Образование перекиси водорода при работе дыхательной цепи митохондрий сердца: Регулирующая роль жирных кислот и цитохрома c

Основная масса АТФ в эукариотических клетках синтезируется в митохондриях. При этом используется энергия, выделяющаяся при опосредованном окислении субстратов дыхания молекулярным кислородом, принимающим четыре электрона и восстанавливающимся до воды. Однако в процессе переноса электронов по дыхательной цепи возможен ряд побочных реакций, в результате чего происходит одноили двухэлектронное восстановление молекулярного кислорода. Продуктами таких реакций являются соответственно супероксидрадикал и перекись водорода. Оба эти вещества наряду с гидроксилрадикалом относятся к активным формам кислорода (АФК), обладающим повышенной химической активностью.

Показано, что митохондрии являются основным источником эндогенных АФК в эукариотических клетках. Также хорошо известно, что из-за чрезвычайно высокой химической активности некоторых АФК (в частности, гидроксилрадикала) возможно окисление ряда макромолекул, играющих важную роль в функционировании клетки, в первую очередь ядерной и митохондриальной ДНК. Показано, что нарушения в клеточном геноме накапливаются с возрастом и ряд теорий старения организма отводит химическому окислению ДНК ключевую роль. Также доказано, что повышенная продукция АФК индуцирует апоптозпрограммируемую клеточную смерть. В связи с этим представляется актуальным выяснение факторов, регулирующих уровень продукции АФК митохондриями и исследование возможных механизмов защиты от окислительного стресса.

Теоретически возможны два пути регуляции уровня АФК в клетке: устранение молекул АФК различными антиоксидантными системами и наличие некоторого механизма, снижающего скорость генерации АФК. Практически все из известных систем, обеспечивающих защиту клетки от неблагоприятных последствий окислительного стресса (каталаза, пероксидазы, супероксиддисмутазы, ДНКрепарирующие системы и др.) обладают одним существенным недостатком: их действие направлено на обезвреживание молекул АФК или репарацию уже поврежденных биомолекул, в то время как гораздо эффективнее было бы снизить уровень продукции АФК как таковой.

Анализ литературных данных не дает однозначного ответа на вопрос, каким именно образом клетка может регулировать скорость продукции АФК, однако позволяет предположить, что скорость генерации АФК зависит, в частности, от величины трансмембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий. Интересной возможностью является также роль одного из компонентов дыхательной цепицитохрома с — как антиоксиданта, поскольку давно известна его способность реагировать с супероксидрадикалом, окисляя последний в молекулярный кислород. В настоящей работе мы попытались выяснить степень зависимости скорости продукции АФК от мембранного потенциала и исследовать свойства цитохрома с как антиоксиданта, а также предложить возможные механизмы регуляции продукции АФК митохондриями сердца.

В первой части работы предполагалось выяснить условия, при которых скорость продукции АФК в митохондриях сердца максимальна, а также уточнить вклад различных участков дыхательной цепи в общий уровень продукции АФКдалее изучалась зависимость скорости продукции АФК от трансмембранного потенциала и возможная роль природных разобщителейжирных кислоткак фактора, регулирующего уровень продукции АФК. Затем предполагалось исследовать обязательный компонент дыхательной цепи митохондрийцитохром с — как возможный антиоксидант.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Активные формы кислорода.

Активные формы кислорода (АФК) играют важную роль в различных физиологических и патологических процессах, происходящих в живых системах. Этот термин применяется к различным группам молекул кислорсда, либо находящихся в возбужденном электронном состоянии, либо ненулевой степени окисления, а также к их соединениям с водородом, азотом и хлором (исключениями являются вода и оксид азота N0). АФК обладают широким спектром свойств и химической активности, а также могут легко превращаться друг в друга.

Электронное строение молекулы кислорода таково, что два из двенадцати внешних электронов являются неспаренными, образуя два свободнорадикальных центра. Таким образом, молекула кислорода является бирадикалом, молекулярный кислород парамагнитен и наиболее устойчивым для него является триплетное состояние ъ0г [3]. Он легко может вступать в химические реакции с другими парамагнитными ионами и молекулами, однако законы спинового перехода создают барьер при реакции триплетного кислорода с обычными диамагнитными молекулами, в которых все электроны спарены. Таким образом, молекулярный кислород химически относительно малоактивен.

Чтобы 3С>2 стал химически активен, он должен либо принять один электрон, либо обратить спин одного из неспаренных электронов. В последнем случае он превращается в синглетный кислород 102, который, в отличие от 3С>2, легко реагирует с соединениями, в молекулах которых присутствуют участки повышенной электронной плотности и образует при этом пероксиды [8]. Для превращения синглетного кислорода в триплетный нужно преодолеть барьер примерно в 22,7 ккал/моль [10, 11]. Необходимая энергия может быть поставлена при различных химических или фотохимических реакциях, классическим примером является перенос энергии на 3Ог с другой молекулы (сенсибилизатора), предварительно возбужденной светом.

Если же 3С>2 в результате химической реакции приобретает еще один электрон (например, реагируя с семихиноном или флавином), то он превращается в анион супероксида, который является монорадикалом, а, следовательно, также парамагнитен. По этой причине он также химически неактивен в отношении большинства органических молекул. Величина стандартного электродного потенциала пары Ог'/Ог, определенная в разных группах, варьирует от -0,59 В до -0,19 В, но большинство определений дает величину -0,33 В [12, 13, 14]. Таким образом, сам по себе супероксид-радикал является скорее восстановителем, чем окислителем. Однако он является важнейшим предшественником многих других АФК. Ог" является слабым основанием и при протонировании превращается в гидроперекисный радикал (рКа = 4,8), который также химически не очень активен, но, в отличие от своего предшественника, не так сильно гидрагирован и лучше преодолевает гидрофобные барьеры [9].

Рис 1 Схема образования и превращений различных молекул АФК.

Как супероксид, так и гидроперекисный радикалы способны дисмутировать, при этом в водном растворе образуются 3С>2 ^Ог) с одной стороны и перекись водорода Н2О2 — с другой [6, 15].

Перекись водорода уже сама по себе является довольно сильным окислителем, она способна легко преодолевать гидрофобные барьеры и бепрепятственно проникать в клетки и различные клеточные компартменты. Главное, что перекись водорода может при этом участвовать в одноэлектронных процессахклассическим примером является реакция Фентона, в результате которой перекись водорода дает два продукта: полностью восстановленный гидроксилион ОН" и неполностью восстановленный гидроксилрадикал ОН.

Гидроксилрадикал является сильнейшим окислителем, способен реагировать практически с любой биологической молекулой, отнимая у нее атом водорода или разрывая двойные связи, инициируя цепные реакции.

4].

Среди оставшихся нерассмотренными АФК следует также упомянуть пероксинитританион ОНОО", чрезвычайно быстро образующийся при реакции О2″ с N0 [16]. Пероксинитрит с одной стороны, достаточно стабилен, с другойявляется сильным окислителем, поскольку связь 0−0 вдвое слабее таковой в перекиси водорода [17], и при ее разрыве он распадается на N02 и гидроксилрадикал.

При реакции перекиси водорода с хлоридионом (при участии миелопероксидазы) образуется сильный окислитель — гипохлоритион 0С1, который способен окислять или хлорировать многие биомолекулы, а процесс протонирования гипохлоритиона в конечном счете приводит к образованию синглетного кислорода [18].

Негативное действие гиперпродукции АФК на живые системы и защита от кислородной опасности.

АФК и старение организма.

В процессе жизнедеятельности в клетках постоянно образуется некоторое количество АФК. Источников АФК известно довольно много, например, цитохром Р450 и различные оксигеназы, окисляющие при помощи молекулярного кислорода различные ксенобиотики, однако для большинства клеток основным из них признана дыхательная цепь митохондрий [19]. Как уже было рассмотрено выше, некоторые из АФК являются чрезвычайно сильными окислителями, способными повреждать практически все виды биомолекул, в том числе белки, липиды и, что особенно важно, нуклеиновые кислоты. В последнем случае особенную опасность представляет окисление ядерной и митохондриальной ДНК, поскольку при этом страдает генетический аппарат клетки. Показано, что в клетке происходит около 10 ООО окислительных модификаций ДНК в день, и при этом вполне разумно предположить, что не все из них подвергаются репарации [20]. АФК рассматриваются в качестве основного фактора, обусловливающего возрастную дисфункцию тканей, а также таких возрастных болезней, как различные расстройства ЦНС, снижение иммунитета [20, 22, 23] и развитие злокачественных новообразований [21].

Показано, что с возрастом снижается вязкость клеточных и митохондриальных мембран, что связано с усилением перекисного окисления липидов.

Совершенно очевидно, что постепенное накопление повреждений ДНК с возрастом должно отрицательно сказываться на жизнедеятельности как отдельной клетки, так и всего организма. При этом с возрастом должна особенно страдать митохондриальная ДНК, поскольку именно она находится в непосредственной близости от основного клеточного источника АФК. Что касается ядерной ДНК, то опасность окислительного модифицирования для нее ниже, так как молекуле АФК приходится преодолевать ряд защитных барьеров, прежде чем попасть в ядро (см. ниже). Исследования показали, что уровень окислительного повреждения митохондриальной ДНК в клетках печени крысы и мозга человека в несколько раз выше, чем ядерной [24]. Анализ митохондриальной ДНК в гидролизате образцов миокарда человека показывает, что содержание основного маркера окислительного повреждения ДНК- 8-ОН-дезоксигуанозинапрактически нулевое у лиц до 40 лет, после чего возрастает экспоненциально и к 90 годам достигает отметки 1,5% от общего содержания дезоксигуанозина [25]. При этом резко возрастает количество делеций митохондриальной ДНК [25].

Хроническое окислительное повреждение митохондриальной ДНК приводит к накоплению мутаций, что, в свою очередь, ведет к дефектам в компонентах дыхательной цепи. Дефективная дыхательная цепь не только хуже функционирует, но и производит повышенное по сравнению с неповрежденной дыхательной цепью количество АФК [31- 34], повышая при этом вероятность окислительного повреждения ядерной ДНК.

Защитные системы клетки.

Поскольку АФК непрерывно образуются в процессе клеточного дыхания, представляя собой при этом потенциальную угрозу функционированию живой системе, в клетке предусмотрен ряд мер, направленных на снижение ущерба, наносимого клеточным системам активными формами кислорода.

В принципе возможны два пути предотвращения негативных последствий окислительного стресса. Првый заключается в том, чтобы обезвредить образовавшиеся молекулы АФК, то есть либо провести при этом четырехэлектронное восстановление кислорода до воды, либо окислить молекулу АФК обратно до молекулярного кислорода прежде, чем она достигнет важных биомолекул.

Для реализации этого пути в клетке существует набор ферментов и специальных веществ, субстратами которых и являются АФК.

Супероксиддисмутазы.

Эти ферменты впервые были обнаружены в 1969 году. Позднее оказалось, что они очень широко распространены в природе и, пожалуй, сложно назвать такую живую систему, в которой они бы отсутствовали. Все супероксиддисмутазы (СОД) катализируют реакцию диспропорционирования двух молекул супероксидрадикала:

02″ + 02″ + Н202 + 02.

Реакционный центр СОД содержит атом (ы) металла. Скорость реакции очень велика и, повидимому, ограничивается лишь диффузией супероксида. Эта реакция может протекать и самопроизвольно, однако фермент увеличивает ее скорость на два порядка [9]. Общая схема превращений при катализе следующая: Меп+ + 02″ -> + 02.

Ме (п-1)+ + о2- + 2К1″ -" Меп+ + Н202.

Все известные СОД можно разделить на три группы. Первая включает в себя ферменты цитозоля эукариот. Все они содержат в качестве каталитического центра атом меди и атом цинка. Редоксцентром системы служит медь, цинк выполняет структурную роль [6]. Фермент состоит из двух одинаковых субъединиц массой около 16 кДа каждая. Этот тип СОД ингибируется цианидом [6]. В последнее время появились данные, свидетельствующие о наличии медьцинковой СОД в периплазматическом пространстве бактерий [28].

Второй тип СОДмарганецсодержащие ферменты. Они встречаются в прокариотах, а также в матриксе митохондрий. Масса субъединицы марганцевой СОД около 20 кДа [6]. Наличие марганцевой СОД в матриксе митохондрий лишний раз подтверждает гипотезу о происхождении митохондрий от симбионтовпрокариот.

Последняя разновидность супероксиддисмутаз включает в себя железосодержащие бактериальные СОД. Строение железосодержащих и марганецсодержащих ферментов очень близко [6].

Долгое время оставалась неясной биологическая роль этих ферментов. Казалось бы, супероксидрадикалгораздо более безобидное образование, чем продукт его дисмутацииперекись водорода. Тем более странно, что бактериальные мутанты, в которых СОД отсутствовала, были практически нежизнеспособны в присутствии кислорода [27, 30].

Ситуация прояснилась, когда обнаружилось, что супероксидрадикал способствует освобождению двухвалентного железа из реакционных центров некоторых белков, содержащих железосерные негемовые кластеры. В качестве примера можно привести инактивацию митохондриальной аконитазы и бактериальной НАДНдегидрогеназы II [26, 27, 30]. При этом в клетке значительно возрастает концентрция ионов железа, что ведет к усилению образования гидроксилрадикалов (реакция Фентона). В качестве подтверждения этого предположения можно привести тот факт, что проникающие хелаторы железа резко снижали чувствительность СОДдефицитных мутантов к перекиси водорода [26].

Каталазы.

Все каталазы катализируют следующую реакцию: Н202 + Н202^2Н20 + 02.

