Роль мембранных рецепторов в сигнальных механизмах в клетках нейрональной природы

В клеточной биологии в настоящее время отмечается активный интерес к изучению молекулярных механизмов передачи информации из внешней среды во внутриклеточное пространство, регулирующих клеточный метаболизм и жизнеспособность. Весь комплекс молекулярных событий, происходящих в клетке после связывания сигнальной молекулы со своим рецептором, составляет предмет изучения биохимической науки, посвященной клеточной сигнализации (cell signaling). Особенно активно эта область стала развиваться с 50-х годов XX века, когда произошло открытие Сазерлендом циклического моносроссрата (сАМР), отмеченное Нобелевской премией. Эта работа привела впоследствии к созданию теории вторичных мессенджеров (посредников) и представлению о сигнальных каскадах реакций. Изучение клеточной сигнализации лежит в основе современной эндокринологии, иммунологии, нейрохимии и других наук, и имеет целью не только разобраться в глубинных процессах функциональных клеточных изменений, но и научиться управлять этими процессами.

Сигнальные молекулы могут иметь разное строение и происхождение, однако все они работают по единому принципу, связываясь со своим специфическим рецептором по аналогии «ключа» и «замка». Поэтому они могут действовать только на те клетки, и только в том месте, где есть их специфический рецептор. Рецепторы в большинстве случаев представляют собой интегральные мембранные белки, поли пептидная цепь которых пронизывает толщу мембраны, поэтому сигнальные молекулы, включая большинство гормонов (за исключением стероидных и тиреоидных, действующих через ядерные рецепторы), как правило, не проникают внутрь клетки, а специфически взаимодействуют с рецепторами, локализованными во внешней клеточной мембране.

В неврологии с пониманием механизмов внутриклеточной сигнализации связывают надежды на лечение таких заболеваний как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, хорея Гентингтона и многих других. Изучение сигнальных механизмов в мозге должно основываться на знании специфических функций и 5 особенностей метаболизма нейрональной клетки. Как известно, основной функциональной особенностью нейрональных клеток является способность к электрическому возбуждению, а биохимически нервные клетки и мозг в целом отличаются, например, высокой интенсивностью окислительных процессов и большим потреблением энергии.

В основе электрического возбуждения нервной клетки лежит существование электрохимического градиента, вызванного неравномерным распределением ионов Na К+ и Саг* по обе стороны клеточной мембраны. Деполяризация мембраны приводит к открыванию ионных каналов, и ионы Na+ устремляются внутрь клетки, а ионы К+ - устремляются наружу (Шмидт Т., 1996). Очевидно, что способность нервной клетки к возбуждению ограничивалась бы моментом, когда ионные концентрации внутри и снаружи клетки выровняются, если бы не существовало механизма, восстанавливающего ионныи градиент и позволяющий нервной клетке функционировать длительное время. Такой механизм оказался представлен мембранным ферментом Ыа/К-АТФазой, открытый в 1957 году J. Skou (Skou 1957). Работа Na/K-АТФазы заключается в одновременном переносе ионов Na+ изнутри клетки наружу и ионов К+ снаружи во внутриклеточное пространство с затратой энергии АТФ — поэтому No/K-АТФазу называют также ионным насосом. Однако впоследствии выяснилось, что Ыа/К-АТФаза способна не только перекачивать ионы, но и передавать информационные сигналы внутрь клетки, являясь рецептором для группы кардиотонических стероидов (КТС) типа уабаина (Scheiner-Bobis 6. & Schoner W., 2001; Xie Z. & Askari A., 2002). Существует 2 изоформы фермента, различающиеся по чувствительности к КТСчувствительные и резистентные к ним.

КТС синтезируются в организме в небольших количествах, действуя на высокочувствительные к ним изоформы Ыа/К-АТФазы (а2 и а3), они запускают сигнальные механизмы без изменения ионного гомеостаза клетки (Scheiner-Bobis, Schoner, 2002). Эти сигнальные механизмы реализуются в активации транскрипционных факторов NF-кВ и АР-1, экспрессии генов и синтезе белка.

Peng, 1996; Huang, 1997). Сигнальные свойства Ыа/К-АТФазы открыты недавно и к настоящему моменту изучены далеко не полностью. '.

Электрохимический градиент, создаваемый Ыа/К-АТФазой, используется системами нейромедиаторов, в частности, глутаматергической системой, для инициации процессов возбуждения или торможения. Глутамат и связанная с ним система глутаматных рецепторов инициируют возбуждающие стимулы, ответственные за распознавание объектов, анализ и запоминание информации, обучение и выработку стратегии поведения. В глутаматергических синапсах обнаруживается более десяти различных рецепторов с разными свойствами и различным сродством к глутамату. Предполагается, что дифференцированная I активация рецепторов при высвобождении глутамата лежит в основе синоптической пластичности, играющих важную роль как в процессах обучения, так и в развитии двигательных нарушений при некоторых патологиях, сопровождающихся развитием окислительного стресса (например, болезнь Паркинсона или хорея Гентингтона).

