Анализ кинетики вызванной секреции квантов медиатора и ее вклада в формирование амплитудно-временных характеристик многоквантового тока концевой пластинки

Актуальность исследования.

В последние десятилетия временной ход секреции (ВХС) квантов медиатора в ответ на раздражение двигательного нерва рассматривают как важный фактор, регулирующий синаптическую передачу возбуждения, который по своей функциональной значимости сопоставим с такими пресинаптическими механизмами модуляции как изменение интенсивности секреции (квантовый состав) и размер кванта (Зефиров, Гафуров, 1997, 2000, Giniatullin et al, 1995, Bukharaeva et al., 1999, Pamas et al, 2001, Wood, Slater 2001). В нервно-мышечных синапсах холоднокровных, протяженные двигательные нервные окончания которых характеризуются низкой скоростью проведения возбуждения (Braun, Schmidt, 1961, Katz, Miledi, 1965), ВХС определяется неодновременным вовлечением в процесс нейросекреции активных зон, находящихся на разном расстоянии от последнего перехвата Ранвье, и стохастическим характером работы каждой активной зоны (Зефиров, Гафуров 1997, 2000, Katz, Miledi, 1965, Barrett, Stevens, 1972). Наиболее распространенным методом исследования ВХС является изучение характера распределения величин истинных синаптических задержек одноквантовых ответов (Katz, Miledi, 1965). Однако очевидно, что данные, полученные в условиях искусственно сниженной интенсивности выделения медиатора из ограниченного участка нервной терминали не позволяют судить о ВХС квантов медиатора в целом синапсе, формирующих многоквантовый ток концевой пластинки (ТКП) при физиологическом уровне секреции. Современные компьютерные технологии позволили развить методы определения кинетики секреции квантов, основанные на математическом анализе экспериментально зарегистрированных синаптических ответов (Auman, Pamas 1991, Van der Kloot, 1988, Bykhovskaya et al. 1999, Neher, Sakaba, 2001), однако и они имеют целый ряд ограничений и не дают возможности оценить, какие из факторов, определяющих кинетику выделения квантов медиатора, значимы для обеспечения эффективности синаптической передачи в конкретных физиологических 7 условиях. В связи с этим актуальным представляется развитие исследований в двух направлениях: первое — изыскание новых подходов для определения ВХС на основе экспериментально зарегистрированных многоквантовых и одноквантовых ТКП, второес помощью метода математической реконструкции многоквантовых ТКП из одноквантовых сигналов с учетом изменения параметров ВХС по ходу нервной терминали выяснить значимость для амплитудно-временных характеристик многоквантового ТКП таких параметров ВХС, как минимальные синаптические задержки, модальные значения и степень флуктуаций синаптических задержек при различных воздействиях, модулирующих нервно-мышечную передачу. Исследование процессов, обусловливающих несинхронность выделения квантов медиатора и молекулярных механизмов действия агентов, модифицирующих временной ход секреции, может представлять интерес не только для фундаментальной нейробиологии (приближая нас к пониманию механизмов квантовой секреции), но и для практической медицины (изыскание фармакологических препаратов, модулирующих синаптическую передачу за счет влияния на кинетику выделения квантов медиатора).

Цель и основные задачи исследования.

Целью данной работы было определение кинетики вызванной секреции квантов медиатора, формирующих многоквантовые токи концевой пластинки, и оценка ее вклада в амплитудно-временные характеристики постсинаптического ответа при воздействиях, модулирующих нервно-мышечную передачу.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Создать новый метод определения временного хода секреции квантов медиатора, формирующих многоквантовый постсинаптический ответ.

2. Исследовать кинетику секреции квантов медиатора в условиях полноценного квантового состава при воздействиях, модулирующих освобождение квантов (изменение температуры среды, содержания ионов кальция и действие карбахолина) 8.

3. Оценить роль проксимо-дистального градиента основных параметров временного хода секреции (минимальная синаптическая задержка, модальные значения и степень флуктуаций синаптических задержек) в формировании кинетики освобождения квантов из всей нервной терминали.

