Особенности функционирования дыхательной цепи Bacillus subtilis

Актуальность темы

.

Все организмы получают необходимую для жизнедеятельности энергию благодаря окислительно-восстановительным реакциям. Энергия, заключенная в химических связях, переводится в другую форму, после чего клетка способна использовать ее для совершения необходимых работ: химической (синтез новых молекул), механической (движение), осмотической (транспорт метаболитов) и проч.

Наиболее универсальные формы «энергетической валюты» это АТФ и разность электрохимических потенциалов протона на мембране, ДцН+. Иногда гидролиз АТФ сопряжен с совершением работы напрямую, однако чаще энергия сначала переводится в форму ЛрН+. Взаимопревращение ДиН+ и АТФ возможно благодаря работе мембранной ЛТФ-синтетазы, сопрягающей синтез АТФ с расходованием ДрН+ и, наоборот, гидролиз АТФ с образованием ЛцН'. Главным генератором ДрН+ у аэробных организмов служит дыхательная цепь.

Последняя локализована в мембране (у бактерий в плазматической, у эукариотов во внутренней митохондриальной) и состоит из ферментов, окислительно-восстановительная активность которых сопровождается переносом протонов из внутренней водной фазы во внешнюю. В целом устройство митохондриальной и прокариогических дыхательных цепей сходно, однако у бактерий часто присутствуют разные варианты одного и того же фермента — это играет важную адаптационную роль для одноклеточного организма, находящегося в постоянно меняющихся условиях.

Мембранная сукцинат: хинон-оксидоредуктаза — ключевой фермент аэробного метаболизма. Роль ее двоякая. С одной стороны, это катализ реакции из цикла Кребсазамкнутой цепочки превращений органических молекул, в результате которых клетка получает сырье для синтеза необходимых структур, энергию в форме АТФ и восстановительные эквиваленты, далее окисляемые дыхательной цепью. С другой стороны, сукцинат: хинон-оксидоредуктаза представляет собой вход, через который в дыхательную цепь поступают электроны.

Мембрана бацилл и некоторых других аэробных бактерий содержит особую разновидность хинона — менахинон, потенциал полувосстановления которого на 100 мВ ниже, чем у пары сукцинат/фумарат. Сукцинат: менахинон-оксидоредуктаза таких организмов катализирует энергетически невыгодный перенос электронов с более слабого восстановителя на более сильный. Недавно полученные рентгеноструктурные данные подтвердили, что в катализе может принимать участие ДцН+, однако устройство механизма, связывающего внутримолекулярный перенос электронов с мембранным потенциалом, продолжает оставаться неясным.

Имеющиеся на сегодня экспериментальные сведения, касающиеся взаимовляния Д|лНь и дыхательной активности у менахинон-содержащих бактерий, неполны и противоречивы. С одной стороны, классическое явление «дыхательного контроля» состой г в том, что по мере роста мембранного потенциала работа генерирующих его ферментов должна тормозиться. С другой стороны, достоверно показано, что рассеяние Aju. H+ резко ингибирует дыхание клеток Bacillus subtilis в присутствии сукцината. Предположительно, именно это является причиной того, что субклеточный мембранный препарат Bacillus subtilis практически не обладает сукцинатоксидазной активностью. Наконец, сукцинат: менахинон-оксидоредуктаза из Bacillus subtilis структурно чрезвычайно близка к менахинол: фумарат-оксидоредуктазе из Wolinella succinogenes, однако для последнего фермента был строго доказан электронейтральный механизм катализа.

Цель исследования.

Основным объектом настоящей работы был менахинон-содержащий, преимущественно аэробный организм — Bacillus subtilis. Исследования были направлены на прояснение взаимодействия двух связанных параметров: электрон-переносящей активности дыхательной цепи и уровня ДцН+ на мембране.

Прежде всего, необходимо было понять, как соотносятся между собой дыхательный контроль и явление ингибирования клеточного дыхания от сукцината при разобщении.

Для более подробных исследований зависимости активности дыхательных ферментов от мембранного потенциала желательно было разработать более простую и удобную, чем целые клетки, систему.

Данные об ингибировании дыхания клеток Bacillus subtilis предполагалось проверить на других микроорганизмах. Также предполагалось сравнить, хотя бы предварительно, характеристики выделенной сукцинат: менахинон-оксидоредуктазы из Bacillus subtilis с несколькими другими ферментами того же типа.