При этом две молекулы потенциально опасного веществаперекиси водородапревращаются в безвредные воду и кислород. Каталазная активнось наблюдается во всех живых системах, кроме облигатных анаэробов, при этом одна молекула каталазы может разложить 44 ООО молекул перекиси водорода в секунду. Каталаза — четырехсубъединичный фермент (масса молекулы каталазы из печени быкаоколо 248 кДа) с четырьмя гемовыми группами. При присоединении к ней первой молекулы Н202 она образует относительно стабильный комплекс, который может реагировать с необратимым ингибитором каталазы 3-амино- 1,2,4-триазолом [6]. Представляется весьма вероятным, что тандем каталаза-супероксиддисмутаза является одним из основных средств борьбы клетки с кислородной опасностью.

Каталазная реакция является частным случаем пероксидазной реакции. Пероксидазыферменты, окисляющие какойлибо субстрат перекисью водорода, при этом последняя превращается в воду. В общем виде пероксидазная реакция выглядит так: Н202 + ОН-Я-ОН 2Н20 + 0=11=0.

В отличие от каталаз, у пероксидаз спектр субстратов весьма широк, однако пероксидазы работают гораздо медленнее каталаз (примерно в 10 ООО раз) [5]. Пероксидазы относительно мало распространены в животных клетках, однако широко используются растениями. Из интересующих нас пероксидаз можно назвать пероксидазу хрена с мол. массой около 44 кДа. Она содержит одну гемовую группу на молекулу белка и реагирует последовательно с молекулой перекиси водорода, образуя так называемый комплекс I:

ЕН20 + Н202 -> ЕН202 (комплекс 1)+ Н20 который можно отследить спектрофотометрически (максимум поглощения 405 нм). Затем комплекс I окисляет молекулу субстрата [6].

Особенно важное значение в защите от окислительного стресса имеет глутатионпероксидаза. Этот фермент катализирует окисление трипептида глутатиона (глутамилвалилцистеина) перекисью водорода, которая при этом восстанавливается до воды. Молекулярная масса фермента около 80 кДа и он содержится как в матриксе, так и в цитозоле клетки. Концентрация глутатиона в клетке и, в частности, в матриксе, очень велика и зачастую превосходит 1 мМ [5]. Поддерживать пул глутатиона в восстановленном состоянии помогает фермент глутатионредуктаза (мол. масса около 110 кДа), которая восстанавливает окисленный глутатион за счетНАДФН[5, 6].

Второй способ защиты от окислительного стресса: снижение скорости образования АФК.

Оптимизация концентрации кислорода.

Образование АФК в процессе дыхания происходит, как правило, неферментативным путем и линейно зависит от концентрации кислорода [37], в то время как четырехэлектронное восстановление молекулярного кислорода осуществляется энзиматически и подчиняется законам ферментативной кинетики. Известно, что ряд терминальных оксидаз обладает исключительно высоким сродством к кислороду, в частности, Кт цитохромоксидазы около 1 мкМ. Рис. 2 иллюстрирует динамику образования АФК и скорости дыхания при изменении концентрации кислорода [53]. Очевидно, что наиболее благоприятная для живой системы область концентраций кислорода лежит между 1 мкМ и 10 мкМ (область.

Б). При этом концентрация кислорода в воде при парциальном давлении 0,2 атм достигает 240 мкМ.

На организменном уровне оптимизацию концентрации кислорода можно проводить при помощи регуляции вентиляции легких, изменения динамики кровообращения и прочих подобных приемов. Однако подобные способы имеют ряд недостатков, например создание сильных градиентов концентрации кислорода в тканях, а, кроме того, неприменимы для одноклеточных организмов. В связи с этим клеточное дыхание, как сопряженное с запасанием энергии, так и не сопряженное с таковым, может рассматриваться как эффективный способ оптимизации концентрации Ог[ [53].

Некоторые из бактериальных терминальных оксидаз, такие, как оксидазы dтипа азотфиксирующих бактерий и Е. coli восстанавливают кислород за счет субстратов дыхания, однако не сопряжены с запасанием энергии. При этом недостаток этих ферментов приводит к подавлению фиксации азота у азотфиксаторов в присутствии кислорода и угнетению роста мутантов Е. coli в аэробных условиях [53, 54].

Аналогичные функции потребителей кислорода могут играть цанид-резистентная терминальная оксидаза растений и НАДНцитохром Ь5 редуктаза животных [55].

10* 10″ 7 10~6 10″ 5 1<И [ o2h м.

Рис. 2 Зависимость скорости ферментативного четырехэлектронного восстановления кислорода и неферментативного одноэлектронного восстановления кислорода дыхательными цепями живых организмов от концентрации кислорода в среде (по Papa S., Skulachev Р, 1997).

Разобщение и образование АФК.

Суммируя все приведенные выше данные о закономерностях образования АФК дыхательной цепью митохондрий можно заключить следующее.

Образование АФК митохондриями максимально в случае так называемого состояния 4 по Чансу, которое характеризуется низкой протонной проводимостью внутренней митохондриальной мембраны, низким содержанием субстратов фосфорилирования (АДФ и неорганического фосфата) и доступностью субстартов дыхания и кислорода. При этом из-за образования высокого AiliH1″ на внутренней мембране резко сижается скорость потребления кислорода, а также повышается уровень восстановленности флавинов, негемового железа и цитохромов b — основных источников электрона для молекулярного кислорода при его одноэлектронном восстановлении [56- 58]. Вследствие этих причин происходит возрастание концентрации кислорода в клетке, а также весьма вероятно увеличение времени жизни семихинонрадикала (6/38), что создает благоприятные условия для одноэлнктронного восстановления кислорода.

Переход митохондрий из состояния 4 в состояние 3 (то есть в состояние, когда синтез АТФ ничем не ограничивается) сопровождается незначительным падением трансмембранного потенциала. В работе Лю и Хуанга было показано, что скорость продукции АФК митохондриями резко возрастает при превышении последним значения 180 мВ [59], из чего можно сделать вывод, что при незначительном разобщении митохондрий можно ожидать значительного снижения скорости образования АФК митохондриальной дыхательной цепью.

Митохондриалъная пора.

Митохондриальная порасложное образование, состоящее из ряда белков, часть из которых встроена во внешнюю мембрану, частьво внутреннюю, а некоторые могут связываться со структурными компонентами поры со сторны цитозоля или митохондриального матрикса. Хотя точная структура поры остается неизвестной, с уверенностью можно назвать три образующих ее встроенных в мембрану компонента. Это АДФ/АТФтранслокатор, находящийся во внутренней мембране митохондрий, и встроенные во внешнюю мембрану белок порин и бензоди. зепиновый рецептор. С последним со стороны цитозоля могут связываться бензодиазепиновые агенты и белок Вс1−2, также со стороны цитозоля к порину может присоединяться гексокиназа. Со строны митохондриального матрикса к АДФ/АТФтранслокатору присоединяется белок циклофиллин О [61].

Для открытия митохондриальной поры необходимо выполнение нескольких условий: падение трансмембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий, возрастание концентрации ионов кальция в матрнксе, связывание циклофиллина с транслокатором [60]. Что особенно интересно, открытие поры может быть индуцировано повышением уровня АФК в цитозоле [62, 63]. В последнем случае важную роль играет окисление тиоловых групп АДФ/АТФтранслокатора.

С другой стороны, существуют факторы, препятствующие открытию митохондриальной поры. Так, циклоспорин, А блокирует взаимодействие циклофиллина с АДФ/АТФтранслокатором, а связывание белка Вс1−2 с бензодиазепиновым рецептором предотвращает образование поры [64].

Сквозь канал, образуемый порином, могут проникать молекулы массой до 1500 Да, таким образом, проводимость мембраны митохондрии при открытии поры возрастает на несколько порядков. При этом наблюдается полное падение трансмембранного потенциала и максимально возможная скорость потребления кислорода.

Открытие митохондриальной поры при возрастании продукции АФК митохондриями может иметь следующий биологический смысл: если по какйлибо причине первоначальное падение трансмембранного потенциала не привело к заметному уменьшению уровня АФК в клетке, открытие поры максимально снижает степень восстановленности компонентов дыхательной цепи и интенсифицирует потребление кислорода дыхательной цепью, что имеет конечной целью снизить его содержание в клетке.

АФК и апоптоз.

Термином «апоптоз» обозначают программированную клеточную смерть. Это явление заключается в том, что после подачи некоторого сигнала начинается конденсирование хроматина и фрагментация ДНК, что ведет к гибели клетки. При этом клетка как бы сама себя разбирает на части, которые затем в течение нескольких часов поглощаются фагоцитами [61]. Апоптоз лежит в основе таких явлений, как исчезновение хвоста головастика и отмирания части черенка при опадании листьев. При этом следует четко различать апоптоз и некрозпоследний рассматривается как непреднамеренная гибель клетки, не регулируемая клеточными системами и несущая потенциальную опасность для соседних клеток изза неконтролируемой активности литических ферментов.

Изучние апоптоза еще далеко от завершения, но уже сейчас понятно, что существует несколько разновидностей этого явления, равно как и факторов его индукции. Впервые это явление описал Керр в 1972 году [65]. В дальнейшем было показано, что апоптоз может быть индуцирован целым рядом факторов, среди которых находятся ингибиторы Комплекса I митохондриальной дыхательной цепи, ионы железа [65] и, что представляет особенный интерес в рамках этой работы, АФК, которые могут выступать как экзогенным, так и эндогенным индуктором этого явления [67, 68].

Ранее предполагалось, что митохондриальные белки практически не принимают участия в апоптозе [69], однако в 1996 году в группе Кремера было показано, в межмембранном постранстве митохондрий содержится белок, который при попадании в цитоплазму активирует апоптическую деградацию клетки [71, 72]. Этот белок массой около 50 кДа был выделен и получил название AIF (apoptosisinitiating factor). Позже было показано, что в мемжембранном пространстве митохондрий содержится несколько белков, способных инициировать апоптоз, в частности, цитохром с.

Апоптоз может протекать поразномуниже будет описана одна из широко наблюдаемых схем.

В целом процесс клеточного самоубийства выглядит следующим образом. Вначале наблюдается некоторое снижение трансмембранного потенциала в митохондриях, одновременно с которым отмечается аккумуляция ионов кальция в митохондриальном матриксе. Эти два события совпадают друг с другом во времени [61]. После этого отмечается повышение концентрации АФК в цитозоле и последующее открытие митохондриальной поры [70]. Полное открытие поры приводит к набуханию митохондриального матрикса, разрыву внешней мембраны и выходу в цитозоль апоптозинициирующих факторов, прежде всего цитохрома с и особых протеаз (каспаз) [71- 74]. На сегодняшний день известно 10 каспаз. Эти белки обладают протеазной активностью, однако синтезируются в виде неактивных предшественников. Взаимодействие цитохрома с с некоторыми из каспаз, например, каспазой 9, приводит к их активации и они, в свою очередь, активируют следующий ряд каспаз, например, каспазу 3. Каспаза 3 приводит в действие эндонуклеазу, осуществляющую фрагментацию ДНК, наблюдаемую примерно после 6 часов с момента снижения трансмембранного потенциала [61, 75].

Появление в цитозоле цитохрома с указывает на начальную стадию апоптоза. Более того, искусственное введение в клетку цитохрома с в микромолярных концентрациях приводит к развитию апоптоза [76]. Есть у Казани-, на то, что увеличение концентрации цитохрома с в цитозоле происходит до открытия митохондриальной поры [77].

Таким образом, открытие митохондриальной поры и последующий разрыв внешней мембраны являются необходимыми шагами для индукции апоптоза. В пользу этого утверждения свидетельствует тот факт, что такие агенты, как циклоспорин, А и белок Вс1−2 блокируют как открытие поры, так и развитие апоптоза [60, 64].

С точки зрения защиты клетки от окислительного стресса, апоптоз-достаточно бессмыссленное явление, но уже в масштабах многоклеточного организма его можно рассматривать как важную, хотя и крайнюю меру борьбы с неконтролируемой продукцией АФК. Рассматриваемую цепь событий при развитии апоптоза можно в этом случае интерпретировать следующим образом: при возрастании уровня АФК в клетке включается механизм «мягкого» разобщения в митохондриях, как потенциально основных источников клеточных АФК. Если после этого снизить уровень продукции АФК не удается, открывается митохондриальная пора. При этом трансмембранный потенциал падает практически до нуля, а скорость поглощения кислорода становится максимальной. Таким образом, преследуются сразу две цели: полная деактивация потенциалзависимых митохондриальных источников АФК и по возможности быстрое снижение концентрации кислорода в клетке. Если же при этом не удается добиться снижения концентрации АФК в клетке за определенный срок, то происходит выход апоптозинициирующих факторов в цитозоль и клетка устраняется как потенциально опасный компонент организма.

Митохондриальная дыхательная цепь как источник АФК в клетке.

Общепринято, что дыхательная цепь митохондрий является основным источником АФК в большинстве клеток. Вместе с тем представляет интерес выяснение, какие именно компоненты дыхательной цепи и в каких условиях являются основными АФКгенераторами. Исходя из стандартных редокспотенциалов окислительновосстановительных центров различных Комплексов дыхательной цепи, а также на основе экспериментальных данных были выделены три основных источника АФК: НАДНубихинон оксидоредуктаза, сукцинатубихинон оксидоредуктаза и убихинол-цитохром с оксидо-редуктаза.

Комплекс I.

НАДНубихиноноксидоредуктаза (Комплекс I) является начальным и на сегодняшний день самым малоизученным участком дыхательной цепи митохондрий. Митохондриальный Комплекс I из сердца быка состоит из 43 субъединиц, 7 из которых кодируются митохондриальным геномом. Молекулярная масса такого комплекса сотавляет около 1000 кДа [78- 80]. Структура бактериального комплекса гораздо проще — он содержит либо 13, либо 14 субъединиц [81−83].

