Состояние системы никотинамидных коферментов в условиях комбинированного воздействия хлор-и фосфорорганических пестицидов (кельтана, фосфамида)

Актуальность проблемы. Многолетнее широкое применение химических средств защиты растений создало реальные условия для проникновения в организм человека и животных ряда пестицидов, которые, благодаря своим токсикологическим особенностям (токсичность, способность к кумуляции в организме и накоплению в окружающей среде, политропность действия и др.), представляют опасность для здоровья человека. Для понимания генеза патологических процессов, возникающих под влиянием пестицидов и создания на этой основе рациональной профилактики и терапии, важно знать механизмы, определяющие их токсическое действие на организм теплокровных.

В сельском хозяйстве страны, в частности ГССР, в настоящее время наиболее широко црименяются хлорорганический пестицид — кельтан, фосфорорганический — фосфамид и их смесь.

Несмотря на имеющиеся данные об инсектицидных и токсических свойствах кельтана, фосфамида и их смеси, метаболизме, клинике отравлений и изменениях функционального состояния некоторых органов и систем, сведения о биохимических механизмах их токсического действия весьма ограничены.

Согласно современным представлениям в проявлении токсического действия хлорорганических пестицидов, важную роль играют нарушения энергетического обмена (Б.И.Хайкина, У. А. Кузьминская и др. 1970; А. В. Остроухова, Ф. А. Оникиенко, 1970; И. И. Павлова, 1970; С. М. Алехина, 1975). Было показано, что хлорорганические препараты ДЦТ, гексахлорциклогексан, полихлоркамфен изменяют интенсивность окислительного фосфорилиро-вания, активность ряда окислительных ферментов и содержание в тканях никотинамидаденидинуклеотидов• Известно, что система нжотинамидных нуклетидов весьма четко реагирует во всех случаях, когда посредством чужеродных субстанций затрагивается биоэнергетика клетки. Поэтому её используют в качестве адекватного текста, отражающего сдвиги в процессах биологической оксидоредукции под действием инсектицидов, гербицидов и других соединений.

Учитывая, что кельтан является хлоре од ержащим препаратом, можно цредположить, что в механизме его токсического действия важная роль будет принадлежать нарушениям окислительных процессов и в частности изменениям в системе никотинамидных ко-ферментов. Что касается фосфорорганического препарата — фос-фамида, и особенно смеси препаратов (кельтан и фосфамвд), то о механизме их действия данные весьма ограничены.

Цель работы и основные задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение состояния системы никотинамидных коферментов в условиях раздельного и комбинированного воздействия на организм хлори фосфорорганических пестицидов кельтана и фосфамида.

Исходя из актуальности цроблемы и степени её изученности, были определены следующие основные задачи исследования:

1. Изучить влияние кельтана, фосфамида и их смеси на содержание ШО и HADH в печени, сердце и крови белых крыс.

2. Выяснить влияние указанных препаратов на интенсивность экс1феции с мочой основного конечного метаболита//ЛО.

— //'-МНАм,.

3. Исследовать t/A-Dгликогидролазную активность печени и крови животных в условиях действия пестицидов.

4. Изучить НЛО-зависимую лактатдегидрогеназнута активность печени и сыворотки крови животных в условиях введения пестицидов,.

5. Провести исследование уровня в крови и ^ -МНАм в моче людей, имевших производственный контакт со смесями хлори фосфорорганических пестицидов.

Основные положения, выносящиеся на официальную защиту:

1, Пестициды (кельтан и фосфамид) как при раздельном, так и комбинированном введении оказывают влияние на состояние системы никотинамидных коферментов в тканях теплокровных.

2, Изменения лактатдегидрогеназной активности тканей, обнаруженные при введении исследованных пестицидов, связаны с прямым их воздействием на уровень Мй*. в тканях.

3, Оцределение содержания МАО*в крови и //'-МНАм в моче может быть использовано для оценки состояния окислительных процессов в организме людей, имеющих контакт с пестицидами.