Хотя ингибирование сукцинат: менахинон-редуктазной реакции при деэнергизации клеточной мембраны Bacillus subtilis является твердо установленным фактом, он может иметь различные объяснения. Мембранный потенциал либо служит «субстратом» реакции и расходуется по мере ее протекания, либо выполняет чисто регуляторную роль, стабилизируя активное состояние сукцинат: менахинон-оксидоредуктазы. В цели исследования входило выяснить, какой из вариантов реализуется в действительности.

Перспективным подходом представлялось создание модельной дыхательной цепи, состоящей из сукцинат: менахинон-оксидоредуктазы, менахинона и терминальной оксидазы ¿-¿-/-типа, стехиометрия которой как генератора Д) Ш+ известна и составляет 1 Н+/е Окисление такой дыхательной цепью сукцината сопровождалось бы генерацией мембранного потенциала только при условии, что восстановление менахинона происходит без расходования Д|Ш+. В случае электрогенной работы сукцинат: менахинон-оксидоредуктазы суммарный результат оказался бы электронейтральным. В наши планы входило сконструировать дыхательную цепь требуемого состава и проверить, сопряжена ли ее работа с энергизацией мембраны.

В том случае, если мембранный потенциал расходуется при окислении сукцината, следует ожидать, что в обратном, фумарат-редуктазном процессе он будет генерироваться. Предполагалось проверить, сопряжена ли с образованием Д|Ш+ активность сукцинат: менахинон-оксидоредуктазы в направлении обратной реакции.

Основные задачи исследования.

В наши задачи входило:

— проверить, наблюдается ли явление дыхательного контроля на клетках Bacillus subtilis в присутствии различных субстратов дыхания;

— выяснить причину падения сукцинатоксидазной активности в мембранном препарате Bacillus subtilis;

— разработать более простую, чем целые клетки, модель для изучения воздействия мембранного потенциала на работу дыхательной цепи Bacillus subtilis',.

— сопоставить данные о влиянии мембранного потенциала на дыхательную активность бактерий из разных систематических групп, содержащих мембранный хинон разных типов;

— сравнить характеристики мембранных сукцинат: менахинон-оксидоредуктаз из нескольких менахинон-содержащих организмов;

— прояснить роль Др. Н+ в катализе сукцинат: менахиноп-редуктазного процесса у Bacillus subtilis: расходуется ли мембранный потенциал в ходе реакции, или же энергизация мембраны лишь поддерживает фермент в активной конформации;

— выяснить, связана ли с уровнем мембранного потенциала активность сукцинат: менахинон-оксидоредуктазы из Bacillus subtilis в направлении восстановления фумарата.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В предыдущих исследованиях явление энергозависимости сукцинат: менахинон-оксидоредуктазы Bacillus subtilis удавалось наблюдалсь только на уровне интактных клеток. При выделении мембранных частиц сукцинатоксидазная активность препарата падала настолько, что изучать ее характеристики было невозможно. Вместе с тем, целые клетки представляют собой столь сложный объект, что однозначно интерпретировать полученные на нем результаты, касающиеся регуляции активности фермента, очень • трудно. В представленной работе впервые разработана методика, позволяющая наблюдать на сопряженном препарате замкнутых мембран из Bacillus subtilis сукцинатоксидазную активность, сравнимую по величине с эндогенным дыханием клеток. Сопряженные мембранные частицы Bacillus subtilis оказались чрезвычайно удобным объектом для исследования явлений, связанных с энергизацией мембраны.

В работе впервые предложена кинетическая модель, описывающая процесс окисления сукцината суспензией замкнутых мембранных частиц из бациллы. Модель учитывает обратную положительную связь, возникающую в системе благодаря тому, что мембранный потенциал, образуемый при окислении менахинола терминальным участком дыхательной цепи, в свою очередь стимулирует активность сукцинат: менахинон-оксидоредуктазы. Модель объясняет детали концентрационной зависимости сукцинатоксидазной реакции, наблюдаемые в эксперименте и непонятные в рамках простейшей схемы.

Полезен с методической точки зрения результат, касающийся поведения несопряженной НАДН-дегидрогеназы Bacillus subtilis в мембранных препаратах. Легкость, с которой фермент переходит в доступную для взаимодействия с молеклярным кислородом конформацию, необходимо принимать во внимание при работе с НАДП в аэробных условиях.