Ферментативный комплекс катализирует перенос электронов с фонда НАДН на фонд убихинона. Этот процесс сопряжен с трасмембранным переносом 4−5 протонов. Механизм транслокации протонов до сих пор неизвестен [84, 85].

Перенос электронов с НАДН на убихинон происходит через ряд редокс-центров комплекса.

Первым из этих центров является нековалентно связанный с белковой молекулой флавинмононуклеотид, который может находиться в трех редокссостояниях: полностью окисленном, полностью восстановленном и промежуточномв виде достаточно стабильного семифлавина [86−89]. Стандартный редокспотенциал связанного с белком флавина равен -340 мВ, что значительно ниже редокспотенциала свободного флавина (- 207 мВ) [84].

Далее пернос электрона осуществляется по ряду железосерных кластеров. В митохондриальном комплексе таких кластеров насчитывается шесть, из них два содержат по два атома негемового железа, а четырепо четыре атома. Все железосерные кластеры могут существовать в двух редокссостояниях (+2 и +1), парамагнитны в восстановленном состоянии и диамагнитныв окисленном [90]. Редокспотенциалы железосерных центров варьируют от -370 мВ у кластера Nla до -100 мВ у N2, но в основном составляют около -250 мВ [84].

Перенос электрона на убихинон происходит, повидимому, с железосерного кластера N2 и при этом наблюдается образование семихинона. Как показано в работах А. Д. Виноградова и соавторов, в митохондриальном Комплексе I удается обнаружить образование двух типов семихинона, из которых один взаимодействует с кластером N2. Растояние между семихиноном и кластером в этом случае оценивается в 11,2 нм [91].

Дальнейшее восстановление семихинона до хинола может происходить двумя путями. Прежде всего, это поступление второго электрона с кластера.

N2. Однако не исключено, что Комплекс I может взаимодействовать с Комплексом III, и семихинонрадикал принимает второй электрон с «левой» ветви Qцикла (см. ниже) [85].

По всей видимости, лимитирующей стадией при работе Комплекса I является восстановление хинона. В процессе окисления НАДН все железосерные центры восстановлены [85].

Комплекс I может осуществлять и обратную реакцию, а именно-перенос электронов с убихинола на НАД1″. На субмитохондриальных частицах эффект восстановления внешне добавленного НАД4″ за счет потока электронов с сукцината был установлен в группе А. Д. Виноградова [112]. Обратный перенос электронов оказадся чувствителен как к разобщителям окислительного фосфорилирования, так и к ротенону. Перенос электрона на участке между железосерным кластером и убихиноном тормозится пирицидином и ротеноном. Однако в случае прямого и обратного переносов электрона чувствительность к ротенону в последнем случае на порядок выше [92]. Авторы предполагают существование двух различных мест связывания для убихинона и убихинола соответственно, при этом постулируется их различная чувствительность к ротенону.

Сукцинатубихинон оксидоредуктаза.

Сукцинатубихинон оксидоредуктаза (сукцинатдегидрогеназа, Комплекс II) широко рапространена в аэробных живых организмах и катализирует окисление сукцината в фумарат с последующим восстановлением хинона до хинола. Митохондриальный комплекс состоит периферического домена, экспонированного в матрикс, и домена, встроенного в мембрану. Первый домен включает в себя флавопротеид и железосерный белок, в то время как второйдве белковые субъединицы, несущие один гем [95]. Мембранный домен служит «фундаментом», к которому крепятся белки периферического домена.

Флавопротеид представляет собой водорастворимый полипептид с молекулярной массой около 70 кДа, несущего ковалентно связанный ФАД и имеющий дикарбоксилатсвязывающий центр [93, 94]. ФАД является первичным акцептором электронов при окислении сукцината и его стандартный редокспотенциал равен -79 мВ [95]. В отличие от следующих за ним редоксцентров, флавин может принять два электрона и его последующее окисление железосерными центрами сопровождается образованием стабильного свободного ФАДрадикала [96]. Связывание сукцината с дикарбоксилатсвязывающим центром конкурентно подавляется малонатом и оксалоацетатом.

Железосерный белок митохондриальной сукцинатдегидрогеназы имеет молекулярную массу около 27 кДа и содержит три железосерных кластера: [2Бе- 28], обозначаемого Б1, [4Ре- 48], обозначаемого 82 и [ЗРе- 48], обозначаемого 83. Кластер 81 имеет стандартный потенциал около 0 мВ и служит окислителем восстановленного флавина. Окислительно-восстановительный потенциал следующего кластера 82 значительно ниже (-260 мВ) и представляется весьмя вероятным, что он не участвует прямо в переносе электрона, а выполняет вспомогательные функции [95]. Железосерный центр 83 очень важен для комплекса как в структурном, так и в функциональном отношении. Показано, что присоединение флавопротеида и железосерного белка к мембранному домену происходит при его участии [97- 99]. Кроме того, стандартный окислительновосстановительный потенциал (+ 60 мВ) кластера 83 и его пространственная близость к хинонсвязывающему центру свидетельствуют в пользу того, что именно он является донором электронов для хинона [95].

Мембранный домен митохондриального Комплекса II состоит из двух погруженных в мембрану полипептидных цепей, с массой около 15 и 13 кДа, к которым присоединен гем типа Ь. Функциональная роль гемовой группы пока неясна, однако известно, что гем играет важную структурную роль в сукцинатдегидрогеназе Bacillus subtilis [100]. Кроме того, активность лишенной гема митохондриальной сукцинатдегидрогеназы значительно снижена [102].

Убихинонсвязывающий центр митохондриального Комплекса II расположен вблизи поверхности внутренней митохондриальной мембраны, обращенной в матрикс, и находится в контакте как с железосерным кластером S3, так и с гемом b [101]. Существует предположение, что в этом центре, происходит связывание двух молекул хинона [95]. Восстановление убихинона до убихинола, по всей видимости, ступенчатое, и проходит через стадию образования семихинонрадикала [103−105]. Перенос электронов с железосерного кластера на хинон блокируется 2-теноилтрифторацетоном (ТТФА) и карбоксином, причем ТТФА на порядок более эффективен [106, 107].

Убихинолцитохром с оксидоредуктаза.

Убихинолцитохром с оксидоредуктаза (Комплекс III, bei комплекс) является центральным компонентом цепи переноса электронов митохондрий. Он катализирует окисление восстановленного убихинона и перенос электронов на мобильный компонент дыхательной цепицитохром с. При этом процесс сопряжен с трансмембранным переносом двух протонов [108−110].

Митохондриальный Комплекс III состоит из 11 субъединицмолекулярная масса всего комплексаоколо 240 кДа [1]. В комплексе присутствуют четыре редоксцентра, а именно: две гемовые группы (bi и Ьь) цитохрома Ь, железосерный кластер белка Риске и гем цитохрома В митохондриальной мембране комплекс образует димер. В отличие от НАДНубихинон оксидоредуктазы, Комплекс III был закристаллизован и его пространственная структура известна с разрешением до 0,3 нм [111, 113].

В общих чертах механизм работы Комплекса III описывается протондвижущим Q-циклом [114].

В комплексе существуют два места связывания убихинона. Так называемый осайт, или убихинолокисляющий центр, расположен вблизи поверхности мембраны у межмембранного пространства. После связывания убихинола в оцентре происходит его депротонирование [118] и дальнейшее окисление железосерным белком Риске. При этом происходит перенос одного электрона на 2Fe- 2S кластер и, предположительно, образование нестабильного семихинонрадикала. По другим предположениям, сначала происходит окисление убихинола, а затемего депротонирование [116]. По некоторым данным, при функционировании комплекса в оцентре связываются две молекулы хинола, одна из которых служит собственно субстратом окисления, а вторая осуществляет каталитические функции [116, 117].

Перенос электрона на железосерный кластер блокируется миксотиазолом и стигмателлином. При этом стигмателлин связывается в непосредственной близости от кластера, в то время как миксотиазол-ближе к гему bi [111].

Второй электрон убихинола поступает на низкопотенциальный гем цитохрома b (Ео =-20 мВ), после чего поступает на следующий гем bh (Ео =+40 мВ) (1, 118). Гем bh примыкает к убихинонвосстанавливающему центру Комплекса III (iцентру), находящемуся вблизи матрикса. В этом центре происходит двухэлектронное восстановление окисленного убихинона, которое проходит через стадию образования семихинон-радикала [115]. Второй электрон при этом поступает либо после окисления второй молекулы убихинола в оцентре Комплекса III, либо в процессе взаимодействия Комплекса III с Комплексом I [1, 85]. При восстановлении убихинона происходит его протонирование за счет протонов матрикса. Перенос электронов с гема bh на убихинон блокируется антибиотиком антимицином А.

Таким образом, существующий механизм электронного транспорта в убихинолцитохром с оксидоредуктазе позволяет «сохранять» каждый второй электрон.

Железосерный белок Риске является самым низкопотенциальным из известных железосерных белков, его потенциал оценивается в +290 мВ [111, 118]. Установлено, что дальнейший перенос электрона с белка Риске на цитохром С] осуществляется при перемещении железосодержащего домена белка от убихонола к цитохрому ci [111]. Далее происходит восстановление водорастворимого цитохрома с, который локализуется на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны и осуществляет дальнейший транспорт электрона на цитохромоксидазу.

Дыхательная цепь митохондрий как источник АФК в клетке.

Способность различных компонентов дыхательной цепи митохондрий неферментативно восстанавливать кислород и образовывать АФК известна уже свыше тридцати лет. В 1967 году Хинкль и соавторы описали образование перекиси водорода и супероксидрадикала субмитохондриальными частицами при обратном переносе электронов с сукцината на Комплекс I в присутствии АТФ и цианида. Эффект ингибир эвался как ротеноном, так и разобщителямипротонофорами [35]. Точно определить место электронной утечки на кислород авторы не смогли, однако предположили, что кислород восстанавливается не флавином, а неким интермедиатом, находящимся на пути электронов между флавином и сукцинатдегдрогеназой.

Позднее активные исследования образования перекиси водорода в процессе дыхания митохондрий велись в группах Чанса [37, 43] и Бовериса [40, 47, 48]. В дальнейшем различными исследователями было показано, что АФК образуются митохондриями сердца, печени, легких, почек и мозга — то есть практически во всех тканях митохондрии являются активными источниками продуктов одноили двухэлектронного восстановления кислорода. Наиболее часто используемым объектом являются митохондрии сердца крысы и голубя, а также субмитохондриальные частицы из митохондрий сердца быка. Оказалось, что митохондрии и субмитохондриальные частицы образуют АФК в при использовании как НАДН или НАДНгенерирующих субстратов [35- 40, 43, 44, 49, 50], так и сукцината [36- 41, 43, 45, 47, 49- 52]. Во всех случаях скорость образования АФК резко снижалась разобщителями окислительного фосфорилирования, а также при переходе системы из состояния 4 по Чансу (полная доступность субстратов дыхания и кислорода при низкой протонной проводимости внутренней митохондриальной мембраны) в состояние 3 (высокая протонная проводимость внутренней митохондриальной мембраны при полной доступности субстратов дыхания и кислорода). При повышении парциального давления кислорода в среде образование АФК стимулировалось, причем линейно [37, 39], что свидетельствует о неферментативном восстановлении кислорода.

Не существует единого мнения по поводу того, в каких именно участках дыхательной цепи происходит образование АФК и каков вклад каждого из них в этот процесс. Теоретически одноэлектронное восстановление кислорода может происходить в любом из редоксцентров Комплекса I, а также в высокопотенциальных редоксцентрах Комплексов 2 и 3 По мнению большинства исследователей, основным АФК-генератором в дыхательной цепи является Комплекс I [36, 48, 49, 51, 52]. Однако ряд авторов полагает, что Комплекс III вносит по крайней мере такой же вклад в образование АФК. [37- 40]. Существует также мнение, что заметным источником АФК может служить также Комплекс II (сукцинатдегидрогеназа) [46]. На сегодняшний день признается, что все три комплекса образуют АФК.

Анализ литературных данных не дает однозначного ответа на вопрос, при каких условиях Комплекс I продуцирует АФК. Неоднократно была отмечена генерация как перекиси водорода, так и супероксидрадикала при использовании пирувата, глутамата, малата, оксибутирата и НАДН в качестве субстратов дыхания, которая усиливалась в присутствии ротенона [36, 40, 43, 50]. Эти данные свидетельствуют локализации места образования АФК выше хинонсвязывающего центра. Учитывая, что железосерные кластеры в значительной степени экранированы [85], наиболее вероятным участником паразитной реакции является флавин и сам процесс в этом случае происходит при прямом переносе электронов. Однако ряд исследователей опровергает усиление образования АФК в присутствии ротенона и НАДНобразующих субстратов [37, 42, 52].

Особенно интересным является наблюдение группы Рамсай [42]. Авторы предполагают, что увеличение скорости образования супероксидрадикала в этом случае связано не с ингибированием Комплекса I, а с неселективным присоединением ротенона к различным участкам митохондриальной мембраны.

В процессе дыхания с использованием сукцината большинством исследователей наблюдалась максимальная скорость образования АФК в отсутствии ингибиторов дыхательной цепи. Однако данные о действии ротенона в этом случае весьма противоречивы. Ряд авторов сообщает, что ротенон сильно ингибирует генерацию АФК [40, 51, 52], в то время как другие исследователи такого эффекта не наблюдали [36- 38]. В первом случае образование АФК объясняется обратным переносом электронов на Компле^з I, причем наиболее вероятным донором электрона для кислорода служит семихинонрадикал в хинонсвязывающем центре Комплекса Iво втором же случае основным источником АФК следует назвать либо Комплекс III, либо Комплекс II.