4. Оценить значение изменения параметров временного хода секреции квантов из двигательного нервного окончания при изменении температуры среды, содержания ионов кальция и при действии карбахолина для амплитудно-временных характеристик многоквантовых токов концевой пластинки.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработан новый метод (метод «последовательного вычитания»), позволяющий производить одновременную оценку временного хода секреции медиатора и ее интенсивности при «физиологическом» уровне нейросекреции.

2. Холиномиметик карбахолин увеличивает асинхронность вызванного освобождения квантов медиатора, что приводит к снижению амплитуды и затягиванию временных характеристик многоквантового тока концевой пластинки.

Научная новизна.

В ходе проведенных исследований с помощью нового метода «последовательного вычитания» впервые произведен анализ временного хода секреции медиатора при физиологическим уровне освобождения квантов при изменении температуры среды, варьировании концентрации ионов кальция и действии аналога ацетилхолина карбахолина. Установлено, что снижение температуры среды и содержания ионов кальция приводит к возрастанию асинхронности выделения квантов в синапсе. Впервые показано, что в пресинаптическом действии карбахолина, угнетающего синаптическую передачу, имеет место компонент, связанный с увеличением степени асинхронности выделения квантов из нервного окончания. Анализ временного хода секреции квантов показал, что в основе десинхронизирующего эффекта карбахолина лежит возрастание 9 минимальной синаптической задержки и повышение асинхронности выделения квантов, наиболее выраженное в удаленных отделах нервной терминали. Математическая реконструкция многоквантового ТКП показала, что такое изменение кинетики выделения квантов медиатора под действием карбахолина, наряду с уменьшением квантового состава, приводит к дополнительному снижению амплитуды и затягиванию переднего фронта постсинаптического ответа. Исследования временных параметров, определяющих кинетику секреции квантов из нервной терминали, основанные на экспериментально установленных закономерностях изменения минимальной синаптической задержки, модальных значений и степени синхронности секреции по ходу терминали, показали, что снижение минимальной синаптической задержки и повышение степени синхронности секреции по мере удаления от последнего перехвата Ранвье и их разная чувствительность к модулирующим воздействиям приводят к синхронизации освобождения квантов в синапсе и тем самым обеспечивают повышение амплитуды и уменьшение времени нарастания переднего фронта многоквантового постсинаптического ответа.

Научно-практическая ценность.

Практическая значимость результатов данного исследования состоит в разработке нового метода, позволяющего одновременно оценивать как интенсивность, так и временной ход освобождения квантов медиатора, формирующих многоквантовый ток концевой пластинки. Анализ получаемых с помощью этого метода параметров временного хода секреции и квантового состава токов концевой пластинки при различных воздействиях дает новые возможности для исследования молекулярных механизмов процесса секреции медиатора в синапсе, в условиях максимально приближенных к физиологическим.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы доложены на Итоговых конференциях КИББ РАН (Казань, 1998, 1999, 2000) — V, VI, VII Всероссийских школах молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 1998, 1999, 2000) — Международном симпозиуме «Холинергические механизмы» (Майнц, Германия, 1995), симпозиуме «Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке», (Казань, 1996), III Республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 1997), 2 Биохимическом съезде РАН (Москва, 1997), Школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000) — Всероссийской конференции «Физиология нейротрансмиттеров» (Москва, 2000).

Структура и объем диссертации

.

Диссертация объемом 130 страницы состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 130 источников, из них 100 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 52 рисунками и 6 таблицами.

6. выводы.

Последовательное вычитание со сдвигом по шкале времени одноквантового тока концевой пластинки из зарегистрированного в той же клетке многоквантового ответа позволяет описать временной ход секреции и количество квантов медиатора, участвующих в его формировании при «физиологическом» уровне нейросекреции. Снижение температуры среды, содержания ионов кальция и карбахолин вызывают возрастание асинхронности выделения квантов медиатора, формирующих многоквантовый ток концевой пластинки.

Изменение параметров вызванной секреции медиатора (минимальной синаптической задежки, модальных значений и степени флуктуаций синаптических задержек) по ходу нервной терминали обеспечивает синхронизацию выделения квантов из всего нервного окончания, что приводит к повышению амплитуды и уменьшению длительности многоквантового ТКП.