То, что дыхание клеток Bacillus subtilis от сукцината требует энергизации, мембраны, объясняли до сих пор энергозависимым характером. работы сукцинат: менахинон-оксидоредуктазы. В работе впервые представлены данные о том, что деэнергизация клеточной мембраны ингибирует дыхание Bacillus subtilis от нескольких различных субстратов и что данный эффект не сводится к инактивации сукцинат: менахинон-оксидоредуктазы.

Впервые проведено тестирование микроорганизмов из разных систематических групп на предмет зависимости дыхательной активности клеток от мембранного потенциала. До сих пор считалось, что явление дыхательного контроля, впервые обнаруженное на митохондриях и воспроизведенное на ряде бактерий, одинаково 8 распространено среди всех аэробных организмов. Мы убедились, что ингибирование дыхания в условиях деэнергизации клеточной мембраны проявляется не только у Bacillus subtilis, но и у других грам-положительных менахинон-содержащих бактерий, в особенности ярко — у бацилл.

Для решения вопроса об электрогенности работы сукцинат: менахинон-оксидоредуктазы Bacillus subtilis применен новый оригинальный подход, состоящий в том, что предполагаемая электрогенная активность фермента сопоставляется с протон-транслоцирующей способностью терминальной оксидазы ¿-¿-/-типа, характеристики которой хорошо известны. Впервые искусственно создана дыхательная цепь, состоящая из сукцинат: менахинон-оксидоредуктазы, мембранного менахинона и цитохрома bd. Полученные на модельном объекте результаты важны для понимания механизма катализа сукцинат: менахинон-оксидоредуктазы в направлении прямой реакции.

Впервые исследована фумарат-редуктазная активность сукцинат: менахинон-оксидорсдуктазы в замкнутых мембранных частицах Bacillus subtilis. Данные других авторов об электрогенности процесса были получены на целых клетках и не поддавались однозначной интерпретации. Гипотеза о возможной генерации мембранного потенциала в ходе менахинол: фумарат-редуктазной реакции проверена на качественном и на количественном уровне, с учетом зависимости величины ожидаемого ответа от скорости переноса электронов. Полученные данные проясняют механизм работы фермента в направлении обратной реакции.

Практическая значимость информации о мехнизме работы важнейшего фермента аэробного метаболизма, сукцинат: хинон-оксидоредуктазы, состоит, прежде всего, в том, что установленные принципы функционирования могут быть частично перенесены с бактериального белка на его эукариотический аналог.

Известно, что мутации в гене митохондриальной сукцинат: хинон-оксидоредуктазы человека приводят к серьезным нарушениям вследствие повышенного уровня образования кислородных радикалов. Структура двугемовых сукцинат-менахинон-оксидоредуктаз, включая фермент из Bacillus subtilis, рассматривается некоторыми исследователями как вариант, наиболее безопасный с точки зрения взаимодействия с кислородом. Возможность мутагенеза позволяет исследовать данную проблему более подробно.

Перспективная линия исследований касается свойственной сукцинат: менахинон-редуктазам способности переключаться в анаэробных условиях на роль фумарат-редуктазы. Известно, что такое же переключение происходит в митохондриальном ферменте из раковых клеток при переходе на анаэробный метаболизм. Бактериальный аналог, безусловно, более удобен для исследования модификаций белка, вызывающих изменение его функций.

Очевидным является приложение знаний об устройстве сукцинат: менахинон-оксидордуктазы для разработки антибактериальных препаратов. Двугемовые сукцинат: менахинон-оксидоредуктаза и менахинол: фумарат-оксидоредуктаза встречаются у многих патогенных микроорганизмов (бацилл, хламидий, Б-протеобактерий) и могут быть мишенью характерных ингибиторов, имитирующих структуру менахинона и безопасных для митохондриального фермента.

Наконец, впервые описанное в работе ингибирование эндогенного дыхания клеток разобщающими агентами должно быть принято во внимание при разработке лекарств антибациллярного спектра действия. Можно предположить, что чрезвычайно низкие дозы разобщителя, достаточные для подавления дыхания бацилл, никак не повлияли бы на устойчивую к деэнергизации дыхательную активность митохондрий.

I. Обзор литературы.

1. Bacillus subtilis.

Выводы.