Глутаматные рецепторы по современной классификации делятся на 2 подтипа: ионотропные (iGluR) и метаботропные (mGluR). Первые из них связаны с ионными каналами, активация которых обеспечивает электрическую активность нейронов, а вторые передают информацию на внутриклеточные сигйальные системы, что приводит к модификации клеточного метаболизма.

Особенно важную роль в жизнедеятельности нейронов играют глутаматные рецепторы NMDA-класса. NMDA-рецепторы в норме участвуют в процессах долговременной потенциации и запоминания. При чрезмерной активации NMDA-рецепторов наблюдается избыточная продукция активных форм кислорода (АФК) и развитие окислительного стресса, в связи с чем глутамат относят к экзайтотоксическим соединениям.

По ряду биохимических особенностей мозг особенно чувствителен к окислительному стрессу (Halliwell, Gutteridge, 1999). Так, известно, что при ишемии в тканях мозга нарастает концентрация свободного глутамата, что приводит к длительной активации ионных каналов, высвобождению ионов кальция из внутриклеточных депо, а затем и к гибели клетки. Такой механизм гибели клеток характерен как для ишемии мозга, так и для многих видов травмы и эпилепсии.

Метаботропные глутаматные рецепторы делятся на 3 группы (mGluR I, m6luR II и mGluR III), отличающиеся тем, с какими б-белками в мембране они связаны и, соответственно, какие сигнальные системы в клетке включаются лри их активации. В настоящее время накоплен ряд данных, свидетельствующих о модулирующей роли mGluRs в функционировании экзайтотоксических медиаторов, в частности для разных групп mGluRs показана усиливающая и защитная роль при состояниях окислительного стресса, вызванного внешними факторами.

В последнее время получен ряд данных, свидетельствующих о функциональных взаимодействиях различных глутаматных рецепторов друг с другом и с Ыа/К-АТФазой через внутриклеточные белки-посредники и активные формы кислорода. Было установлено, что активация нейронов повышающимися концентрациями NMDA приводит к прогрессивному ингибированию Na/K-АТФазы, которое может предотвращаться антагонистом NMDA-рецепторов МК-801, а в присутствии цистеина утраченная активность Ыа/К-АТФазы может быть восстановлена.

Известно, что активация NMDA-рецепторов приводит к входу в нейрон ионов кальция и к активации протеинкиназы С (РКС) (Boldyrev, 2002). Ыа/К-АТФаза является одной из мишеней этой киназы, причем более чувствительной к действию РКС является уабаин-резистентная а1-изоформа, и в результате ее I фосфорилирования чувствительность Ыа/К-АТФазы к уабаину повышается (Fedorova, 2003). Эндогенный уабаин-подобный гликозид препятствует связыванию МК-801 с NMDA-рецепторами (Reines 2001). Показано, что известный токсический эффект уабаина не связан с вызываемой им деполяризацией мембраны или снижением ионных градиентов, а отражает непосредственное участие Ыа/К-АТФазы в антиоксидантной защите клеток (Veldhuis2003; Boldyrev et al, 2003). Эти и другие факты подтверждают наличие взаимодействия Ыа/К-АТФазы и глутаматных рецепторов NMDA-класса и вовлечение Ыа/К-АТФазы в систему передачи информации через клеточную мембрану внутрь клетки. Возможно, управляя сигнальными функциями Ыа/К-АТФазы, можно научиться снижать окислительный стресс, вызванный гиперактивацией NMDA-рецепторов.

Существующие представления о роли глутаматергической системы и Ыа/К-АТФазы при передаче информационных сигналов и активаторов внутриклеточных сигнальных каскадов с участием протеинкиназ, ионов кальция и активных форм кислорода послужили теоретической основой для настоящей работы. Она посвящена исследованию сигнальных функций Ыа/К-АТФазы и глутаматных рецепторов и их функциональной взаимосвязи.

В работе использованы 2 биологические модели: культура клеток нейробластомы человека БН-бУбУ и первичная культура изолированных нейронов мозжечка 2-недельных мышей линии SAMP (Senescence Accelerated Mice, prone). В некоторых опытах на клетках РС-3 проводилась оценка типа клеточной смерти при ингибировании Ыа/К-АТФазы уабаином. Выбор в качестве объекта клеточной культуры нейробластомы SH-SY5y связан с тем, что она является распространенной моделью нервных клеток и часто используется в нейрохимической литературе. Опухолевые клетки являются удобным объектом для изучения как имеющие нервное происхождение — именно такой культурой и является клеточная линия нейробластомы бН-бУбУ. Второй объект исследования I.

— животные SAMP — характеризуются повышенным стационарным уровнем АФК (окислительный стресс), поэтому экзайтотоксические механизмы в их мозге представлены в наиболее выраженном виде. Мы предполагали, что сопоставление данных, полученных на культуре клеток и на свежевыделенных нейронах позволит получить более объективную информацию о реальных процессах клеточной сигнализации в нервной ткани.

В соответствии с этим, первая часть работы посвящена изучению сигнальных каскадов с участием No/K-АТФазы и глутаматных рецепторов NMDA-класса на клеточной культуре нейробластомы 5Н-5У5У. Вторая часть работы выполнена на нейронах быстростареющих мышей и посвящена взаимодействию ионотропных NMDA-рецепторов с различными классами метаботропных глутаматных рецепторов.

