а в других — в денатурирующих условиях. Следовательно, нужно не противопоставлять разные методы диск-электрофореза друг другу, а использовать их в зависимости от цели исследования.

В процессе работы установлено, что температурный фактор существенно влияет на биосинтез биополимеров и соответственно структуры протеинограмм, полученных в нативных и денатурирующих условиях. Особенно четко такие различия видны при культивировании взвесей микробных клеток чумного микроба соответственно при б, 28 и 37 °C. Поэтому при подготовке взвесей для электрофореза следует четко придерживаться только одного температурного режима.

Согласно полученным нами данным, протеинограмма является характерным и стабильным признаком для штамма чумного микроба по типу «отпечатков пальцев». Основные характерные черты у протеинограмм могут сохраняться даже при изменении некоторых биохимических свойств у субкультур. Поэтому мы считаем, что использование протеинограмм в качестве эпидемиологического и эпизоотологического маркеров имеет большие перспективы при эпизо-отологическом обследовании и в условиях работы CHJIK.

Применение метода диск-электрофореза позволило нам уточнить таксономическое положение у группы атипичных штаммов возбудителя чумы. В процессе изменчивости эти штаммы утеряли часть признаков, характерных для чумного микроба и наоборот приобрели признаки, типичные для возбудителя псевдотуберкулеза (Михайлова P.C. с соавт., 1966 и др.). По мнению H.H. Жукова-Вережникова с соавт. (1963), Г. Н. Ленской (1946), P.C. Михайловой с соавт. (1976) и др., селекция таких и подобных «новообразованных» или «псевдотуберкулезоподобных» штаммов указывает на переход чумного микроба в псевдотуберкулезный. Но Л. Н. Классовский и Ю. Г. Сучков (1982) считают, что такая видообразующая изменчивость противоречит эволюционному учению. Постановка разных вариантов диск-электрофореза показала, что протеиновые профили у изученных нами 8 «новообразованных» штаммов оказались практически одинаковыми и соответствовали протеинограм-мам исходного 28 °C штамма чумного микроба ЕВ, но существенно отличались от протеинограмм псевдотуберкулезного микроба (I-VI сер.). Следовательно, в данном случае не может идти речь о видообразующей изменчивости, а изученные «новообразованные» штаммы следует признать атипичными чумными, но не псевдотуберкулезными.

В основном различия между чумными протеинограммами имеют место не в количестве белковых зон, а в интенсивности их окраски у разных штаммов. Чем контрастнее различия в интенсивности окраски отдельных белковых зон у разных штаммов, тем проще дифференциальная диагностика между ними.

Особое место в изучении белков чумного микроба занимает их иммунохимический анализ. Наиболее четкий анализ в РИД обычно проводится по 6−8 зонам преципитата. Для оптимального выявления различий между штаммами РИД следует ставить с 3−4 разными антисыворотками и не брать одновременно более 2−3 штаммов.

Для сравнения методом диск-электрофореза в одной пластине ПААГ четкий дифференциальный анализ можно проводить одновременно с 10−20 штаммами по 30−40 и более белковым зонам. Хотя РИД уступает диск-электрофорезу по информативности, целесообразно использовать их сочетан-но для получения наиболее полной информации, необходимой для эпидемиологической и эпизоотологической маркировки штаммов.

Из всех белковых биополимеров чумного микроба наибольший интерес для физико-химического и иммунохимиче-ского анализов представляет капсульный антиген — фракция I. Биополимеры Ф1 синтезируются в достаточно большом количестве, составляя 10−15% от всей массы водорастворимых белков, видоспецифичны, серологически активны и т. д.

Проведенные нами исследования позволяют утверждать, что для обнаружения нативного капсульного антигена (Ф1) чумного микроба с мол. массой от 500 до 3000 КД наиболее целесообразно ставить РИГА или РНСА с эритроцитар-ными или латексными полиили моноклональными диагно-стикумами, с подтверждением специфичности результата в реакциях торможения. Двухкомпонентные иммуносуспензион-ные реакции проще в постановке, чем иммуноферментные или аналогичные трехкомпонентные, и имеют более высокую чувствительность по сравнению с последними, что обусловлено большей стабильностью антительных диагностику-мов по сравнению с иммуносуспензионными антигенными.

Через 1 ч после термической обработки в дистиллированной воде фракция I представляет собой набор из 6−8 олигомеров с молекулярной массой 18 КД и более. Ее серологическая активность снижается, примерно, в 8−16 раз в РНАт и конкурентном варианте ТИФА. В других реакциях она не выявляется.