Исследование Комплекса III как возможного источника АФК проводилось как правило в присутствии ингибитора антимицина А. Антимицин Аантибиотик, специфически блокирующий транспорт электронов по низкопотенциальной ветви в Qцикле. В его присутствии происходит восстановление гемов b Комплекса III, что, по мнению ряда исследователей, благоприятствует одноэлектронному восстановлению кислорода. Действительно, добавление антимицина к митохондриям и СМЧ вызывает усиленную продукцию АФКмаксимальный эффект при этом достигается в присутствии разобщителей окислительного фосфорилирования [37, 47]. Существуют две точки зрения, объясняющие усиление образования АФК антимицином А: 1) окисление высокопотенциального гема bh кислородом [45] и 2) взаимодействие кислорода с семихинонрадикалом в оцентре, время жизни которого в этих условиях должно значительно увеличиваться [41, 47]. Тот факт, что миксотиазол сильно тормозит антимицининдуцированное образование перекиси водорода, оставляя при этом восстановленными гемы Ь [41], свидетельствует в пользу второй точки зрения.

Крайне существенно отметить, что к образованию АФК способны также и изолированные комплексы дыхательной цепи. В частности, изолированный и встроенный в липосомы Комплекс III образовывал радикалы супероксида со скоростью 6.5 нмоль/мг белка х мин, а Комплекс Iсо скоростью 10 нмоль/мг белка х мин [44].

Исследователями из группы Бовериса сообщается о сильном прооксидантном действии убихинола [48]. Однако заключение авторов основано на факте усиления образования АФК после добавления убихинона к митохондриям, обработанным пентаном, в которых фонд убихинона невелик. В этом случае не исключается возможность, убихинон выступит не как генератор АФК, а как связующее звено между субстратом дыхания и донором электронов на кислород, (реальным генератором АФК). Таковыми могут служить как Комплекс I, так и Комплекс III.

Цитохромоксидаза не рассматривается в качестве возможного источника АФК в дыхательной цепи [36]. Действительно, стандартный редокспотенциал ее центров (около +450 мВ) делает эту возможность маловероятной.

Существуют указания, что уровень образования АФК в митохондриях некоторых органов, например, почек, увеличивается при реоксигенации после ишемии [50]. С другой стороны, в случае митохондрий сердца подобного эффекта не наблюдалось [51]. межмембранное пространство.

Рис. 3 Протондвижущий цикл. Схема переноса электронов и протонов при работе Комплекса III.

Цитохром с.

Цитохром снебольшой гидрофильный белок (мол. масса около 12 кДа), локализованный, как правило, на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны и осуществляющий перенос электронов с Комплекса III на цитохромоксидазу. В отличие от цитохромов типа, а и Ь, гем цитохрома с связан с белковой частью ковалентно. Цитохром смобильный компонент дыхательной цепи, его стандартный редокс-потенциал равен +250 мВ. Связывание с Комплексом III и цитохромоксидазой происходит при участии богатой лизинами части белка и осуществляется путем электростатического взаимодействия с остатками глутаминовой и аспарагиновой кислот, которыми богаты цитохром ссвязывающие центры этих комплексов [1]. Полипептид полилизин обладает значительно большим, чем цитохром с, сродством к отрицательно заряженным местам посадки на митохондриальных Комплексах и действует как конкурентный ингибитор, блокируя перенос электронов с Комплекса III на цитохромоксидазу. Есть также указания на то, что в связывании цитохрома с с мембраной участвует кардиолипин [119].

Аминокислотная последовательность цитохрома с из сердца лошади насчитывает 104 аминокислоты, а дрожжевого цитохрома с — 113 [120]. Цитохром сконсервативный белок, однако чем дальше филогенетически расположены организмы, тем больше различий в структуре этого белка. Например, структуры цитохромов с человека и шимпанзе полностью совпадают.

Полагают, что окислители и восстановители цитохрома с атакуют край гема, экспонированный в воду. При переносе электронов с Комплекса III на цитохромоксидазу цитохром с совершает челночные движения, диффундируя вдоль поверхности мембраны [1].

Важной особенностью цитохрома с является его способность окислять супероксидрадикал. При этом возможно спектрофотометрически проследить динамику восстановления цитохрома и, при отсутствии иных восстановителей, оценить скорость образования супероксидрадикала. С этой целью часто используют ацетилированный аналог цитохрома с, у которого ацетилировано 60% лизиновых остатков и который не может связываться ни с мембранами, ни с цитохромсвязывающими местами комплексов дыхательной цепи [121].

Жирные кислоты как природные разобщители окислительного фосфорилирования.

Впервые разобщающее действие жирных кислот было обнаружено в 1956 г. [122]. Вскоре было показано, что они накапливаются в митохондриях при «старении» препарата [123]. Дальнейшие исследования показала, что жирные кислоты вызывают нарушения ряда других функций, аналогично классическим разобщителям ДНФ и ФКФ. Разобщающее действие жирных кислот зависит от длины цепи и наличия двойных связей в молекуле. Эффективность разобщающего действия возрастает с увеличением длины цепи от См до Св и далее не изменяется [124]. При одной и той же длине связи ненасыщенные жирные кислоты разобщают более эффективно, чем насыщенные [125].

Молекулярный механизм разобщения окислительного фосфорилирования был впервые открыт для бурой жировой ткани. Эта ткань содержит специальный разобщающий белоктермогенин, который увеличивает протонную проводимость внутренней мембраны митохондрий в присутствии низких концентраций жирных кислот [126]. Позднее в различных тканях были обнаружены аналоги термогенина, которые получили название UCPбелков (uncoupling proteins). Кроме этого, по целому ряду свойств на термогенин похож еще один белок, который присутствует во всех митохондриях. Это АДФ/АТФтранслокатор, основной функцией которого является обмен фондов АТФ и АДФ матрикса и межмембранного пространства [127].

Предположение о том, что АДФ/АТФтранслокатор способен увеличивать протонную проводимость внутренней митохондриальной мембраны под действием жирных кислот подтверждено рядом фактов. АДФ, субстрат транслокатора, и наиболее сильный его ингибитор карбокс^атрактилат подавляют стимуляцию дыхания и падение потенциала после добавки 15 мкМ пальмитиновой кислоты [127]. Также было показано, что разобщающее действие жирных кислот и степень его подавления карбоксиатрактилатом коррелируют с содержанием антипортера в различных тканях [128].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Выделение митохондрий из сердца крыс.

Митохондрии выделяли из сердец белых крыс весом 150- 200 г. Сердца помещали на 5 мин в частично замороженный раствор 0,25 М сахарозы, предварительно очистив их от посторонних тканей. После этого их промывали средой выделения (0,25 М сахарозу, 10 мМ МОПС (рН 7,4), 0,5 мМ ЭДТА) и разрезали ножницами на кусочки размером в несколько миллиметров и продавливали через заранее охлажденный пресс из нержавеющей стали с отверстиями диаметром 1 мм. Приготовленную таким образом ткань гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в течение 2−3 мин. Гомогенат ткани центрифугировали в течение 10 мин при 700 g, далее из супернатанта осаждали митохондрии центрифугированием в течение 10 мин при 17 000 g. Осадок митохондрий ресуспендировали в среде выделения, содержащей бычий сывороточный альбумин (0,5 мг/мл) и вновь осаждали в течение 10 мин при 17 000 g. Митохондрии суспендировали в среде выделения, суспензия содержала 80−100 мг белка/ мл.

Регистрация дыхания суспензии митохондрий.

Дыхание суспензии митохондрий регистрировали полярографическим методом с помощью кислородного электрода типа Кларка и полярографа LP-9 (Чехословакия) при 25 °C и непрерывном помешивании запаянной в стекло или тефлон магнитной мешалкой.

Измерение скорости образования перекиси водорода.

Скорость образования перекиси водорода оценивали по скорости снижения интенсивности флуоресценции скополетина. Калибровку метода проводили добавлением известных количеств перекиси водорода. В среду инкубации добавляли 1,2 мкМ растворенного в ДМСО скополетина, 0,15 мг пероксидазы хрена (активность 300- 500 ед/ мг), субстраты дыхания и 2 мг митохондрий. Длина волны возбуждающего света- 366 нм, измерение флуоресценции проводили на длине волны 460 нм. Не допускалось падение концентрации скополетина ниже 0,5 мкМ. Измерение проводилось на флуориметре MPF-4 (Hitachi, Япония).

Измерение трансмембранного потенциала митохондрий.

Трансмембранный потенциал на внутренней мембране митохондрий оценивали спектрофотометрическим методом по разности поглощения зонда сафранина О при длинах волн 555: 523 нм. При этом использовали двухволновой спектрофотометр, оснащенный кюветой объемом 2 мл и магнитной мешалкой. Уменьшение разности поглощения соответствовало снижению трансмембранного потенциала. Также трансмембранный потенциал измеряли методом проникающих катионов, по распределению ТФФ между матриксом митохондрий и средой инкубации. Концентрацию проникающего катиона измеряли при помощи ТФФселективного электрода.

Измерение скорости восстановления цитохрома с.

Скорость восстановления цитохрома с оценивали спектрофотометрически по разности поглощения восстановленного и окисленного цитохрома с при длинах волн 550: 540 нм. Увеличение разности поглощения соответствовало восстановлению цитохрома.

Оценка обратного переноса электронов.

Интенсивность обратного переноса электронов с убихинола на НАДН-дегидрогеназу и далее на НАД4″ оценивали по нарастанию интенсивности флуоресценции пиридиновых нуклеотидов после введения сукцината в среду инкубации. Возбуждение флуоресценции проводилось светом с длиной волны 360 нм, измерение интенсивности флуоресценции проводили на длине волны 460 нм.

Приготовление липосом.

Липосомы приготавливались путем шестикратного озвучивания суспензии азолектина (40 мг/мл) в среде инкубации. Длительность каждого озвучивания составляла 30 сек, перерывы между озвучиваниями- 45 сек. Суспенз*1я озвучивалась в пластиковой пробирке, помещенной в ледяную баню.

Субмитохондриальные частицы из сердца быка были любезно предоставлены профессором А. Д. Виноградовым (кафедра биохимии, Биологический факультет МГУ).

Реактивы.

В работе использовались олигомицин, МОПС, ЭДТА, сафранин О («Serva», ФРГ), ротенон, глутамат, малат, сукцинат, оксибутират, малонат, поли-Lлизин, СОД, ксантиноксидаза, лошадиный цитохром с, дрожжевой цитохром с, ацетилированный цитохром с, лауриновая кислота, бычий сывороточный альбумин (не содержит жирных кислот), антимицин, А («Sigma», США), ФКФ («Fluka»), пероксидаза хрена («Reanal»), 30% Н202 («Merck»), соли марки о.с.ч., Союэреахим. Сахарозу (х.ч., Союзреахим) дважды перекристаллизовывали из насыщенного раствора в бидистиллированной воде дважды перегнанным этиловым спиртом. Олигомицин, ротенон, антимицин А, ФКФ, SF 6847, лауриновую кислоту растворяли в дважды перегнанном этиловом спирте.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ иоссийокая.

Образование перекиси водорода митохондриями сердца крысы в различных условиях.

Использование различных субстратов дыхания Измерение скорости образования Н202 препаратами митохондрий сердца проводилось при использовании различных субстратов дыхания: сукцингта и НАДН-образующих субстратов (смеси глутамата и малата, а также бетаоксибутирата. Максимальная скорость генерации наблюдалась на митохондриях, находящихся в состоянии 4 по Чансу и при использовании сукцината в качестве субстрата дыхания. Сходные результаты были получены в группах Чанса [37] и Хансфорда [52]. Измеренная нами скорость образования перекиси водорода в этих условиях в среднем равна 150 пмоль/мг белка. При использовании НАДН-генерирующих субстратов зарегестрировать образование перекиси водорода не удалось. Добавление ротенона в последнем случае также не приводило к генерации Н2О2, что не согласуется с рядом литературных данных, но полностью подтверждается результатами группы Хансфорда [52].

Чувствительность к ингибиторам.

Образование перекиси водорода сукцинатокисляющими митохондриями было чувствительно к ингибитору НАДНдегидрогеназы ротенону, а также миксотиазолу и малонату .

Интересно отметить сильное ингибирующее воздействие ротенона на генерацию перекиси водорода энергизованными митохондриями. При концентрации 1 мкМ ротенон подавлял образование Н2О2 на 80% (рис. 4), а в отдельных случаяхполностью. На рис. 5 показана зависимость величины ингибирующего эффекта от концентрации ротенона. Ст ингибирования продукции перекиси водорода ротеноном равна 20 нМ, что в точности соответствует данным по ингибированию ротеноном обратного переноса электронов с сукцината на НАДНдегидрогеназу, полученным группой А. Д. Виноградова [92]. Способность субмитохондриальных частиц образовывать супероксидрадикал в процессе обратного переноса электронов с сукцината на НАДНдегидрогеназу была показана в 1967 году (Hinkle et al, 1967). Остаточная генерация Н202 оказалась чувствительной к разобщителям окислительного фосфорилирования (рис.

4).

Антимицининдуцированное образование перекиси водорода Добавление к дышащим препаратам митохондрий специфического ингибитора Ъс комплекса антимицина, А вызывало мощную генерацию перекиси водорода (от 200 до 400 пмоль/мг белка, рис. 4), что соответствует известным в литературе данным. При этом антимицин вызывал образование Н202 и в случае использования НАДНобразующих субстратов дыхания (не показано). Другой ингибитор Ьс комплекса миксотиазол прекращал антимицинзависимую продукцию Н202. Максимальный эффект антимицина наблюдался при одновременном ипользовании антимицина и разобщителей окислительного митох.