1. Дыхание целых клеток В. subtilis ускоряется под действием Др. Н+ и практически полностью подавляется при деэнергизации мембраны. Энергозависимая стимуляция переноса электронов по дыхательной цепи направлена на стадию восстановления дегидрогеназами мембранного менахинона.

2. Эффект ингибирования эндогенного клеточного дыхания в условиях разобщения характерен для менахинон-содержащих организмов: бацилл и, возможно, других грам-положительных аэробов. Электроп-транспортная активность убихиноп-содержащих дыхательных цепей грам-отрицательных бактерий при деэнергизации мембраны не тормозится.

3. Получение из клеток В. subtilis мембранной фракции сопровождается резким падением удельной сукцинатоксидазпой активности, причиной которого является низкам сопряженность препарата. Создание ДцКГ на мембране замкнутых частиц полностью восстанавливает работу дыхательной цепи В. subtilis от сукцината.

4. Окисление сукцината сопряженными мембранными частицами из В. subtilis сопровождается потреблением ДцН+. Активность хинолоксидазы bd-типа не обеспечивает энергизации мембраны, необходимой для заметного протекания сукцинатоксидазной реакции.

5. Восстановление фумарата сопряженными мембранными частицами из В. subtilis не сопровождается образованием ДрН+. Деэнергизация мембраны не влияет на скорость менахинол: фумарат-редуктазной реакции.

6. Суцинат: менахинон-оксидоредуктаза В. subtilis способна функционировать в двух режимах: катализ в прямом направлении сопровождается расходованием Д[Ш+, катализ в обратном направлении протекает по электронейтральному механизму. Представляется вероятным, что данная особенность характерна для группы двугемовых сукцинат: менахинони менахинол: фумарат-оксидоредуктаз.

Заключение

.

На примере В. яиЫШз мы рассмотрели некоторые особенности функционирования дыхательной цепи, характерные для аэробных бактерий, мембранный пул хинона которых представлен менахиноном.

В биоэнергетике хорошо известно явление дыхательного контроля. Оно состоит в том, что по мере повышения на мембране уровня ДрН+ перенос электронов по дыхательной цепи тормозитсяпри добавлении в такой ситуации разобщителей окислительного фосфорилирования можно наблюдать ускорение дыхания. Как показывают результаты, изложенные в Главе 2, у менахинон-содержащих организмов дело обстоит прямо противоположным образом: мембранный потенциал не подавляет, а активирует электрон-транспортную активность дыхательной цепи. Соответственно, любые воздействия, приводящие к деэнергизации мембраны (ионофоры, каналообразователи, механическое нарушение целостности мембраны, факторы, увеличивающие неспецифическую протонную проводимость и т. п.) вызывают не ускорение, а резкое ингибирование дыхательной активности.

В Главе 2 явление стимуляции дыхательной цепи мембранным потенциалом рассмотрено на уровне целых клеток В. БиЫШз. Активирующее действие ДцН+ направлено на реакцию восстановления мембранного менахинона. Характерно, что эффект не зависит от природы восстановителя: разобщение ингибирует дыхание не только от сукцината (что было известно и раньше), но, в той же степени, от эндогенного НАДН или глицерина, в том числе, в мутантных клетках, лишенных БОЯ. Работа дыхательной цепи требует энергизации мембраны не только в случае В. зиЬНШ, но и у других бацилл, а также у некоторых представителей других таксоном ическох групп, в аэробном метаболизме которых используется менахинон.

В Главе 3 энергозависимый характер дыхания от сукцината и глицерофосфата продемонстрирован на мембранных частицах из В. шЬМИя. В случае глицерофосфата активация мембранным потенциалом выражена слабее, что связано с большей силой этого восстановителя. В случае НАДН эффект не наблюдается из-за обнаруженной нами особенности несопряженной НАДН-дегидрогеназы: в мембранных препаратах В. яиЫШя фермент легко переходит в форму, катализирующую передачу электронов не в дыхательную цепь, а на молекулярный кислород.

Помимо общего механизма, способствующего восстановлению менахинона в энергизованной мембране и сказывающегося на всех менахинол-зависимых процессах, существуют отдельное явление активации мембранным потенциалом работы 8<311. Если в первом случае связь между редокс-состоянием М (2 и уровнем А|л.Н+ осуществляется, как мы предполагаем, при участии вспомогательных мембранных белков, то во втором необходимые трансмембранные элементы структуры содержит сама молекула фермента.