Научная новизна. Изучены некоторые стороны биохимического механизма токсического действия кельтана, фосфамида и их смеси. Выявлены особенности влияния кельтана, фосфамида и их смеси на содержание окисленной и восстановленной форм нико-тинамидадениндинуклеотида в различных тканях экспериментальных животных и характер экскреции с мочой основного его метаболита — Ы' -МНАм, Установлена зависимость выявленных сдвигов от дозы и длительности введения препаратов, а также их биологическая значимость.

Показана возможность использования оцределения содержания //АО* в крови и Н' -МНАм в моче для оценки состояния здоровья работающих с пестицидами.

Научно-практическая значимость работы. Установленные как общие, таки специфические для каждого препарата (кельтан,^{фосфамид,} их смесь) особенности влияния на систему никотин-амидного кофермента MDf расширяют представления о биохимическом механизме токсического действия, на организм теплокровных хлор-, фосфорорганических пестицидов и их смеси.

На основании, полученных результатов разработаны методические рекомендации иИспользование определения содержания ни-котинамвдадениндинуклеотида в крови и V' -метилнико тинамида в моче для оценки состояния окислительно-восстановительных процессов в организме работающих с пестицидами" (утверждены Министерством здравоохранения Грузинской ССР от 21 сентября 1983 года, г. Тбилиси).

Результаты проведенных исследований включены в материалы по пересмотру ЦЦК кель. тана в воздухе рабочей зоны. В настоящее время материалы находятся на стадии утверждения в Министерстве здравоохранения СССР.

Работа входит в план программы С. 10. «Программа развития научных исследований и ускорения внедрения достижений медицинской науки в отрасли агропромышленного комплекса на период до 1990 г.» .

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях Института гигиены труда и профзаболеваний МЗ ГССР (г.Тбилиси) — 1980, 1981, 1982, 1983 гг.- конференции молодых ученых НИИ гигиены труда и профзаболеваний МЗ УССР (г.Киев) — 1982 г.- конференции молодых ученых ВНИИ гигиены и токсикологии, пестицидов, полимеров и пластических масс, Ш СССР (г.Киев) — 1983 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы, методы», 9 глав экспериментального материала, списка литературы, включающего 190 источников (отечественных — III, зарубежных — 79). Материал диссертации изложен на 127 стр. машинописного текста, содержит 14 таблиц и 5 рисунков.

выводы.

1. При введении белым крысам пестицидов: кельтана, фосфамида или их смеси, в тканях печени, сердца и крови изменяется содержание окисленной и восстановленной формы И^/Д. в крови и ткани печени уровень NЛ /^снижается при однократном и длительном введении отдельных препаратов и их смеси, количество ftJf-DH в печени увеличивается при однократном поступлении и уменьшается при длительном. В ткани сердца изменения содержания МОжМРН при однократном введении такие же, как и в печени, при длительном не отличаются от контроля, за исключением возрастание уровня MJf-DH при поступлении кельтана.

2. Величина, сдвигов уровня flfi-DH в тканях при однократном поступлении препаратов находится в прямой зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения пестицидов.

3. Содержание ^ -метилникотинамида в моче снижается при введении препаратов в отдельности, возрастая при поступлении смеси кельтана с фосфамидом.

4. ТУАС-гидролазная активность печени и крови, повышенная при длительном поступлении кельтана и смеси к ель т aHfфосфамид, практически не изменяется под влиянием фосфамида. .

5. Общая лактатдегидрогеназная активность печени снижается при длительном поступлении кельтана, фосфамида и их смеси, а в крови не изменяется при действии препаратов в отдельности и снижается при действии смеси обоих пестицидов.

6. У людей, контактировавших с хлори фосфорорганически-ми пестицидами, снижается содержание flM)*в крови при одновременном увеличении уровня Л/'-МНАм в моче.

7. Исследование содержания J/AD+ в крови и -/У'-метил-никотинамида в моче — показателей, характеризующих состояние системы никотинамидадениндинуклеотидного кофермента может быть рекомендовано в качестве тестов при оценке токсического действия пестицидов как при изолированном, так и комбинированном их действии на организм человека.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Широкое применив в сельском хозяйстве ядохимикатов различного химического строения, способность большинства из них накапливаться в окружающей среде, тканях животных и человека обусловливает необходимость изучения механизма их токсического действия на организм теплокровных и человека. Знание этих механизмов необходимо как для выяснения роли химических факторов в развитии патологии, так и для разработки на этой основе эффективных мер профилактики и терапии.