Рис. 4. Образование перекиси водорода митохондриями сердца при окислении сукцината в состоянии 4 по Чансу. Добавки: ББ 6847 (1 нМ), 6-кетохолестанол (5 мкМ), антимицин, А (1 мкМ), ротенон (1 мкМ), миксотиазол (1 мкМ). Числа у кривых обозначают скорость образования Н2О2 (пмоль/мин х мг белка). фосфорилирования (ФКФ, ББ 6847, грамицидина, аламетицина и валиномицина в К± содержащих средах). Аналогичные результаты были получены в группе Бовериса [47]. Ротенон на скорость антимицин-индуцированного образования Н2С>2 не влиял (не показано).

Зависимость скорости генерации перекиси водорода от трансмембранного потенциала внутренней митохондриалъной мембраны.

Образование перекиси водорода окисляющими сукцинат митохондриями оказалась чрезвычайно чувствительно к действию разобщителей окислительного фосфорилирования. Оно прекращалась под воздействием разобщителейпротонофоров ФКФ, ББ 6847, а также таких агентов, как грамицидин, аламетицин, арсенат и жирные кислоты. Кроме того, при переходе системы из состояния 4 в состояние 3, которое наступало после добавления в среду инкубации 0,5 мМ АДФ и 2 мМ фосфата, также наблюдалось практически полное прекращение образования Н2О2. Использование конкурентного ингибитора сукцинатдегидрогеназы малоната приводило к сходным результатам.

Нами была исследована зависимость скорости образования перекиси водорода от трансмембранного потенциала внутренней мембраны митохондрий. Было обнаружено, что очень низкие концентрации разобщителей окислительного фосфорилирования (1 нМ для БР 6847 и 7 нМ для ФКФ) почти полностью подавляют образование Н2О2 дыхательной цепью митохондрий сердца (рис. 6) При этом трансмембранный потенциал митохондрий снижался не более чем на 20%. На рис. 7 показана крутая зависимость скорости образования Н2О2 от трансмембранного потенциала внутренней мембраны митохондрий сердца, причем снижение последнего вызывалось как разобщителем окислительного фосфорилирования (ББ.

Образование Н2 02 и А*Р % от максимума.

Поглощение кислорода митохондриями, нмоль/мин х мг белка.

0. 2 0.4.

0.6 0.8 вРб847, нМ.

1.2 1.4 1.6.

Рис. 6 Зависимость трансмембранного потенциала, скорости дыхания и скорости образования Н202 митохондриями сердца от концентрации разобщителя ББ 6847. Среда инкубации: МОПС (10 мМ, рН 7,3), сахароза (0,25 М), ЭДТА (0,5 мМ), сукцинат (6 мМ).

6847), так и ингибитором сукцинатдегидрогеназы (малонатом). Интересно отметить, что 6- кетохолестанол, являющийся ресопрягающим агентом для митохондрий в случае использования ФКФ и SF 6847, увеличивает скорость генерации Н202 после подавления последней разобщителем (рис. 4). Такгм образом, трансмембранный потенциал внутренней мембраны митохондрий является очень важным фактором, регулирующим скорость образования Н202 дыхательной цепью митохондрий. При этом переход митохондрий из состояния 4 в состояние 3 (по Чансу) соответствует падению трансмембранного потенциала на 15- 20% и падению скорости образования Н202 на 90- 95%.

Другое важное предположение, вытекающее из наших результатов, заключается в том, что механизм «мягкого» (т.е. небольшого) разобщения окислительного фосфорилирования также может служить эффективным способом регуляции скорости образования Н202 дыхательной цепью митохондрий сердца.

Участки дыхательной цепи митохондрий сердца, образующие АФК. Полученные данные позволяют сделать заключение, что основная часть перекиси водорода в процессе дыхания митохондрий сердца образуется при обратном переносе электронов с убихинола на НАД1″, а основным местом генерации Н202 является НАДНубихинон оксидоредуктаза дыхательной цепи. Комплекс Ъсх в норме является гораздо менее значимым генератором, но при ингибировании низкопотенциальной ветви переноса электронов ксенобиотиком антимицином, А также может быть основным источником АФК в митохондриях сердца. В последнем случае Комплекс I в генерации АФК участия не принимает. Кроме того, наши данные находятся в хорошем соответствии с предположением А. Д. Виноградова о различных путях переноса электронов с убихинола на НАД4″ и с НАД4″ на.

Образование Н203 ,°/о 100 ч.

90 100 ДЧ^ %.

Рис. 7. Зависимость скорости образования перекиси водорода от трансмемебранного потенциала. Снижение трансмембранного потенциала проводилось добавлением ББ 6847 (черные квадраты), малоната (белые квадраты) и 200 мкМ АДФ в присутствии 2 мМ неорганического фосфата (треугольник). убихинон. При этом мы предполагаем, что путь прямого переноса электронов, в отличие от пути обратного переноса, не вовлечен в процесс генерации АФК Комплексом I дыхательной цепи митохондрий сердца.

Действие жирных кислот на образование перекиси водорода при окислении сукцината митохондриями сердца в состоянии 4.

Жирные кислоты известны как природные разобщители окислительного фосфорилирования, прежде всего в митохондриях мышц и бурого жира.

Разобщение дыхания митохондрий жирными кислотами играет важную роль в процессе холодовой адаптации организма, при этом разобщающее действие жирных кислот обусловлено наличием во внутренней мембране митохондрий специальных разобщающих белков и похожего на них по структуре АДФ/АТФ транслокатора, а также глутамат-аспартагного антипортера и дикарбоксилатного переносчика. Известно, что жирные кислоты теряют свойства разобщителей окислительного фосфорилирования в присутствии ингибиторов АДФ/АТФ транслокатора (карбоксиатрактилата, бонгкрековой кислоты) и разобщающих белков (ГДФ). В нашей работе использовалась в основном лауриновая и пальмитиновая кислоты. о лаурат, д, М.

Рис. 8. Влияние лауриновой кислоты на скорость образования Н202, скорость дыхания, трансмембранный потенциал и накопление НАД (Ф)Н митохондриями сердца в состоянии 4 по Чансу.

Ингибирующее действие жирных кислот на генерацию Н2О2.

Полученные нами результаты показывают, что лауриновая кислота в низких концентрациях (5- 10 мкМ) сильно ингибирует образование перекиси водорода митохондриями сердца в состоянии 4 по Чансу (рис. 8). При этом мембранный потенциал незначительно снижается, а скорость дыхания митохондрий слегка повышается. Схожим действием обладает и пальмитиновая кислота. Эффект полностью блокируется ингибитором АДФ/АТФ антипортера карбоксиатрактилатом, бычьим сывороточным альбумином (0.5 мг/мл) и частично атрактилозидом. В последнем случае карбоксиатрактилат, добавленный после атрактилата, полностью восстанавливает скорость образования Н2О2 (рис 9).

Участие разобщающих белков в снижении скорости генерации Н2О2 митохондриями сердца.

Как было показано [129], в кардиомиоцитах содержится мРНК одного из разобщающих белков (ИСР2). Чтобы проверить возможное участие иСР2 в протекторном действии жирных кислот, нами была поставлена серия опытов, в которой мы пытались обратить эффект жирной кислоты, используя ингибитор разобщающего белка ГДФ. Заметного влияния на скорость образования Н2О2 в присутствии 5 мкМ лаурата ГДФ не оказывал и разобщающее действие лаурата не подавлял (не показано). Однако после двухдневной холодовой адаптации крыс при 6 °C, ГДФ (0,4 мМ) частично обращал эффект лаурата. Эффективность обращения варьировала в различных опытах, но всегда была значительно меньше, чем у карбоксиатрактилата. ЦДФ, не ингибирующий.

Рис. 10. Образование перекиси водорода окисляющими сукцинат митохондриями сердца адаптированных к холоду крыс в состоянии 4 по Чансу. Добавки: лаурат (5 мкМ), ГДФ (0,4 мМ), карбоксиатрактилат (2 мкМ), ЦДФ (0,4 мМ). Числа у кривых обозначают скорость образования Н2О2 (пмоль/мин х мг белка) разобщающие белки, был менее эффективен. Пример эксперимента с митохондриями сердца адаптированных к холоду крыс приведен на рис. 10. Интересно отметить, что суммарное действие ГДФ и карбоксиатрактилата повышало скорость образования Н2О2 митохондриями сердца адаптированных к холоду крыс по сравнению с начальной скоростью генерации перекиси водорода в состоянии 4. Эти данные коррелируют с наблюдениями о повышенном содержании эндогенных жирных кислот в митохондриях адаптированных к холоду крыс.

На рис. 8 показано, что концентрации лаурата, ингибирующие образование Н202 митохондриями сердца в состоянии 4 сходны с концентрациями, ингибирующими обратный перенос электронов с сукцината на НАД1″. Трансмембранный потенциал при этом лишь несколько снижен. Таким образом, можно сделать вывод о способности жирных кислот в низких концентрациях снижать скорость образования перекиси водорода митохондриями сердца в состоянии 4, причем их эффект обусловлен «мягким» разобщением окислительного фосфорилирования. Подобное разобщение в митохондриях сердца протекает в основном с участием АДФ/АТФ транслокатора и, в меньшей степени, разобщающих белков. Полученные данные прямо указывают на возможность использования механизма «мягкого» разобщения не только при холодовой адаптации организма, но и как мощного фактора регуляции скорости образования АФК дыхательной цепью митохондрий.

Антиоксидантные свойства цитохрома с.

Цитохром о небольшой гидрофильный белок, в основном локализованный на внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий, но при этом не исключено, что некоторая часть фонда митохонцриального цитохрома с не связана с мембраной и растворена в межмембранном пространстве. Давно известна способность цитохрома с окислять супероксидрадикал. Таким образом, цитохром с может играть важную роль в защите клетки от избыточного образования АФК дыхательной цепью митохондрий.

Связывание цитохрома с с мембранами липосом и его восстановление гидрофильными радикалами. Учитывая строение молекулы цитохрома с и гидрофильность аниона супероксида, резонно предположить, что при связывании с мембраной супероксидокисляющая способность цитохома с будет снижена.

Для проверки этого предположения мы провели серию экспериментов, в которых изучалось влияние азолектиновых липосом, способных связывать свободный цитохром с, на динамику восстановления последнего аскорбатом и супероксидрадикалом, образующимся в процессе окисления ксантина ксантиноксидазой. Результаты представлены на рис. 11 Связывание цитохрома с с отрицательно заряженной поверхностью липосом полностью прекращает восстановление цитохрома с как аскорбатом, так и супероксидрадикалом. Необходимо отметить, что высокая ионная сила среды ослабляла ингибирующий эффект липосом, что свидетельствует в пользу того, что именно связывание в целом положительно заряженного в условиях данного эксперимента цитохрома с с отрицательно заряженной поверхностью мембраны предотвращает его восстановление гидрофильными радикалами (рис. 11, Г).

Рис. 11. Влияние связывания цитохрома с из сердца лошади с поверхностью азолектиновых липосом на его способность окислять супероксиди аскорбатрадикалы. Среда инкубации: 0,25 М сахароза, 10 мМ МОПС (А, Б) — 0,25 М сахароза, 10 мМ МОПС, 0,5 мМ ЭДТА, 40 мкМ ксантин (В) — 125 мМ КС1, 10 мМ МОПС, 0,5 мМ ЭДТА, 40 мкМ ксантин (Г) — рН 7,3 (А-Г).

СОДчувствительность генерации перекиси водорода митохондриями сердца.

Образование перекиси водорода митохондриями сердца в состоянии 4 по Чансу несколько стимулировалось (в среднем на 25- 30%) внешне добавленной супероксиддисмутазой (рис. 12). Внешне добавленная СОД также стимулировала образование антимицининдуцированное образование Н2О2. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что некоторая часть образующихся супероксидрадикалов поступает из митохондрий во внешнюю среду.

Ингибирующее действие цитохрома с на скорость образования Н2О2 митохондриями сердца в состоянии 4.

Следующая серия опытов была направлена на выяснение антиоксидантных свойств добавленного цитохрома с в системе, содержащей митохондрии в состоянии 4 по Чансу. Оказалось, что уже в субмикромолярных концентрациях цитохром с из сердца лошади является сильным ингибитором образования перекиси водорода дыхательной цепью митохондрий, окисляющих сукцинат в отсутствие АДФ и ротенона. Кроме того, хотя генерация перекиси водорода несколько стимулировалась супероксиддисмутазой, СОД на ингибирующее действие цитохрома с влияния не оказывала (рис. 13). Добавленные в среду инкубации азолектиновые липосомы полностью снимали ингибирующее действие цитохрома с (рис. 14, Б, В), при этом сами по себе липосомы слегка уменьшали скорость образования Н2Ог митохондриями в состоянии 4 (не показано).

МИТОХ.+ФКФ антимидии, А н2о2.

Рис. 12 Влияние супероксиддисмутазы из печени быка на скорость образования перекиси водорода митохондриями сердца в состоянии 4 и после добавления антимицина. Добавки: митохондрии (1 мг), антимицин, А (1 мкМ), СОД (0,02 мг). Среда инкубации содержала МОПС (10 мМ, рН 7,3), сахарозу (0,25 М), ЭДТА (0,5 мМ), сукцинат (6 мМ). Числа у кривых обозначают скорость генерации перекиси водорода (пмоль/мин х мг белка).

Образование Н202, пмоль/мин х мг белка.

Цитохром с, нМ.

Рис. 13 Влияние цитохрома с из сердца лошади на скорость генерации Н2С>2 митохондриями сердца в состоянии 4 (по Чансу) в присутствии (квадраты) и в отсутствии (круги) 1 мкМ СОД. митох. митох. митох.+липос.

Образование.

Рис. 14. Образование Н2О2 окисляющими сукцинат митохондриями сердца: ингибирующее действие цитохрома с из сердца лошади (200 нМ) и обратимость этого эффекта азолектиновыми липосомами (0,5 мг/мл липида). Числа у кривых обозначают скорости образования перекиси водорода (пмоль/мин х мг белка).