До сих пор проявления энергозависимости 8(311 удавалось наблюдать только на целых клетках В. яиЫШя. В Главе 3 описаны эксперименты, впервые воспроизводящие их на гораздо более простом объекте — замкнутых мембранных частицах. В условиях сопряжения частицы способны окислять сукцинат практически с той же скоростью, что и растущие клетки, при этом наблюдается весь комплекс явлений, связанный с ингибированием дыхания о г сукцината при деэнергизации. Характерная особенность сукцинатоксидазной реакции, катализируемой суспензией сопряженных частицзначительный рост, по мере энергизации, параметра С5о% по сукцинату относительно истинной константы Михаэлиса. Данный эффект не имеет объяснения в рамках простейшей кинетической схемы. В Главе 3 предложена модель, учитывающая положительную обратную связь между активностью 8(311 и величиной АрН+ на мембране и объясняющая наблюдаемую закономерность.

БС^Я из В. яиЫШх относится к В-типу ферментов, катализирующих окисление сукцината мембранным хиноном либо обратную, хинол: фумарат-редуктазную реакцию. Характерным структурным признаком представителей этой группы являются два низкоспиновых гема Ь, расположенные трансмембранно. В Главе 1 четыре фермента типа В рассматриваются с точки зрения спектральных и окислительно-восстановительных характеристик редокс-групп. Два из них (из В. зиЫШх и Л. тагтт) выполняют в клетке прежде всего функции БСЗЛ, а два (из С. аигапНасш и Т. (ЬегторкНш) по-видимому могут играть роль как 8(211, так и С>Р11, в зависимости от условий. Обнаруженные нами изменения в оптических спектрах и потенциалах полувосстановления гемов могут быть связаны с переключением фермента с одной функции на другую.

Все 8(311 и (ЗР11 типа В работают с менахиноном. Существует гипотеза о том, что движущей силой энергетически невыгодного восстановления М (2 сукцинатом является АрН+. Это предположение подкрепляется анализом трехмерной структуры (2Р11 из IV. succinogenes, хотя, в то же время, известно, что активность данного фермента в направлении восстановления фумарата не связана с образованием мембранного потенцала. Термодинамический барьер М (3-редуктазной реакции мог бы преодолеваться не за счет расходования ДцН+, а благодаря стабилизации восстановленной формы М (3, прочно связывающейся с Б (311 либо с другим белком. В этом случае энергозависимость 8(311 объяснялась бы чисто регуляторной ролью мембранного потенциала, поддерживающего фермент в активном состоянии.

В Главе 4 выясняется вопрос о значении Д|лН+ в катализе БСЗЯ из В. хиЬИНя. Во-первых, исследовалась дыхательная цепь, состоящая из БС^Я, и цитохрома Ьс1. Во-вторых, была предпринята попытка установить, электрогенна ли фумарат-редуктазная активность фермента.

Увеличение содержания ЭС^Л в клетках штамма с единственной терминальной оксидазой типа Ьс1 улучшает рост культуры в присутствии сукцината — по-видимому, за счет ускорения оборота цикла Кребса. При этом замкнутые мембранные частицы из клеток мутанта полностью лишены способности окислять сукцинат — очевидно, из-за принципиальной невозможности энергизовать мембрану при помощи Д|Ш±генератора со стехиометрией 1 Н+/е Это указывает на суммарную электронейтральность работы дыхательной цепи БСШ. —> —" цитохром Ъй и, тем самым, на электрогенность катализа 8<311 в направлении прямой реакции (Схема 4−0-2, вариант Б).

В экспериментах по регистрации закисления внутри вывернутых мембранных частиц было показано, что обратная, фумарат-редуктазная реакция не сопровождается образованием Д|Ш+. Кроме того, фумарат-редуктазная активность 8(^11 не ингибируется при разобщении. Следовательно, роль ДцН+ заключается не в поддержании активной конформации фермента при катализе в том или ином направлении.

Из полученных нами результатов и их сопоставления с данными других авторов следует, что 8(^11 из В. яиЬНИх, а также другие двугемовые сукцинат: менахинон-редуктазы и менахинол: фумарат-редуктазы могут работать, в зависимости от обстоятельств, по двум механизмам: электрогенному и электронейтральному.