В процессе реассоциации через 18 ч в пробе насчитывается уже более 20 олигомеров, а на 14 сутки практически отсутствуют мономеры и преобладают крупные олигоме-ры с молекулярной массой около 150−500 КД, но не происходит восстановления физико-химической структуры, характерной для нативного капсульного антигена (Ф1). Процесс реассоциации «плавленого» антигена сопровождается повышением его серологической активности в РНАт и конкурентном варианте ТИФА в 2−4 раза, а также восстановлением иммунологической активности в «сэндвич» варианте ТИФА до титра, примерно, соответствующего РНАт.

После кипячения в присутствии 1% ДСНа и 1% р-меркаптоэтанола нативный капсульный антиген диссоциирует в мономер, который обнаруживается только в РНАт и конкурентном варианте ТИФА. Этот процесс сопровождается снижением серологической активности «плавленого» антигена в 300 раз. В случае кипячения фракции I в присутствии только 1% ДСНа она диссоциирует в мономер с молекулярной массой около 18 КД и олигомер с молекулярной массой около 80 КД, что сопровождается снижением серологической активности антигена в 100−200 раз. В присутствии 1% ДСНа, а тем более дополнительно 1% Р~ меркаптоэтанола, частичного восстановления серологической активности капсульного антигена не наблюдается.

Согласно полученным данным, высокая серологическая активность в иммуносуспензионных и иммуноферментных реакциях обусловлена преимущественно свободным капсульным антигеном, а не микробными клетками. Мы это объясняем тем, что биополимеры Ф1 не прочно связаны с клеточной стенкой и после биосинтеза легко отделяются от клеток.

Замена эритроцитов на полиакролеиновые микросферы позволила приготовить и запатентовать принципиально новые иммуноглобулиновые диагностические препараты для серодиагностики чумы (пат. 2 012 888 Россия, 1994; пат. 2 199 750 Россия, 2003). Разработана биотехнология получения диагностикумов суспензионных чумных иммуноглобу-линовых путем сенсибилизации 1 мл 5% взвеси полиакро-леиновых частиц 150 мкг полиили моноклональных антител к фракции I чумного микроба. Для обеспечения стабильности диагностикума после ковалентной фиксации на носитель специфических иммуноглобулинов препарат обрабатывали 2,5% раствором инертного протеина. Консервирование диагностикума осуществляли 1% формалином или азидом натрия в конечной концентрации 1:500, а также путем лиофильного высушивания. Диагностикум сохранял свою специфическую активность в течение 1 года (срок наблюдения). Чувствительность отдельных серий препаратов позволяла обнаруживать чумной микроб в концентрации 31,2 — 312 тыс. м.к./мл или 0,6−2,5 нг/мл фракции I чумного микроба.

Оптимизированы методики постановки реакций с латекс-ными диагностикумами в микрои макрообъемах. Положительный эффект достигается благодаря использованию в качестве разводящей жидкости ФСБ рН 7,2, дополнительно содержащего неполный гидролизат белка куриного яйца 1:50−1:100 и неионный детергент твин-80 1:500 001:100000. Получен патент на способ приготовления разводящей жидкости для постановки этих серологических реакций (пат. 2 198 407 Россия, 2003), который отмечен Дипломом от VI международного салона промышленной собственности «Архимед-2003».

Проведенные испытания показали, что латексные диаг-ностикумы в РНСА не уступают по чувствительности аналогичным эритроцитарным диагностикумам в РИГА при обнаружении капсульного антигена во взвесях микробных клеток и суспензиях внутренних органов, а также в трехкомпо-нентных реакциях не уступают РНАг при исследовании сывороток на наличие противочумных антител. В то же время, полиакролеиновые чумные иммуноглобулиновые диагно-стикумы имеют преимущества перед аналогичными эритроци-тарными, т.к. позволяют четко проводить экспресс-диагностику в объемном методе РНСА в течение 5−2 5 мин по феномену агглютината под малым увеличением микроскопа (пат. 2 092 852 Россия, 1997) или в течение 1−2 мин путем сканирования агглютината лучом денситометра (пат. 2 101 356 Россия, 1998), что важно в условиях работы СПЭБ и СНЛК. Аналогичные феномены с эритроцитарными диагностикумами проходят либо в более поздние сроки (30−40 мин) или не так.четко.

Особого внимания заслуживает возможность постановки РНСА «П» на стекле, которую осуществляют путем смешивания 1 капли 0,2−0,3%-ной взвеси частиц латексного диаг-ностикума с 1 каплей исследуемого материала, содержащего Ф1 (взвеси микробных клеток в концентрации 1'108 -1−109 м.к./мл, суспензии внутренних органов, фильтраты проб из объектов внешней среды и т. д.). Результаты учитывают через 5−10 мин невооруженным глазом. В опытной пробе с Ф1 У. pestis наблюдается формирование четко выраженного агглютината при его отсутствии в контроле. Применение малого увеличения микроскопа позволяет более четко рассмотреть этот агглютинат и контроль.