Характеристика препарата митохондрий.

Вполне возможно, что при выделении митохондрий у части препарата повреждается внешняя мембрана и в результате внутренняя мембрана становится доступной как для СОД, так и для цитохрома с. Таким образом, цитохром с получает доступ к образующимся в процессе дыхания супероксидрадикалам и окисляет их. Учитывая мощное ингибирующее действие цитохрома с, можно сделать предположение, что основная часть перекиси водорода образуется при дыхании митохондрий с поврежденной внешней мембраной. Для проверки этого предположения мы провели серию опытов с использованием полилизинаполипептида с мол. массой от 15 до 30 кДа. Полилизин ингибирует транспорт электронов Комплекса III на цитохром св этом смысле его эффект сходен с эффектом миксотиазола. Полипептид с такой массой не проникает через неповрежденную внешнюю мембрану и не оказывает «миксотиазолоподобного» эффекта на митохондрии.

Оказалось, что в изотонической среде полилизин практически не влияет как на антимицининдуцированное образование перекиси водорода, так и на генерацию Н202 митохондриями в состоянии 4 (рис 15). Напротив, в гипотонической среде, когда у всех митохондрий повреждена внешняя мембрана, полилизин практически полностью подавляет антимицин-индуцированную продукцию АФК (рис. 15). Данные по воздействию полилизина на генерацию Н202 митохондриями в состоянии 4 в гипотонической среде не представлены изза исключительно низкой скорости образования Н202 в этих условиях. Таким образом, основная часть перекиси водорода образуется митохондриями с неповрежденной внешней мембраной. митохондрии.

— х.

2 мин.

Рис 15 Влияние полилизина на генерацию Н2О2 митохондриями в состоянии 4 (А) и в присутствии антимицина (Б, В) в изотонической (280 мосмМ) и гипотонической (30 мосмМ) (В) среде. Числа у кривых отражают скорость генерации (пмоль/мин х мг белка).

Ниже приводятся данные о влиянии полилизина и цитохрома с из сердца лошади на скорость поглощения кислорода препаратами митохондрий.

Погл. 02, нмоль/мин X х мг белка То же после добавления 200 нМ ФКФ То же после добавления 400 нМ цит. с То же после добавления 0,06 мг п/лизин митохондрии 15 55 55 40 смч 50 190.

Действие цитохрома с на антимицининдуцированную генерацию Н2О2.

Хотя в наших опытах антимицинзависимое образование Н2О2 было чувствительно к супероксиддисмутазе, ингибирующий эффект внешне добавленного цитохрома с практически отсутствовал (рис. 16).

Эти данные противоречат изначальному предположению о том, что ингибирующий эффект цитохрома с на образование перекиси водорода связан с его супероксидокисляющей активностью.

При использовании субмитохондриальных частиц вместо митохондрий было обнаружено, что цитохром с проявляет свои антиоксидантные свойства как в случае генерации Н202 в состоянии 4, так и в случае антимицинзависимой генерации, однако в последнем случае они выражены значительно слабее (рис. 17).

Образование Н, 02, пмоль/мин х мг белка.

250 -200 -150.

50 Н 0 без добавок 0.

100 200 300.

Цитохром с, нМ.

Рис. 16 Влияние цитохрома с из сердца лошади на антимицин-индуцированное образование Н2Ог митохондриями сердца в присутствии (квадраты) и в отсутствии (круги) СОД. Концентрация СОД 1 мкМ, антимицина, А — 1 мкМ.

Образование Н202, пмоль/мин х мг белка.

Цитохром с, нМ.

Рис. 17. Влияние цитохрома с из сердца лошади на скорость образования Н2О2 субмитохондриальными частицами в состоянии 4 и в присутствии антимицина А.

Влияние ацетилированного и дрожжевого цитохромов с на скорость генерации перекиси водорода митохондриями.

Если способность цитохрома с снижать продукцию перекиси водорода в состоянии 4 обусловлена, в основном, его способностью реагировать с супероксидрадикалом, то замена лошадиного цитохрома с на дрожжевой не должна сказаться на его антиоксидантных свойствах. На рис. 18 показана зависимость скорости образования Н2О2 сукцинатокисляющими митохондриями в состоянии 4 от содержания в среде инкубации различных цитохромов с — лошадиного, дрожжевого и лошадиного ацетилированного. Ингибирующий эффект лошадиного цитохрома с максимален, дрожжевогозначительно ниже, а у ацетилированного практически отсутструет. При этом следует отметить, что скорость восстановления лошадиного и дрожжевого цитохромов с в присутствии ксантина и ксантиноксидазы одинакова, а ацетилированноговсего в 2 раза ниже (рис 19).

Влияние различных цитохромов с на образование перекиси водорода сукцинатокисляющими субмитохондриальными частицами.

Субмитохондриальные частицы также способны образовывать перекись водорода в процессе окисления сукцината, хотя скорость генерации была приблизительно втрое ниже, чем в опытах с митохондриями (около 50 пмоль/мг белка х мин). Эффект блокировался как разобщителями окислительного фосфорилирования, так и ротеноном (не показано), что указывает на сходство механизмов образования АФК в этих условиях в митохондриях и СМЧ.

Образование Н202, пмоль/мин х мг белка ацетилир. цит. с из.

Цитохром с, нМ.

Рис. 18. Эффективность снижения скорости образования Н2О2 митохондриями сердца в состоянии 4 различными цитохромами с: из сердца лошади, дрожжевым и ацетилированным из сердца лошади. ксантин-оксидаза цит. с 1 мкМ.

2+.

1 МИН.

Рис 19 Восстановление цитохромов с в присутствии ксантина и ксантиноксидазы: лошадиного (А), дрожжевого (Б) и лошадиного ацетилированного (В). Среда инкубации: МОПС (10 мМ, рН 7,3), сахароза (0,25 М), ЭДТА (0,5 мМ), ксантин (40 мкМ), цитохром с (2 мкМ).

При использовании антимицина, А на препаратах СМЧ удавалось получить образование перекиси водорода в количествах, сходных с таковыми на препаратах митохондрий в аналогичных условиях. В этом случае образование перекиси водорода значительно стимулировалось СОД (в 3−5 раз).

Было обнаружено, что цитохром с из сердца лошади проявляет свои антиоксидантные свойства как в случае генерации Н2О2 в состоянии 4, так и в случае антимицинзависимой генерации (рис. 17). Следует отметить, что антимицинзависимая генерация перекиси водорода СМЧ подавлялась линейно и, по всей видимости, ингибирующий эффект в этом случае обусловлен супероксидокисляющей активностью цитохрома с. В пользу этого предположения свидетельствует также тот факт, что в данных условиях скорость образования перекиси водорода СМЧ в одинаковой степени чувствительна как к лошадиному, так и дрожжевому цитохромам с, но при этом ингибирующий эффект каждого из цитохромов снимается супероксиддисмутазой (рис. 20).

Разобщающее действие цитохрома с Поскольку образование перекиси водорода митохондриями сердца, находящимися в состоянии 4, крайне чувствительно к разобщителям окислительного фосфорилирования (рис. 4), а антимицининдуцированная генерация — наоборот, то возникает необходимость проверки предположения о возможном разобщающем действии цитохрома с на митохондрии. Для этой цели мы исследовали влияние цитохрома с как на обратный перенос электронов, так и на трансмембранный потенциал митохондрий. Результаты представлены на рисунках 21 и 22, на которых показано, что максимальная использованная нами концентрация цитохрома с не снижает трансмембранный потенциал митохондрий и не влияет на обратный перенос электронов, в то время как 5−10 нМ ФКФ практически полностью предотвращают восстановление пиридиновых нуклеотидов матрикса (не показано).

Предполагаемые механизмы антиоксидантного действия цитохрома с.

Полученные данные не могут быть объяснены только в рамках способности цитохрома с окислять супероксидрадикал. Обратимость супероксиддисмутазой эффекта цитохрома с в случае антимицин-зависимой генерации Н2Ог субмитохондриальными частицами и сохранение цитохромом с своих антиоксидантных свойств в присутствии супероксиддисмутазы в случае образования перекиси водорода митохондриями в состоянии 4 указывают на качественное различие между механизмами антиоксидантной активности цитохрома с в этих двух случаях. По всей видимости, в первом случае снижение скорости образования Н202 происходит из-за окисления цитохромом с.

ТФФ+, мкМ.

0.2-г цитохром с, мкМ.

0,2 1? 3.° 100.

0.4.

0.6+.

0.8 0± 1мин t.

I—И митохондрии.

Рис. 21 Влияние цитохрома с из сердца лошади на трансмембранный потенциал митохондрий сердца в состоянии 4 образующегося супероксидрадикала и предотвращения образования перекиси водорода при дисмутации супероксида.

Ингибирующее действие цитохрома с на образование Н2О2 митохондриями в состоянии 4 при окислении сукцината объясняется несколько сложнее. Тот факт, что цитохром с не влияет на антимицин-зависимую продукцию Н2О2 указывает на незначительность вклада супероксидокисляющей активности цитохрома с. Об этом также свидетельствует меньшая эффективность дрожжевого цитохрома с как антиоксиданта, несмотря на такую же, как и у лошадиного цитохрома с, способность к окислению супероксидрадикала. Особенностью ацетилированного цитохрома с является его низкая по сравнению с неацетилированными цитохромами способность связываться с участками,.

ФКФ флуоресценция НАД (Ф)Н сукцинат.

ФКФ | образование.

Н202.

2 мин.

Рис. 22 Влияние цитохрома с из сердца лошади на восстановление пиридиновых нуклеотидов матрикса за счет переноса электронов с сукцината на Комплекс I. Добавки: сукцинат (6 мМ), цитохром с (400 нМ), ФКФ (100 нМ). несущими отрицательные заряды. Таким образом, если антиоксидантные свойства цитохрома с определяются в основном его способностью окислять супероксидрадикал, а окисление супероксидрадикала тормозится связыванием цитохрома с с отрицательно заряженными поверхностями мембран (рис. 11), можно было бы ожидать наличие у ацетилированного цитохрома с свойств сильного антиоксиданта, однако полученные результаты свидетельствуют о прямо противоположном (рис. 18).

Предлагаемый нами механизм действия цитохрома с в случае окисляющих сукцинат митохондрий (в состоянии 4 по Чансу) предполагает наличие во внешней мембране митохондрий некоторого рецептора, чувствительного к цитохрому с, находящемуся в среде инкубации или цитоплазме. Связывание цитохрома с с этим рецептором приводит к генерации сигнала, в результате чего резко снижается скорость образования АФК НАДНубихинон оксидоредуктазой дыхательной цепи. В этом случае становится понятным полное отсутствие антиоксидантной активности ацетилированного цитохрома с и значительно меньшая эффективность дрожжевого цитохрома с, отличающегося по структуре от цитохрома с крысы значительно больше, чем цитохром с лошади. Объясняется также нечувствительность ингибируюгцих свойств цитохрома с к супероксиддисмутазе.

По всей видимости, основная масса образующегося супероксидрадикала, поступающего в межмембранное пространство, либо окисляется находящимся там цитохромом с, либо дисмутирует под влиянием СОД. Начальные этапы выхода цитохрома с в цитоплазму при гиперпродукции АФК могут иметь целью отрегулировать скорость образования перекиси водорода ее главным генераторомКомплексом I.

ВЫВОДЫ.

1. В митохондриях сердца крысы основная часть (более 80%) перекиси водорода образуется при обратном переносе электронов с сукцината на НАД+ по дыхательной цепи. При окислении глутамата, малата и оксибутирата и последующем окислении НАДН НАДНдегидрогеназой дыхательной цепи и переносе электронов с НАДН на убихинон перекись водорода не образуется.

2. Образование перекиси водорода митохондриями сердца крысы при обратном переносе электронов очень чувствительно к падению трансмембранного потенциала внутренней мембраны митохондрий. Падение трансмембранного потенциала на 15- 20% снижает скорость образования Н2О2 в 10 раз. Таким образом, показано, что механизм «мягкого» разобщения может служить эффективным способом снижения скорости образования АФК дыхательной цепью митохондрий.

3. Показано, что жирные кислоты эффективно ингибируют образование перекиси водорода в окисляющих сукцинат митохондриях (в состоянии 4 по Чансу). Лауриновая кислота в концентрации 4 мкМ снижает скорость образования Н2О2 в 2 раза. Таким образом, жирные кислоты могут выступать в роли природных разобщителей и участвовать в механизме «мягкого» разобщения, как в одном из механизмов, обеспечивающих защиту клетки от окислительного стресса. Разобщение окислительного фосфорилирования жирными кислотами в митохондриях сердца происходит преимущественно при участии АДФ/АТФтранслокатора.

4. Показано, что связанный с липидной мембраной цитохром с не способен окислять радикалы супероксида и аскорбата. Сделан вывод о том, что супероксидокисляющей активностью обладает не связанная с мембранами часть внутриклеточного цитохрома с.

5. Показано, что цитохром с из сердца лошади обладает сильными антиоксидантными свойствами, в концентрации 100- 150 нМ вдвое снижая скорость образования перекиси водорода при обратном переносе электронов. Эффективность дрожжевого цитохрома с значительно ниже, несмотря на такую же, как и у лошадиного цитохрома с, способность окислять радикал супероксида. Ацетилированный цитохром с из сердца лошади не обладает антиоксидантной активностью, хотя и способен окислять супероксидрадикал. Предполагается, что механизм ингибирующего действия цитохрома с в случае образования перекиси водорода митохондриями сердца в состоянии 4 связан с его способностью взаимодействовать с некоторым рецептором, расположенным на внешней стороне внешней митохондриальной мембраны, в то время как ингибирование цитохромом с антимицининдуцированной генерации перекиси водорода вывернутыми субмитохондриальными частицами связано с его способностью окислять супероксидрадикал.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

АДФаденозин -5 -дифосфат.