В решении этой задачи наряду с другими методами и подходами важное место принадлежит биохимическим исследованиям, поскольку изучение влияния химического агента на ткани дает возможность установить действие его на определенные звенья цепи биохимических превращений, определяющих жизнедеятельность организма.

В сельском хозяйстве страны, в том числе и ГССР, широко применяются хлорорганический пестицид — кельтан, фосфорорга,-нический пестицид — фосфамид и их смесь.

Согласно современным представлениям, в проявлении токсического действия хлорорганических пестицидов важная роль принадлежит нарушениям энергетического обмена. В литературе тлеются данные об изменении под влиянием ДДТ,^-ГХЦГ, ПХК уровня никотинамидных коферментов, активности зависимой лак-татдегидрогеназы и её изоферментов, а также содержания пиро-виноградной и молочной кислот, в тканях при действии кельтана /8, 16/. В механизме действия фосфорорганических пестицидов ведущим считается ингибирование активности холинэстеразы. Однако, как было показано рядом исследователей, выраженные изменения отмечаются и со стороны других показателей. Так, при введении животным фосфамида обнаружено возрастание уровня сахара в крови, активности ACT /154/, снижение содержания цито-хрома С, активности цитохромоксидазы и коэффициента окислительного фосфбрилирования /101/, а также активности каталазы и пероксидазы /61, 62/.

Учитывая вышеизложенное, целью настоящей работы явилось выяснение характера воздействия кельтана, фосфамида и их смеси на состояние одной из наиболее важных систем, принимающих участие в энергетическом и пластическом обмене — системы ни-котинамидных коферментов.

Опыты были проведены на белых крысах-самцах, массой 200 250 г. Пестициды, фосфамид:. кельтан и их смесь вводили животным перорально в дозах ½, 1/20 и 1/200 ДЦ^ однократно и в количестве I мг/кг — ежедневно в течение 35 дней. С целью установления стойкости обнаруженных сдвигов цри однократном введении исследования проведены в динамике через различные сроки после окончания введения препаратов. ДП^д кельтана составляет -1400 мг/кг, фосфамида — 172 мг/кг, смеси кельтан-фосфа-мид 1:1 — 495 мг/кг, I мг/кг соответствует ДОК этих препаратов в пищевых продуктах.

В результате проведенных экспериментов показано, что однократное введение кельтана в дозах ½, 1/20. и 1/200 ЛД5д (соответственно 700, 70 и 7 мг/кг) вызывает однонаправленные стойкие, зависящие от величины введенной дозы изменения в содержании никотинамидного кофермента HAD — снижение количества его окисленной {HAD +) и увеличение восстановленной форм (NfiDH). Эти изменения при воздействии малой дозы кельтана (1/200 ЛДзд) и через 15 суток после окончания введения больших (½ и 1/20 ЛДзд) можно расценивать как результат изменения лишь соотношения поскольку в эти сроки эксперимента сумма////?4″ + HADHне изменяется. В ранние сроки (1−5 суток) после введения больших доз, очевидно, происходит не только перераспределение.

УЛГжМРИ, но и усиленное образование H&DH, за счет чего несколько увеличивается общее содержание кофермента. При введении 1/200 ЛД50 (7 мг/кг) кельтана было исследовано и содержание А/Д-D* в крови. Обнаружено, что во все сроки наблюдения (I, 5, 15 суток) количество fJ^D + в крови достоверно снижается на 43,50 и 35 $ по отношению к контролю. Следует подчеркнуть, что снижение уровня HAD + в крови коррелировало со снижением его содержания в тканях, что позволяет рассматривать изменения в крови, как отражение сдвигов, наступающих в тканях печени и сердца, что имеет важное практическое значение.

Однократное введение фосфамида в дозах ½, 1/20 и 1/200 ЛДзд (86, 8,6 и 0,86), так же, как и однократное введение кельтана вызывает стойкое, зависящее от величины введенной. дозы, достоверное снижение количества ИЩ + в печени, сердце ж крови при одновременном повышении уровня HAUH.