Изменение временного хода секреции квантов при повышении температуры среды от 10° до 28° С влияет на амплитуду и длительность многоквантового ТКП в большей степени, чем соответствующие изменения амплитудно-временных параметров одноквантовых ТКП и интенсивности квантовой секреции.

Увеличение концентрации ионов кальция в среде приводит к возрастанию амплитуды ТКП не только за счет роста квантового состава, но и благодаря повышению степени синхронности освобождения квантов медиатора из нервной терминали.

Увеличение асинхронности секреции квантов медиатора под действием карбахолина, наряду с изменениями свойств постсинаптической мембраны и снижением квантового состава ТКП, вносит дополнительный вклад в снижение амплитуды и увеличение длительности переднего фронта многоквантового ТКП.

5.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В течение многих лет основным экспериментальным методом оценки временного хода секреции квантов медиатора из нервного окончания было измерение истинных синаптических задержек одноквантовых ТКП, которое осуществляли в условиях искусственно сниженного уровня нейросекреции (Katz, Miledi, 1965, Barrett, Stevens, 1972). Вместе с тем, очевидно, что для оценки физиологической роли кинетики выделения медиатора интерес представляют результаты исследований, выполненных в условиях, обеспечивающих полноценную, приближенную к физиологической, интенсивность освобождения квантов. Существующие в настоящее время методы, позволяющие математическими методами из экспериментально зарегистрированных ТКП и одноквантовых ТКП получать кривую, описывающую кинетику выделения квантов, формирующих многоквантовый сигнал имеют определенные недостатки (Auman, Pamas 1991, Van der Kloot, 1988, Bykhovskaya et al. 1999). Это привело нас к необходимости разработать собственный метод получения временного хода секреции квантов в целом синапсе, используя экспериментально измеренные в условиях двухэлектродной фиксации мембранного потенциала ТКП и одноквантовые ТКП. Этот метод, основанный на последовательном вычитании из многоквантового сигнала одноквантового ТКП со смещением последнего по шкале времени, успешно прошел тестирование с использованием как модельных сигналов, максимально приближенных к реальным ТКП и одноквантовым ТКП, так и с реальными сигналами. Метод «последовательного вычитания» позволяет с задаваемой степенью точности получать временной ход секреции квантов для отдельного ТКП, основываясь на наборе вычисленных латентных периодов, и оценивать при этом его квантовый состав. Проведенный с помощью данного метода анализ временного хода секреции многоквантовых ТКП, зарегистрированных при изменении температуры среды, изменении концентрации ионов кальция и действии карбахолина, показал, что при этих.

110 воздействиях происходит изменение кинетики освобождения квантов медиатора. Причем, если при снижении содержания ионов кальция и при действии КХ, повышение асинхронности выделения квантов медиатора сопровождается падением квантового состава ТКП, то при уменьшении температуры от 20° до 10° С количество освобождаемых квантов существенно не изменяется. Для выявления причин, лежащих в основе изменения интегрального временного хода освобождения квантов в целом синапсе, наблюдаемых при исследованных модулирующих воздействиях, приводящих к изменению временного хода секреции и исследовать, как при этом изменяются амплитудно-временные характеристики многоквантовых сигналов, был применен использовавшийся ранее метод реконструкции многоквантового ТКП (Зефиров, Гафуров 1957,1997,Soucek, 1971, Van der Kloot 1988) после модифицикации его с учетом данных о различных характеристиках квантовой секреции в разных участках нервной терминали.