АТФаденозин-5 -трифосфат.

АФКактивные формы кислорода.

ГДФгуанозин- 5- дифосфат.

ДНКдезоксирибонуклеиновая кислота.

ДНФ- 2,4- динитрофенол.

МОПСморфолинпропансульфоновая кислота.

НАД4″ - никотинамидаденин окисленный.

НАДНникотинамидаденин восстановленный.

СМЧсубмитохондриальные частицы.

СОДсупероксиддисмутаза.

ТТФАтеноилтрифторацетон.

ТФФтетрафенилфосфоний.

ФАДфлавинадениндинуклеотид окисленный.

ФКФкарбонилцианидпаратрифторметоксифенилгидразон.

ЦДФцитозин- 5- дифосфат.

ЭДТАэтилендиамин-М,!^,!^',]^'- тетраацетат.

А трансмембранная разность потенциалов на внутренней митохондриальной мембране.

Я выражаю глубочайшую благодарность моему научному руководителю Владимиру Петровичу Скулачеву за то внимание, которое он проявил ко мне в процессе нашей работы, а также за совершенно неоценимую помощь, оказанную мне в очень нелегкие для меня моменты жизни. Я чрезвычайно ценю ту дружескую атмосферу, в которой мне довелось работать и тот стиль, в котором ведется работа в нашей группе.

Я очень благодарен Андрею Дмитриевичу Виноградову и Вере Георгиевне Гривенниковой за предоставленные препараты субмитохондриальных частиц, а также за ценные замечания в процессе обсуждения полученных результатов на семинарах отдела биоэнергетики.

Приношу глубокую благодарность Льву Сергеевичу Ягужинскому и Елене Николаевне Моховой за дружеское участие и ценную информацию, а также за предоставление ряда реактивов.

Я чрезвычайно благодарен Оксане Олесьевне Малаховской и Максиму Скулачеву за оказанную помощь в оформлении диссертации, а также Лене Каргер за проявленное внимание и участие, а также за помощь в проведении ряда методических процедур.

Я выношу глубокую благодарность всем сотрудникам отдела биоэнергетики НИИ физикохимической биологии им А. Н. Белозерского за хорошее отношение и оказанную помощь в научной работе.

1 Скулачев В. П. Энергетика биологических мембран. «Наука», Москва, 1989.

2 Угай Я. А. Общая и неорганическая химия. «Высшая школа», Москва, 1997.

3 Кери Ф., Сандберг Р. Углубленный курс органической химии. «Химия», Москва, 1981.

4 Гамалей И. А., Клюбин И. В. Перекись водорода как сигнальная молекула. Цитология, 1996, 38, 1233- 46.

5 Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии (1), «Мир», Москва, 1981.

6 Скулачев В. П. Нефосфорилирующее дыхание как механизм, предотвращающий образование активных форм кислорода. Молекулярная биология, 1995, 29, 1199- 1208.

7 Skulachev V.P. Cytochrome с in the apoptic and antioxidant cascades. FEBS Lett, 1998, 423, 275−80.

8 Foote C.S. Detection and characterization of singlet oxygen. In Photosensitization, molecular, cellular and medical aspects. 1988, NATO ASI Series, SpringerVerlag, Berlin, 125−144.

9. Khan A., Wilson T. Reactive oxygen species as cellular messengers. С hem and Biol, 1995,2, 437−45.

10 Frimer A.A., ed. Singlet oxygen. 1985, CRC Press, Boca Raton, FL.

11 Khan A.U. Kasha N. The red chemiluminiscence of molecular oxygen in aqueous solution. J Chem Phys, 1963, 39, 2105−6.

12. Ilan Y., Czapski G., Meisel D. The oneelectron transfer redox potentials of free radicals. Biochim Biophys Acta, 1976, 430, 209- 24.

13 Ilan YA, Czapski G, Meisel D The one-electron transfer redox potentials of free radicals. The oxygen/superoxide system. Biochim Biophys Acta 1976, 430(2), 209−24.

14. Wood P. The redox potential of the system oxygensuperoxide. FEBS Lett, 1974, 44, 22−24.

15 Corey E.J., Mehrotra M.M., Khan A.U. Water induced dismutation of superoxide anion generates singlet molecular oxygen. Biochem Biophys Res Commun, 1987, 145(2), 842−6.

16 Hue R., Padmaja S. The reaction of NO with superoxide. Free Radic Res Commun, 1993, 18, 195- 199.

17 Tsai J-H., Beckman J. Role of conformation of peroxynitrite anion (ONOO") in its stability and toxicity. J Am Chem Soc, 116, 4115−6.

18 Khan A.U., Kasha M. Singlet molecular oxygen evolution upon simple acidification of aqueous hypochlorite: application to studies on the deleterious health effects of chlorinated drinking water. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(26), 12 362−4.

19 Shigenaga M.K., Hagen T.M., Ames B.N. Oxidative damage and mitochondrial decay in aging. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(23), 10 771−8.

20 Stadtman E.R. Protein oxidation and aging. Science, 1992, 257(5074), 1220−4.

21 Toyokuni S., Okamoto K., Yodoi J., Hiai H. Persistent oxidative stress in cancer. FEBS Let, 1 1995, 358(1), 1−3.

22 Luft R. The development of mitochondrial medicine. Biochim Biophys Acta, 1995, 1271(1), 1−6.

23 Kitagawa T, Suganuma N, Nawa A, Kikkawa F, Tanaka M, Ozawa T, Tomoda Y Rapid accumulation of deleted mitochondrial deoxyribonucleic acid in postmenopausal ovaries. Biol Reprod, 1993, 49(4), 730−6.

24 Mecocci P., MacGarvey U., Kaufman A.E., Koontz D., Shoffiier J.M., Wallace D.C., Beal M.F. Oxidative damage to mitochondrial DNA shows marked age-dependent increases in human brain. Ann Neurol, 1993, 34(4), 609−16.

25 Richter C., Park J.W., Ames B.N. Normal oxidative damage to mitochondrial and nuclear DNA is extensive. Proc Natl Acad Sci USA 1988, 85(17), 6465−7.

26 Gort A., Imlay J. Balance between endogenous superoxide stress and antioxidant defences. JBacteriol, 1998, 180, 1402- 10.

27 Keyer K., Imlay J. Superoxide accelerates DNA damage by elevating free-iron levels. Proc Nat Acad Sci, 1996, 93, 13 635−40.

28 Messner K., Imlay J. The identification of primary sites of superoxide and hydrogen peroxide formation in the aerobic respiratory chain and sulfite reductase complex of Escherechia coli. J Biol Chem, 1999, 15, 10 119−28.

29 Imlay K., Imlay J. Cloning and analysis of sodC, encoding the cooperzinc superoxide dismutase of Escherechia coli. J Bacteriol, 1996, 178, 2564- 2571.

30 Keyer K., Imlay J. Inactivation of dehydratase [4Fe- 4S] clusters and disruption of iron homeostasis upon cell exposure to peroxynitrite. J Biol Chem, 1997, 272, 27 652−9.

31 Nohl H., Breuninger V., Hegner D. Influence of mitochondrial radical formation on energy-linked respiration. Eur J Biochem, 1978, 90(2):385−90.

32 Sohal R.S., Svensson I., Sohal B.H., Brunk U.T. Superoxide anion radical production in different animal species. Mech Ageing Dev, 1989, 49(2), 129−35.

33 Sohal R.S., Svensson I., Brunk U.T. Hydrogen peroxide production by liver mitochondria in different species. Mech Ageing Dev, 1990, 53(3), 209−15.

34 Ku H.H., Brunk U.T., Sohal R.S. Relationship between mitochondrial superoxide and hydrogen peroxide production and longevity of mammalian species. Free Radie Biol Me, d 1993, 15(6), 621−7.

35 Hinkle P., Butow R., Racker E. Partial resolutions of the enzymescatalyzing oxidative phosphorylation. J Biol Chem, 1967, 242, 5169- 5173.

36 Barja G., Herrero A. Localization at Complex I and mechanism of the higher free radical production of brain nonsynaptic mitochondria in the shortlived rat than in the longevous pigeon. J Bioenerg Biomem, 1998, 30, 235- 43.

37 Boveris A., Chance B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem J, 1973, 134, 70 716.

38 Kwong L., Sohal R. Substrate and site specifity of hydrogen peroxide generation in mouse mitochondria. Arch Biochem Biophys, 1998, 350, 118- 26.

39 Turrens J., Freeman B., Crapo J. Hyperoxia increases H202 release by lung mitochondria and microsomes. Arch Biochem Biophys, 1982, 217, 411−21.

40 Turrens J., Boveris A. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochem J, 1980, 191, 421- 27.

41 Turrens J., Alexandre A., Lehninger A. Ubisemiquinone is the electrone donor for superoxide formation by Complex III of heart mitochondria. Arch Biochem Biophys, 1985, 237, 408- 14.

42 Ramsay R., Singer T. Relation of superoxide generation and lipid peroxidation to the inhibition of NADHQ oxidoreductase by rotenone, piericidin A and MPP+. Biochem Boiphys Res Commun, 1992, 189, 47- 52.

43 Boveris A., Oshino N., Chance B. The cellular production of hydrogen peroxide. Biochem J, 1972, 128, 617−30.

44 Takeshige K., Minakami S. NADHand NADPHdependent formation of superoxide anions by bovine heart submitochondrial particles and NADH-ubiquinone reductase preparation. Biochem J, 1979, 180, 129- 35.

45 Nohl H., Werner J. The mitochondrial site of superoxide formation. Biochem Biophys res Commun, 1986,138, 533- 39.

46 hang L., Yu L., Yu C.-A. Generation of superoxide anion by succinate-cytochrome c reductase from bovine heart mitochondria. J Biol Chem, 1998, 273, 33 972−976.

47 Cadenas E., Boveris A. Enhancement of hydrogen peroxide formation by protophores and ionophores in antymicinsupplemented mitochondria. Biochem J, 1980, 188,31−37.

48 Cadenas E., Boveris A., Ragan C., Stoppani A. Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADHubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome c reductase from beef heart mitochondria. Arch Biochem Biophys, 1977, 180, 248−57.

49 Herrero A., Barja G. ADP regulation of mitochondrial free radical production is different with Complex Ior Complex IIlinked substrates: implications for the exercise paradox and brain hypermetabolism. J Bioenrg Biomem, 1997, 29, 24 149.

50 GonzalezFelcha B., Boveris A. Mitochondrial sites of hydrogen peroxide production in reperfused rat kidney cortex. Biochim Biophys Acta, 1995, 1243, 361−66.

51 Paraidathathu T., Groot H., Kehrer J. Production of reactive oxygen by mitochondria from normoxic and hypoxic rat heart tissue. Free Rad Biol Med, 1992, 13, 289- 97.

52 Hansford R.G., Hogue B.A., Mildaziene V. Dependence of H202 formation by rat heart mitochondria on substrate availability and donor age. J Bioenerg Biomem, 1997, 29, 89−95.

53 Papa S., Skulachev V.P. Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging. Mol Cell Biochem, 1997, 174, 305−19.

54 Kelly M.J., Poole R.K., Yates M.G., Kennedy C. Cloning and mutagenesis of genes encoding the cytochrome bd terminal oxidase complex in Azotobacter vinelandii: mutants deficient in the cytochrome d complex are unable to fix nitrogen in air. J Bacteriol, 1990 172(10), 6010−9.

55 Van den Bergen C.W., Wagner A.M., Krab K., Moore A.L. The relationship between electron flux and the redox poise of the quinone pool in plant mitochondria. Interplay between quinol-oxidizing and quinone-reducing pathways. Eur J Biochem, 1994, 15,226(3), 1071−8.

56 Konstantinov A.A., Peskin A.V., Popova E.Yu., Khomutov G.B., Ruuge Superoxide generation by the respiratory chain of tumor mitochondria. Biochim BiophysActa, 1987, 894(1), 1−10.

57 Cross A.R., Jones O.T. Enzymic mechanisms of superoxide production. Biochim BiophysActa, 1991, 1057(3):281−98.

58 Massey V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem, 1994, 269(36), 22 459−62.

59 Liu S.S., Huang J.P. Coexistence of reactive oxygen cycle and Qcycle in respiratory chaina hypothesis for generation, partitioning and functioning of 02 «in mitochondria. 1996, In Proc Intren Symp Nat Antiox: Molecular Mechanisms and Health Effects. AOCS Press, Champaign, IL.

60 Scorrano L., Nicolli A., Basso E., Petronilli V., Bernardi P. Two modes of activation of the permeability transition pore: the role of mitochondrial cyclophilin. Mol Cell Biochem, 1997, 174(1−2), 181−4.

61 Tatton W. Olanow C. Apoptosis in neurodegenerative diseases: role of mitochondria. Biochim Biophys Acta, 1999, 1410, 195−213.

62 Carbonera D., Azzone G.F. Permeability of inner mitochondrial membrane and oxidative stress. Biochim Biophys Acta, 1988, 943(2), 245−55.

63 Harris E.J., Booth R., Cooper M.B. The effect of superoxide generation on the ability of mitochondria to take up and retain Ca2+. FEBS Lett, 1982, 146(2), 26 772.

64 Zamzami N., Marchetti P., Castedo M., Hirsch T., Susin S.A., Masse B., Kroemer G. Inhibitors of permeability transition interfere with the disruption of the mitochondrial transmembrane potential during apoptosis. FEBS Lett, 1996, 384(1), 53−7.

65 Kerr J.F., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972, 26(4), 23 957.

66 ZsNagy I., Steiber J., Jeney F. Induction of age pigment accumulation in the brain cells of young male rats through iron-injection into the cerebrospinal fluid. Gerontology, 1995, 41 Suppl 2, 145−58.