Подвергая сравнительному анализу полученные фактические данные, можно заключить, что при однократном введении и кельтан и фосфамид оказывают однонаправленное действие (рис. 4 и 5).

Риоунок.

Изменение содержание УАОИв печеетlqpno при однократном введении различных доз кельтана (А) и фосфамида (В) («% к контролю). В изменения недостоверны? ~ //ЛОИ.

Рисунок 5. йаменениеоодержания fi/Mf я li/AQH в оердце крыс при однократном введении различных доз кельтана Ц) и фосфамида (В) (ь% ж контролю).

120 100.

60 1 40.

20 +К.

20 т 220 В.

½ Л%0.

1/20 Л%0 изменения недостоверны.

1/200 Щс.

О/ДО он вызывают снижение уровня И’frD + и повышение содержания в печени и сердце, степень выраженности обнаруженных сдвигов находится в прямой зависимости от введенной дозы препаратов. При введении кельтана изменения уровня МЯО + практически одинаковы в тканях печени и сердца, a tHH) Н больше в печени. При введении фосфамида изменения уровня rffrD + превалируют в печени, а //ш наоборот в сердце. Максимальные изменения при введении кельтана обнаруживаются через 5 сут., а цри поступлении фосфамида — в первые суткиснижение содержания в крови коррелирует с подобным его сдвигом в тканях. Обнаруженное сходство в действии кельтана и фосфамида на уровень //А^, в тканях, по-видимому, связано с однотипным влиянием препаратов на процессы его использования в восстановительных реакцияхразличия — с особенностями токсикодинамики препаратов. Кельтан как хлорорганический пестицид, обладает способностью накапливаться в тканях и сохраняться в них, поэтому максимальные изменения отмечены через 5 суток после его введения. Фосфамид же — вещество менее стойкое, со зна-. чительно. менее выраженной способносью к кумуляции, и как следствие этого, максимум изменений в изучаемых биохимических показателях наблюдается в первые, сутки.

Более резкое возрастание уровня H^DHв сердце, чем в печени, цри воздействии. фосфамида, по-видимому, связано с особенностями реакции сердечной мышцы на введение этого препарата.

Учитывая величины ДОК кельтана и фосфамида в пищевых продуктах, равные I мг/кг, в хронических экспериментах нами были использованы именно такие дозы. При длительном введении крысам кельтана происходит снижение уровня №D+ в печени, сердце, крови и тнв печени. Общее содержание в тканях уменьшается. Наблюдаемые при длительном введении кельтана более выраженные изменения уровня НАм-кофермента, чем при однократном введении, можно объяснить кумулятивными свойствами препарата. Накапливаясь в тканях, кельтан, вероятно, влияет на активность ферментативных систем, определяющих интенсивность синтеза и распада никотинамидногоо кофермента.

При длительном введении фосфамида наблюдается снижение уровня MD+ в печени, однако, уступающее отмечаемому при однократном введении 1/200 ЛДзд дозы, близкой к поступившей (I мг/кг соответствует I/I72 ДЦ50) (рис.4). Однократное поступление фосфамида в дозе 1/200 ЛД^ сопровождается уменьшением содержания filfl-D+ в печени на 36%, тогда как длительное введение в дозе I/I72 ДД5д — снижаете его всего на 14% по сравнению с контролем. В ткани сердца длительное введение фосфамида приводит к существенному возрастанию количества НЮ, в то время как однократное поступление к обратному эффекту, т. е. к снижению количества кофермента в данной ткани. Изменения уровня тн в печени и сердце не существенны (статистически не достоверны). Для выяснения возможных причин обнаруженных изменений в содержании в крови и тканях было проведено определение.

МЭгидролазной активности и уровень экскреции с мочой основного метаболита никотшамидных коферментов УУ'-МНАм. При этом однократное введение ½ ДД50 кельтана вызывало достоверное снижение содержания /V'-МНАм в моче. С уменьшением вводимых доз кельтана 1/20 и 1/200 ДИ50 степень снижения его выражена меньше.