Особенностью нервно-мышечного соединения лягушки является значительная протяженность и наличие гетерогенности свойств вдоль нервного окончания (Robitaille, Tremblay, 1987). Длина немиелинизированной части аксона составляет от 100 до 500 мкм (Безгина Е. и др. 1987, Mattehews-Bellinger J, Salpeter M 1978). По мере приближения к дистальному участку имеет место изменение диаметра терминали и плотности ионных каналов, участвующих в генерации потенциала действия, что приводит к существенному замедлению скорости распространения возбуждения по терминали (Ходоров, 1975, Зефиров, Халилов 1985, Никольский и др. 2000, Katz, Miledi, 1965). В связи с низкой скоростью проведения потенциала действия по нервному окончанию удаленные его участки включаются в процесс секреции медиатора с запаздыванием, что лежит в основе пространственной асинхронности освобождения квантов медиатора (Зефиров, Гафуров, 1995, 1997, Никольский и др. 2000, Katz, Miledi, 1965с). Наряду с пространственной асинхронностью секреции квантов, имеет место и асинхронность, обусловленная.

Ill распределением во времени моментов срабатывания каждой активной зоны секреции, которую анализируют по распределению истинных синаптических задержек одноквантовых ТКП, регистрируемых экстраклеточно от отдельного участка терминали (Katz, Miledi, 1965а). Таким образом, временные параметры процесса освобождения квантов из всей нервной терминали определяются как скоростью проведения потенциала действия по нервному окончанию, так и характером работы отдельных активных зон секреции. Оценка вклада асинхронности выделения квантов медиатора в формировании многоквантового ТКП осуществляется методом математической свертки одноквантового ТКП и кривой, описывающей временной ход секреции квантов (Van der Kloot 1988а, б). До недавнего времени в основе описания временного хода секреции квантов из целой нервной терминали лежало представление о том, что временные параметры срабатывания отдельных активных зон одинаковы по ходу нервного окончания (Зефиров, Гафуров, 1995, 1997, Giniatullin et al, 1995). Однако проведенные в нашей лаборатории исследования показали, что временной ход секреции квантов имеет свои особенности в проксимальных, центральных и дистальных отделах нервного окончания (Гайнулов и др., 1999, Никольский и др. 2000). Поэтому в данной работе, которая является продолжением этих исследований, были выявлены закономерности изменения интенсивности и временных параметров срабатывания активных зон секреции по ходу протяженной терминали в контроле и при воздействиях, изменяющих секреторный процесс, с целью учета этих закономерностей в определении кинетики процесса выделения квантов из всей нервной терминали. Полученные экспериментальные данные при варьировании расстояния между микроэлекродами, регистрирующими одноквантовые ТКП, показали, что в зависимости от степени удаленности активных зон секреции от окончания миелинизированной части аксона наблюдалось наряду со снижением интенсивности секреции, уменьшение минимальных синаптических задержек и степени флуктуаций синаптических задержек, которое свидетельствовало о.

112 возрастании синхронности в каждом участке терминали. Наличие обнаруженных закономерностей изменения параметров секреции квантов вдоль нервного окончания привело к необходимости модернизации аналитического описания временного хода секреции из всей терминали. Использование разработанного метода описания кинетики секреции из терминали, наряду с получением кривой, представляющей временной ход при разных экспериментальных условий (изменение температуры среды, варьирование концентрации ионов кальция, влияние биологически активных соединений), позволило установить какие из особенностей кинетики секреции по ходу терминали вносят наиболее существенный вклад в формирование общего временного хода освобождения квантов для всей терминали. Проведенный анализ показал, что наличие проксимо-дистального градиента величины минимальной синаптической задержки является фактором, компенсирующим асинхронность срабатывания активных зон, обусловленную низкой скоростью проведения потенциала действия по нервному окончанию. Установлено, что за счет существования такого градиента максимальная вероятность секреции квантов из всей терминали повышалась и снижалась длительность фазы нарастания и фазы спада кривой ВХСТ. Причем вклад градиента минимальных синаптических задержек был более выражен при снижении температуры среды, когда скорость проведения возбуждения по терминали падала. В предыдущих модельных исследованиях при оценке роли временного хода в формировании амплитудно-временных параметров многоквантовых ТКП обсуждался вопрос о том, насколько асинхронность секреции квантов снижает амплитуду ТКП, т. е. ухудшает условия синаптической передачи (Зефиров, Гафуров 1997, йшаШНт ег а1, 1995). Однако, как следует из полученных нами результатов, наличие градиента параметров кинетики секреции квантов (особенно минимальной синаптической задержки и параметра Р90) по ходу терминали не только не ухудшает синаптическую передачу, а напротив, обеспечивает компенсацию замедления скорости проведения потенциала действия по.