Целью исследования явилось изучение участия No/K-АТФазы, глутаматных рецепторов NMDA-класса и метаботропных глутаматных рецепторов в проведении внутриклеточных сигналоввыяснение их роли в регуляции клеточного метаболизма и значения для жизнеспособности нейрональной клетки, а также выявление механизмов взаимодействия этих i систем.

Задачи исследования:

1) Определение изосрормного состава No/K-АТФазы и субъединиц NMDA-рецепторов в клетках нейробластомы 5Н-5У5У.

2) Оценка влияния No/K-АТФазы и NMDA-рецепторов на внутриклеточный уровень ионов кальция и активных форм кислорода (АФК) в клетках нейробластомы SH-Sy5Y.

3) Выявление внутриклеточных белков-посредников, участвующих в механизмах клеточной сигнализации, реализующихся при участии Na/K-АТФазы и NMDA-рецепторов в клетках нейробластомы БН-бУбУ.

4) Оценка жизнеспособности клеток нейробластомы 5Н-5У5У при блокаде No/K-АТФазы уабаином и действии токсических концентраций NMDA.

5) Выявление типа клеточной смерти (некроз или апоптоз) при ингибировании Na/K-АТФозы уабаином на клеточной линии РС-3.

6) Сопоставление уровня АФК и темпов гибели нейронов мозжечка быстростареющих мышей линии 5AMP (Senescence Accelerated Mite) при активации глутаматных ионотропных и метаботропных рецепторов.

Научная и практическая новизна исследования:

Исследования сигнальных процессов, в которые вовлекаются Ыа/К-АТФаза и глутаматные рецепторы, на изучаемых объектах до сих пор не проводились. Представленные данные показывают, что Ыа/К-АТФаза принимает непосредственное участие в реализации внутриклеточной сигнализации в клетках нейробластомы SH-SY5y в качестве регулятора клеточного метаболизма и i жизнеспособности этих клеток. В клеточной культуре нейробластомы 5Н-бУ5У присутствуют все 3 изосрормы каталитической субъединицы Na/K-АТФазы. При ингибировании АТФазы уабаином наблюдается увеличение уровня АФК и внутриклеточных ионов кальция, которые, вероятно, участвуют в передаче сигналов в качестве вторичных мессенджеров. На клетках нервного происхождения впервые получены данные об активации Na/K-АТФозой сигнальных путей с участием протеинкиназ МАРК и РКВ. Впервые обнаружено, что действие уабаина приводит к сроссрорилированию белка Bad и подавлению его проапоптозного действия. Одновременно выявлена активация! ряда внутриклеточных посредников, участвующих в развитии апоптоза в этих клеткахснижается доля активных (сроссрорилированных) белков Вcl-2 и Bcl-xL, подавляющих выход цитохрома С из митохондрийв цитоплазме клеток появляется цитохром С, активируется каспаза 3 и белок р53. Два противоположных пути регуляции характеризуются различной чувствительностью к уабаину: первый выявляется при низких, а второй — при высоких (1 мкМ и выше) концентрациях этого лиганда.

Показано, что в клетках нейробластомы 6Н-5У5У присутствует NR1 субъединица NMDA-рецепторов, но инкубация клеток с NMDA не приводит к увеличению уровня АФК и ионов Са2+. Тем не менее, в этих условиях активируются МАРК и РКВ киназы. Возможно, что именно NR1 субъединица NMDA-рецепторов ответственна за их сигнальную функцию.

Данные, полученные на мышах линии SAMP, демонстрируют регулирующее действие метаботропных глутаматных рецепторов на NMDA-рецепторы, выражающееся в том, что метаботропные рецепторы I группы ослабляют, а III группы усиливают токсическое действие NMDA.

Обнаруженные закономерности помогают уточнить молекулярные механизмы сигнальной функции No/K-АТФазы и рецепторов глутаматергической системы в нервных клетках.

Часть I Обзор литературы.

1. Circulation 108, 3048−53., 2003. 26) Abetnayor, E, and Sidell, N. Human neuroblastoma cell lines as models for the in vitro study of neoplastic and neuronal cell differentiation. Environ. Health Perspect. 80, 3−15., 1989. 21) Agarwal S. and Sohal R.

2. Cloned glutamate receptors Annu. Rev. Neurosci., 17, 31−108., 1994. 115) Houamed KM, Kuijper J.L., Gilbert T. L, Haldeman B.A., OHara P.J., MuMhill ЕЛ, Aimers W., Hagen F.

3. Epub 2005 Sep 21, 2006. 136) Kitamura У, Zhao Z.H., Ohnuki Т., Takei M., and Nomura У. Age-related changes in transmitter glutamate and NMDA receptor/channels in the brain of senescence-accelerated mouse. Neurosci. Lett. 1992. Vol. 137. P. 169−172. 137) Knight J.A. The biochemistry of Aging. Adv. din. chem. v. 35. pp. 1−62- 2000. 132.