Поскольку общее содержание тканях во все исследованные сроки после однократного введения кельтана либо несколько возрастало (за счет увеличения количества восстановленной формы), либо оставалось в пределах контрольных величин, можно полагать, что обнаруженное снижение экскреции Л^'-МНАм является следствием замедленного распада в тканях, что можно рассматривать как проявление компенсаторной реакции, направленной на поддержание оптимального уровня кофермента в тканях. .

При длительном введении кельтана уровень экскреции //-МНАм также снижается. Проведенное нами в этих условиях определение tifrDгидролазной активности печени и крови выявило значительное её возрастание. Учитывая эти данные, можно считать, что обнаруженное при длительном введении кельтана значительноеобеднение тканей никотинамидным коферментом является результатом снижения биосинтеза и усиления его распада.

Фосфамид при однократном введении, так же, как и кельтан, вызывает снижение содержания У'-МНАм в мочеснижение пропорционально введенной дозе препарата и времени, прошедшему после введения. При длительном введении экскреция Н'-МНАм также уменьшается, причем это снижение значительно превосходит наблюдаемое при однократном введении самой большой дозы препарата. Учитывая данные, представленные в главах 3 и 4, свидетельствующие о стойком снижении общего количества.

ИМ) И в печени и отсутствие влияния препарата на активность ///5-гидролазы, можно полагать, что обнаруженное уменьшение экскреции Л/ /-МНАм является следствием торможения активности ферментов, определяющих либо биосинтез либо биосинтез jV'-MHAm.

Как известно, в последнее время внимание исследователей обращено к гигиеническому изучению и нормированию комплексов химических-веществ, поскольку многообразие их в окружающей среде предоцределяет неизбежность их комбинированного действия на организм человека и животных. В эффекте комбинированного действия могут сохраняться некоторые черты специфического действия составляющих факторов, но образующийся новый комплекс веществ может проявлять и новые качества. В настоящее время в сельском хозяйстве широко применяются комбинации хлори фосфорорганических пестицидов. Литературные материалы о механизмах их комбинированного действия весьма ограничены.

В эксперименте на белых крысах /22/ установлено, что хотя такие препараты как кельтан и каратан при изолированном введении сравнительно малотокеичны, цри комбинированном воздействии на организм на уровне пороговых доз вызывают эмбри-отоксический эффект. Длительное пероральное введение смеси хлори фосфорорганических пестицидов кроликам вызывает угнетение активности окислительно-восстановительных ферментов крови: каталазы, пероксидазы и снижает содержание общего, восстановленного и окисленного^ глютатиона /13/.

По данным Р. Джамалутдинова, Р. А. Ахмедовой /30/, при введении смеси ГХЦГ с фосфамидом у кроликов снижается содержа,-ние железа в крови, функциональная активность щитовидной железы, нарушается транспорт и метаболизм тироксина. Авторами выявлена определенная взаимосвязь между функциональной активностью щитовидной железы и изменением процесса образования труднодиссоциируемой фракции гормоно-бежового комплекса.

Работами С. Н. Бабаджанова /12/ установлено, что при хроническом воздействии на кроликов смесью пестицидов фосфамида и ГХЦГ происходит обеднение организма Ма, С-и., , Со и обогащение.

Sh.

При комбинированном воздействии хлори фосфорорганичес-ких соединений в ряде случаев наблюдается ослабление токсических эффектов фосфорорганического компонента /20, 58/. В частности, исследованиями Э. Д. Златева /33/ и В. Е. Якушко /III/, 3.А.Кузьминской /44/ установлено, что кельтан в комбинации с фталофосом, метафосом, фосфамидом значительно снижает токсичность указанных фосфорорганических пестицидов. Механизм этого явления связан со способностью хлорорганических пестицидов стимулировать ферментативную дезинтоксикацию фосфорорганических соединений микросомами печени.

Учитывая, что в последнее время в сельском хозяйстве страны, в том числе и ГССР, широко применяют смеси пестицидов, нам представилось важным изучить влияние смеси кельтан-фосфа-мид на состояние системы никотинамидных коферментов.