67 Slater A.F., Nobel C.S., Orrenius S. The role of intracellular oxidants in apoptosis. Biochim Biophys Acta, 1995, 1271(1), 59−62.

68 Polyak K., Xia Y., Zweier J.L., Kinzler K.W., Vogelstein B. A model for p53-induced apoptosis. Nature, 1997, 389(6648), 300−5.

69 Korsmeyer S.J., Shutter J.R., Veis D.J., Meny D.E., Oltvai Z.N. Bcl-2/Bax: a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death. Semin Cancer Biol, 1993, 4(6), 327−32.

70 Scorrano L., Petronilli V., Beraardi P. On the voltage dependence of the mitochondrial permeability transition pore. A critical appraisal. J Biol Chem, 1997, 272(19), 12 295−9.

71 Marchetti P., Castedo M., Susin S.A., Zamzami N., Hirsch T, Macho A., Haeffher A., Hirsch F., Geuskens M., Kroemer G. Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis. J Exp Med, 1996, 184(3), 1155−60.

72 Zamzami N., Susin S.A., Marchetti P., Hirsch T., Gomez-Monterrey I., Castedo M., Kroemer G. Mitochondrial control of nuclear apoptosis. J Exp Med, 1996, 183(4), 1533−44.

73 Marchetti P., Hirsch T., Zamzami N., Castedo M., Decaudin D., Susin S.A., Masse B., Kroemer G. Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis. J Immuno, 1 1996, 157(11), 4830−6.

74 Susin S.A., Zamzami N., Castedo M., Hirsch T., Marchetti P., Macho A., Daugas E., Geuskens M., Kroemer G. Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease. J Exp Med, 1996, 184(4), 1331−41.

75 Kharbanda S., Pandey P., Schofield L., Israels S., Roncinske R., Yoshida K., Bharti A., Yuan Z.M., Saxena S., Weichselbaum R., Nalin C., Kufe D. Role for Bcl-xL as an inhibitor of cytosolic cytochrome C.

76 Li F., Srinivasan A., Wang Y., Armstrong R.C., Tomaselli K.J., Fritz L.C. Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-xL has activity independent of cytochrome c release. J Biol Chem, 1997, 272(48), 30 299−305 accumulation in DNA damage-induced apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA,. 1997. 94(13), 6939−42.

77 Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R., Newmeyer D.D. The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis. Science, 1997, 275(5303), 1132−6.

78 Walker J.E. The NADH: ubiquinone oxidoreductase (complex I) of respiratory chains. Q Rev Biophys, 1992, 253−324.

79 Buchanan S.K., Walker J.E. Large-scale chromatographic purification of FIFO-ATPase and complex I from bovine heart mitochondria. Biochem J, 1996, 318 (Ptl), 343−9.

80 Fearnley I.M., Finel M., Skehel J.M., Walker J.E. NADH: ubiquinone oxidoreductase from bovine heart mitochondria. cDNA sequences of the import precursors of the nuclear-encoded 39 kDa and 42 kDa subunits. Biochem J, 1991, 278 (Pt3), 821−9.

81 Weidner U., Geier S., Ptock A., Friedrich T., Leif H., Weiss H. The gene locus of the proton-translocating NADH: ubiquinone oxidoreductase in Escherichia coli. Organization of the 14 genes and relationship between the derived proteins and subunits of mitochondrial complex I J Mol Biol, 1993, 233(1), 109−22.

82 Yano T., Chu S.S., Sled' V.D., Ohnishi T., Yagi T. The proton-translocating NADH-quinone oxidoreductase (NDH-1) of thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB-8. Complete DNA sequence of the gene cluster and thermostable properties of the expressed NQ02 subunit. J Biol Chem, 1997, 272(7), 4201−11.

83 Yagi T., Yano T., Matsuno-Yagi A. Characteristics of the energy-transducing NADH-quinone oxidoreductase of Paracoccus denitrificans as revealed by biochemical, biophysical, and molecular biological approaches. J Bioenerg Biomembr, 1993, 25(4), 339−45.

84 Ohnishi T. Ionsulfur clusters/ semiquinones in Complex I. Biochim Biophys Acta, 1998, 1364, 186−206.

85 Vinogradov A.D. Catalytic properties of the mitochondrial NADHubiquinone oxidoreductase (Complex I) and the pseudoreversible active/ inactive enzyme transition. Biochim Biophys Acta, 1998, 1364, 169- 185.

86 Wang D.C., Meinhardt S.W., Sackmann U., Weiss H., Ohnishi T. The iron-sulfur clusters in the two related forms of mitochondrial NADH: ubiquinone oxidoreductase made by Neurospora crassa. Eur J Biochem, 1991, 197(1), 25 764.

87 Finel M. The proton-translocating NADH: ubiquinone oxidoreductase: a discussion of selected topics. J Bioenerg Biomembr, 1993, 25(4):357−66.

88 Belogrudov G., Hatefi Y. Catalytic sector of complex I (NADH:ubiquinone oxidoreductase): subunit stoichiometry and substrate-induced conformation changes. Biochemistry, 1994, 33(15), 4571−6.

89 Sled V.D., Rudnitzky N.I., Hatefi Y., Ohnishi T. Thermodynamic analysis of flavin in mitochondrial NADH: ubiquinone oxidoreductase (complex I). Biochemistry, 1994, 33(33), 10 069−75.

90 Beinert H., Albracht S.P. New insights, ideas and unanswered questions concerning iron-sulfur clusters in mitochondria. Biochim Biophys Acta, 1982, 683(3−4), 245−77.

91 Vinogradov A.D., Sled V.D., Burbaev D.S., Grivennikova V.G., Moroz I.A., Ohnishi T. Energy-dependent Complex I-associated ubisemiquinones in submitochondrial particles. FEBSLett, 1995, 370(1−2), 83−7.

92 Grivennikova Y.G., Maklashina E.O., Gavrikova E.V., Vinogradov A.D. Interaction of the mitochondrial NADH-ubiquinone reductase with rotenone as related to the enzyme active/inactive transition. Biochim Biophys Acta, 1997, 1319(2−3), 223−32.

93 Walker W.H., Singer T.P. Identification of the covalently bound flavin of succinate dehydrogenase as 8-alpha-(histidyl) flavin adenine dinucleotide. J Biol Chem, 1970, 245(16), 4224−5.

94 Hederstedt L. Succinate dehydrogenase mutants of Bacillus subtilis lacking covalently bound flavin in the flavoprotein subunit. Eur J Biochem, 1983, 132(3), 589−93.

95 Hagerhall C. Succinate: ubiquinone oxidoreductases. Variations on a conserved theme. Biochim Biophys A eta, 1997, 1320, 107−41.

96 Ohnishi T., King T.E., Salerno J.C., Blum H., Bowyer J.R., Maida T. Thermodynamic and electron paramagnetic resonance characterization of flavin in succinate dehydrogenase. J Biol Chem, 1981, 256(11), 5577−82.

97 Baginsky M.L., Hatefi Y. Reconstitution of succinate-coenzyme Q reductase (complex II) and succinate oxidase activities by a highly purified, reactivated succinate dehydrogenase. J Biol Chem, 1969, 244(19), 5313−9.

98 Ohnishi T., Lim J., Winter D.B., King T.E. Thermodynamic and EPR characteristics of a HiPIP-type iron-sulfur center in the succinate dehydrogenase of the respiratory chain. J Biol Chem, 1976, 251(7), 2105−9.

99 Yu C.A., Yu L., King T.E. Reconstitution of succinate-Q reductase. Biochem Biophys Res Commun, 1977, 79(3), 939−46.

100 Hederstedt L., Rutberg L. Biosynthesis and membrane binding of succinate dehydrogenase in Bacillus subtilis. J Bacteriol, 1980, 144(3), 941−51.

101 Lee G.Y., He D.Y., Yu L., Yu C.A. Identification of the ubiquinone-binding domain in QPsl of succinate-ubiquinone reductase. J Biol Chem, 1995, 270(11), 6193−8.

102 Yu L., Xu J.X., Haley P.E., Yu C.A. Properties of bovine heart mitochondrial cytochrome b5 .J Biol Chem, 1987, 262(3), 1137−43.

103 Xu Y., Salerno J.C., Wei Y.H., King T.E. Stabilized ubisemiquinone in reconstituted succinate ubiquinone reductase. Biochem Biophys Res Commun, 1987, 144(1), 315−22.

104 Miki T., Yu L., Yu C.A. Characterization of ubisemiquinone radicals in succinate-ubiquinone reductase. Arch Biochem Biophys, 1992, 293(1),.

105 Rich P.R., Bonner W.D. An EPR analysis of cyanide-resistant mitochondria isolated from the mutant poky strain of Neurospora crassa. Biochim Biophys Acta, 1978, 504(3), 345−63.

106 Mowery P.C., Steenkamp D.J., Ackrell A.C., Singer T.P., White G.A. Inhibition of mammalian succinate dehydrogenase by carboxins. Arch Biochem Biophys, 1977, 178(2), 495−506.

107 Grivennikova V.G., Vinogradov A.D. Interaction of mitochondrial succinate: ubiquinone reductase with thenoyltrifluoroacetone and carboxin. Biokhimiia, 1985, 50(3), 375−83.

108 Hinkle P.C., Kumar M.A., Resetar A., Harris D.L. Mechanistic stoichiometry of mitochondrial oxidative phosphorylation. Biochemistry, 1991, 30(14), 3576−82.

109 Mitchell P. Possible molecular mechanisms of the protonmotive function of cytochrome systems. J Theor Biol, 1976, 62(2), 327−67.

110 Crofts A.R., Berry E.A. Structure and function of the cytochrome bcl complex of mitochondria and photosynthetic bacteria. Curr Opin Struct Biol, 1998, 8(4), 501−9.

111 Zhang Z., Huang L., Shulmeister V., Chi Y., Kim K., Hung L., Crofts A., Berry E., Kim S.-H. Electron ransfer by domain movement in cytochrome bci. Nature, 1998, 392 (16), 677−84.

112 Kotlyar A.B., Vinogradov A.D. Slow active/inactive transition of the mitochondrial NADH-ubiquinone reductase. Biochim Biophys Acta, 1990, 1019(2), 151−8.

113 Xia D., Yu C.A., Kim H., Xia J.Z., Kachurin A.M., Zhang L., Yu L., Deisenhofer Crystal structure of the cytochrome bcl complex from bovine heart mitochondria. Science, 1997, 277(5322), 60−6.

114 Mitchell P. The protonmotive Q cycle: a general formulation. FEBS Lett, 1975, 59(2), 137−9.

115 Ohnishi T., Trumpower B.L. Differential effects of antimycin on ubisemiquinone bound in different environments in isolated succinate. cytochrome c reductase complex. J Biol Chem, 1980, 255(8):3278−84.

116 Ding H., Moser C.C., Robertson D.E., Tokito M.K., Daldal F., Dutton P.L. Ubiquinone pair in the Qo site central to the primary energy conversion reactions of cytochrome bcl complex. Biochemistry, 1995, 34(49), 15 979−96.

117 Ding H., Robertson D.E., Daldal F., Dutton P.L. Cytochrome bcl complex [2Fe-2S] cluster and its interaction with ubiquinone and ubihydroquinone at the Qo site: a double-occupancy Qo site model. Biochemistry, 1992, 31(12), 3144−58.

118 Brandt U., Energy conservation by bifurcated electrontransfer in the cytochrome bci complex. Biochim Biophys Acta, 1996, 1275, 41−6.

119 Yanagita Y., Sone N., Kagawa Y. Proton pumping and oxidase activity of thermophylic cytochrome oxidase remain after its extensive proteolysis. Biochem Biophys Res Comm, 1983, 113, 575- 80.

120 Handboock of Biochemistry. 1968, Chemical Rubber Company.

121 Azzi A., Montecucco C., Richter C. The use of acetylated ferrictochrome c for the detection of superoxide radicals produced in biological membranes. Biochem Biophys Res Comm., 1975, 65, 597.

122 Pressman B.C., Lardy H.A. Effect of surface active agents on the latent ATPase of mitochondria. Biochim Biophys Acta, 1956, 21, 458- 466.

123 Lehninger A.L., Remmert L.F. An endogenous uncoupling and swelling agent in liver mitochondria and its enzymic formation. J Biol Chem, 1959, 234, 245 964.

124 Shonfeld P., Schild L., Kunz W. Longchain fatty acids act as protonophoric uncouplers of oxidative phosphorylation on rat liver mitochondria. Biochim Biophys Acta, 1989, 977, 266- 272.

125 Bos C., Emmelot P., Stimulation and inhibition of mitochondrial adenine triphosphate activity by oleate. Biochim Biophys Acta, 64, 21−9.

126 Heaton G., Nicholls D. Hamster brown adipose tissue mitochondria: the role of fatty acids in the control of the proton conductance of the inner membrane. Eur JBioch, 1976, 67,511- 17.

127 Bouillard F., Weissenbach J., Ricquier B. Complete cDNAderived aminoacid sequence of rat brown fat uncoupling protein. J Biol Chem, 1986, 261, 87- 90.

128 Andreev A. Yu., Bondareva T.O., Dedukhova V.I., Mokhova E.N., Skulachev V.P., Tsofina L.M., Volkov N.I., Vygodina T.V. The ADP/ATP-antiporter is involved in the uncoupling effect of fatty acids on mitochondria. Eur J Biochem, 1989, 182, 585- 592.

129 Fleury C., Neverova M., Collins S., Raimblaut S., Champigny O., Levy-MeyrueisC., Bouillaud F., Seldin M., Surwit R., Ricquier D., Warden C. Nat Genet 1997, 15, 269−272.