Хотя с момента разработки первых иммуноферментных тест-систем для обнаружения фракции I прошло уже более 20 лет, ввиду трудоемкости их постановки, использования токсичных реактивов, они не получили широкого практического использования. По нашим данным, существенных различий в чувствительности между иммунофермент-ными тест-системами и иммуносуспензионными реакциями нет. Главным преимуществом иммуноферментного анализа является его высокая специфичность, превышающая таковую у иммуносуспензионных реакций. Поэтому мы рекомендуем использование разных вариантов ТИФА для подтверждения положительных результатов иммуносуспензионных реакций, что бывает особенно важно при исследовании погадок, загнивших трупов животных, сильно загрязненных вязких проб из объектов внешней среды, отдельных сывороток.

Особое место в серологической доктрине следует отвести иммуноферментным тест-системам по типу двойного антительного сэндвича на основе магноиммуносорбентов и иммуноферментных (пероксидазных) конъюгатов. Нами разработана и запатентована биотехнология получения магнитных иммуносорбентных частиц путем включения оксида железа в полиакролеиновые микросферы с последующей сенсибилизацией их чумными иммуноглобулинами к фракции I (пат. 2 246 968 Россия, 2005).

Приготовленный магнитоуправляемый диагностикум способен фиксировать на своей поверхности капсульный антиген и клетки возбудителя чумы, находящиеся в нестерильной почве. После удаления несвязавшихся с магноиммуносорбентами посторонних частиц и биополимеров путем сепарации микросфер с помощью магнитного поля возбудитель чумы обнаруживался в иммуноферментном анализе с чувствительностью 1″ 102−1'103 м.к./мл.

Благодаря размещению МИС в специальных ловушках, через которые пропускается исследуемый супернатант пробы, за счет эффекта аффинной хроматографии наблюдается дополнительная концентрация капсульного антигена на сорбенте отчасти объясняющая высокую чувствительность данной тест-системы. Очевидна необходимость использования ее для первичной детекции Ф1 чумного микроба в объектах внешней среды в условиях работы лабораторий СПЭБ •и СНЛК.

С целью оптимизации иммунофлуоресцентного анализа чумного микроба была усовершенствована биотехнология приготовления тест-системы для непрямого метода флуоресцирующих антител. Упростить технологию получения ви-доспецифической антифракционной сыворотки удалось за счет иммунизации кроликов очищенным капсульным антигеном (Ф1) .

Для выявления в мазках клеток чумного микроба, их последовательно обрабатывают кроличьей сывороткой к фракции I чумного микроба в разведении 1:100−1:200, инкубируют 20−30 мин, промывают, и прокрашивают люминес-цирующими антивидовыми (антикроличьими) бараньими иммуноглобулинами в" рабочем разведении в течение 20−30 мин. Такая диагностическая люминесцирующая тест-система позволяет специфически обнаруживать только чумной микроб в концентрации 1″ 106−1″ 107 м.к./мл.

Нами разработаны и утверждены зам. директора по научной работе СтавНИПЧИ: «Методические рекомендации по индикации возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва, холера) в СПЭБ и СНЛК в условиях чрезвычайных ситуаций» (Ставрополь, 2003), в которых предложена схема наиболее целесообразного использования различных диагностикумов и тест-систем для обнаружения капсульного антигена при проведении специфической индикации на чуму. Она содержит 5 основных стадий анализа, включает постановку ПЦР и проведение бактериологического анализа (табл.25).

По нашему мнению, в основе специфической индикации чумы в настоящее время по-прежнему остаются сертифицированные чумные антительные эритроцитарные и иммунолю-минесцирующие диагностикумы. Экспериментальные серии латексных иммуноглобулиновых диагностикумов предлагаются в качестве дополнительного теста и в перспективе могут придти на замену эритроцитарным. Сертифицированные и экспериментальные серии иммуноферментных тест-систем, включая магноиммуносорбентные, в настоящее время и, по-видимому, отдаленной перспективе будут применяться в качестве дополняющих методов для подтверждения специфичности результата, или при невозможности исследования материала иммуносуспензонными методами.

Очевидно, что оптимизация серодиагностики чумы зависит и от совершенствования методик, позволяющих в короткие сроки накапливать большое количество искомого антигена. Поэтому особое место в работе отведено оптимизации условий биосинтеза фракции I.

Проведенные исследования показали, что нет необходимости в увеличении времени подращивания бактерий чумы при 37 °C до трех и более сутокповышении температуры выращивания до 38,5°Сприменении последовательного культивирования: сначала при 28 °C, а затем при 37 °C. Культивирование чумного микроба для серологического анализа достаточно вести при 37 °C в течение 2 суток на агаре или бульоне Хоттингера рН 7,2 с 1% гемолизирован-ной крови.