При введении смеси препаратов в дозах ½, 1/20 и 1/200 ЛД50 (247, 24,7, 2,47 мг/кг) однократно через I, 5, 15 сут. обнаружено снижение количества + в тканях печени, сердца и крови. Содержание тон в отличие от действия отдельных препаратов в печени также уменьшается, увеличиваясь в сердце. Вследствие этого общее содержание т+ + MDH в печени снижается, а в сердце остается в цределах контроля. Обнаруженные изменения оказались стойкими, за исключением содержания NJPD в тканях печени и сердца спустя 15 сут. после введения 1/200 ЛД50 смеси.

Таким образом, однократное введение смеси препаратов вызывает снижение уровня NAVH в печени, MD + во всех исследуемых тканях, причем, более значительное, чем при введении препаратов в отдельности. Уровень ftМНАм в моче при однократном введении смеси кельтан-фосфамид значительно возрастает. По всей вероятности, последнее является следствием усиления распада тем более, что общее содержание№№ в печени заметно снижается во все сроки исследования. При длительном (на протяжении 35 дней) поступления в организм крыс смеси кельтана с фосфамидом в печени снижается как общее содержание т+ + У/Ш, так и отдельных форм. В сердце при длительном введении смеси уровень mm и 0vh практически не изменяется, тогда как в крови количествоНИ* снижается, а УШ) -гидролазная активность печени и крови возрастает при одновременно повышении экскреции ftМНАм.

На основании представленных данных можно заключить, что длительное поступление в организм смеси кельтана и фосфамида в количествах на уровне ДОК не оказывает существенного влияния на уровень никотинамидного кофермента в ткани сердца, значительно снижая его содержание в печени и крови. Причиной обнаруженных изменений, по всей вероятности, является повышение интенсивности биодеградации.

Учитывая биологическое значение ДДГ системы и зависимости её от уровня внутриклеточного/^4″, нами была изучена ЛДГ-активность печени и крови. Оказалось, что длительное поступление в организм крыс кельтана, фосфамида и их смеси вызывает существенное снижение общей ДИГ-активности печени, а при введении смеси — и ЛДГ-активности крови. Причиной выявленного снижения ферментативной активности ЛДГ следует считать, в первую очередь, влияние препаратов на уровеньЛ^^-кофермен-та этой дегидрогеназы, поскольку изученные препараты, как было показано выше (см. главу 4), вызывают существенное снижение количества данного кофермента в печени. Следствием обнаруженного угнетения ЛДГ-активности могут явиться нарушения окислительно-восстановительных процессов, определяющих энергетический баланс организма.

Таким образом, поступление в организм фосфамида, кельтана и их смеси вызывает снижение уровня никотинамидного кофермента в печени, сердце и крови. Есть основания считать, что механизм снижения уровня + при действии кельтана, фосфамида и смеси различен. В основе обнаруженных сдвигов при однократном введении кельтана возможно лежит снижение процессов расщепления, а при однократном и длительном введении фосфамида — замедление процессов биосинтеза данного никотинамидного кофермента.

При длительном введении кельтана обнаруженное снижение уровня jt/kP+ в тканях и крови, по всей вероятности, является результатом нарушения биосинтетических процессов и усиления биодеградативных.

Смесь кельтана с фосфамидом как при однократном, так и при длительном введении вызывает снижение уровня никотинамид-ного кофермента в тканях и крови вследствие усиления процессов ферментативного расщепления^//?4″ и выведения Л/'-МНАмконечного продукта его обмена. Механизм действия смеси, особенно при длительном поступлении, определяется, в основном, влиянием хлорорганического препарата кельтана как стойкого, кумулирующего вещества.

Выявленные в эксперименте на животных изменения в содер-жанииЛ//?+, особенно при введении смеси (кельтан+фосфамид) как при однократном, так и при длительном введении вполне совпадают с изменением тех же показателей у людей, работающих с комплексами пестицидов.

У обследованных лиц нами отмечено снижение количественного содержания MAD+ в крови и увеличениеМНАм в моче.

Можно полагать, что изменения, выявленные в организме работающих с комплексами пестицидов в определенной мере являются результатом контакта с пестицидами. На основании результатов проведенной нами работы предложены методические рекомендации по использованию определения содержания MD+ в крови иМНАм в моче для оценки состояния окислительно-восстановительных процессов в организме лиц, имеющих производственные контакты с пестицидами.