113 нервному окончанию, приводя к возрастанию амплитуды ТКП и уменьшению времени его нарастания. Поскольку изменение температуры среды помимо снижения скорости проведения возбуждения и увеличения асинхронности секреции квантов, оказывало значительное влияние и на амплитуду и длительность одноквантовых ТКП, то был проанализирован также и вклад изменения этих параметров в характеристики многоквантового ТКП, при этом установлено, что изменение одноквантовых ТКП в существенно меньшей степени сказывается на амплитуде и временных параметрах многоквантового ТКП, чем изменение временного хода секреции квантов.

Одним из методических подходов, позволяющим анализировать роль кинетики секреции для формирования многоквантового ТКП, является исследование различных воздействий или физиологически активных веществ, влияющие на интенсивность секреции квантов или на временные параметры срабатывания активных зон секреции (Datyner, Gage, 1980, Bukharaeva et al. 1999, Pamas, Pamas 1999), или на то и другое одновременно (Matzer et al, 1988, Molgo et al, 1989, Nikolsky et al, 1995), которые могут по-разному изменять эти характеристики в разных отделах терминали (Никольский и др. 2000). В связи с этим нами было проведено исследование закономерностей изменения кинетики секреции квантов, получены кривые ВХСТ и реконструированы многоквантовые ТКП при изменении содержания ионов кальция в среде, которые преимущественно влияют на квантовый состав и в меньшей степени синхронизируют секрецию в проксимальных участках терминали, чем в дистальных (Никольский и др. 2000) и карбахолина, который, как известно, влияет на квантовый состав ТКП (Никольский, Гиниатуллин 1979, Ciani, Edwards 1979), и, как следует из наших предварительных исследований, на степень синхронности секреции (Гайнулов и др. 1996, Nikolsky et al, 1995).

Полученные при экстраклеточной регистрации закономерности изменения параметров кинетики секреции вдоль терминали при варьировании содержания ионов.

114 кальция в среде позволили получить кривые ВХСТ при разных [Са2+]0 и установить кальциевую зависимость их параметров. Проведенный анализ показал, что по мере возрастания [Са2+]0 существенно возрастала вероятность освобождения квантов из терминали и уменьшались параметры, описывающие задний фронт ВХСТ, что указывало на увеличение синхронности выделения квантов из всей терминали. Анализ ТКП при исследованных концентрациях ионов кальция показал, что за счет такой синхронизации наблюдается дополнительное, не обусловленное увеличением квантового состава, возрастание амплитуды ТКП и укорочение его временных параметров. Исследование параметров секреции квантов в присутствии карбахолина показало, что на его фоне кривая ВХСТ претерпевала существенные изменения, которые проявлялись в снижении максимальной вероятности освобождения и затягивании переднего и заднего фронта, что в свою очередь вносило дополнительный вклад в снижение амплитуды и увеличивало длительность переднего фронта многоквантового ТКП.

Из проведенного анализа зависимости амплитуды многоквантового ТКП от параметров временного хода секреции квантов медиатора, изменяющихся при таких воздействиях, как варьирование температуры среды, изменение содержания ионов кальция, действие карбахолина, следует, что амплитуда ТКП может изменяться не только за счет изменения количества освободившихся квантов, т. е. его квантового состава, (а в случае влияния температуры — даже при отсутствии такого изменения), но и за счет модуляции параметров кинетики секреции. Это приводит к необходимости расценивать общепринятый метод определения среднего квантового состава ТКП путем деления средней амплитуды ТКП на среднюю амплитуду многоквантового ТКП как недостаточно корректный.

Таким образом, проведенное исследование показало, что кинетика секреции квантов медиатора является важным пресинаптическим фактором, способным модулировать амплитудно-временные параметры многоквантовых постсинаптических.

115 ответов, и ее исследование необходимо для понимания молекулярных механизмов, участвующих в процессе выделения квантов медиатора из нервного окончания и выявления способов обеспечения эффективности синаптической передачи.