Определение фосфорорганических нитроароматических инсектицидов с помощью респираторной активности микробных клеток

Проблемы охраны окружающей среды стимулируют разработку новых методов для количественного определения токсических соединений. Одно из перспективных направлений разработки аналитических приборов для детекции ксенобиотиков в водных экосистемах связано с созданием микробных биосенсоров [Семенчук с соавт., 2000]. Биосенсоры — это относительно новый класс миниатюрных аналитических устройств, в которых высокоспецифические биохимические реакции формируют аналитический сигнал, связанный с концентрацией определяемого компонента. Биосенсор как аналитический прибор состоит из чувствительного биологического элемента (целые организмы, ткани, клетки, органеллы, мембраны, ферменты, рецепторы, антитела, нуклеиновые кислоты) и системы детекции. Взаимодействие определяемого вещества и биологического элемента приводит к изменению физико-химических параметров системы, регистрация которых осуществляется специальным датчиком [Туманов, Коростылева, 1990]. Биосенсорные системы анализа характеризуются высокой чувствительностью, возможностью определять сложные органические соединения в многокомпонентных смесях, простотой и высокой скоростью анализа. В работе рассматриваются биосенсорные системы на основе кислородного электрода Кларка.

Исследования в области биосенсоров показали, что в качестве биологически чувствительного элемента в сенсорах целесообразно использовать микробные клетки. Это связано с тем, что многие гетеротрофные микроорганизмы способны использовать в качестве единственного источника углерода и энергии определенное органическое соединение. Различные виды микроорганизмов обладают ферментными системами, катализирующими деструкцию или трансформацию тех или иных соединений, в том числе и ксенобиотиков [Карасевич, 1982].

Интенсивная химизация сельского хозяйства приводит к ежегодному поступлению в биосферу различных химических веществ, в том числе и пестицидов. Органические соединения фосфора являются одной из важнейших 6 групп современных пестицидов [Мельников, 1995], к которым относятся такие инсектициды, как метафос и сумитион. В связи с этим существует необходимость контроля этих веществ и продуктов их гидролиза в объектах окружающей среды. На данный момент существуют сенсорные методы анализа фосфорорганических инсектицидов, основанные на ингибировании ацетил-холинэстеразной активности. В тоже время сведения о работах по созданию микробных сенсорных систем для определения фосфорорганических нитро-ароматических инсектицидов метафоса и сумитиона на основе респираторной активности микробных клеток в литературе отсутствуют.

Известны бактериальные культуры, способные использовать пара-нитрофенол в качестве единственного источника углерода и энергии. Такая особенность микроорганизмов обусловлена наличием в клетках ферментов системы подготовительного метаболизма, способствующих утилизации пара-нитрофенола путем окислительных реакций. Известно сходство в структурной формуле метафоса, сумитиона и пара-нитрофенола. С большой вероятностью можно допустить, что в случае сходных по химической структуре субстратов механизм действия оксигеназ будет одним и тем же [Карасевич, 1992]. В связи с этим можно предположить, что пути метаболизма метафоса, сумитиона и пара-нитрофенола будут близки. Поэтому проводилось определение метафоса и сумитиона с помощью респираторной активности микробных клеток, обладающих ферментами подготовительного метаболизма пара-нитрофенола.

Актуальность проблемы.

Актуальность проблемы диссертационного исследования связана с широким применением в сельском хозяйстве нитроароматических фосфорорганических инсектицидов, таких как метафос и сумитион, обладающих широким спектром действия на большинство насекомых-вредителей и применимых в большинстве регионов России и стран СНГ. Одним из продуктов гидролиза нитроароматических фосфорорганических инсектицидов является пара-нитрофенол — высоко токсическое соединение, широко применяемое в химической промышленности. 7.

Существует проблема определения пестицидов в различных объектах окружающей среды. В настоящее время для этого используются аналитические методы: газожидкостная хроматография, хроматография в тонком слое и др. Обладая рядом достоинств, данные методы анализа характеризуются сложностью исполнения, требуют большого количества расходуемых реактивов и дорогостоящего оборудования. Поэтому разработка методических основ для определения нитроароматических фосфорорганических инсектицидов с помощью респираторной активности микробных клеток позволит создать новую группу методов определения этого класса соединений.

Цель и задачи исследования

.

Целью работы являлось создание новых методических подходов для количественного определения нитроароматических фосфорорганических инсектицидов на основе респираторной активности микробных клеток, обладающих ферментативной системой подготовительного метаболизма пара-нитрофенола.

В связи с этим были поставлены следующие задачи исследования:

1. Исследовать респираторную активность микробных клеток штаммов Pseudomonas putida С-11 и Pseudomonas putida БА-11 по отношению к пара-нитрофенолу. Провести подбор сред культивирования микробных клеток и оптимизировать условия проведения анализа для получения максимальной респираторной активности в отношении субстрата.

2. Изучить возможность создания биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток штаммов Pseudomonas putida C-ll, Pseudomonas putida БА-11 и Acinetobacter calcoaceticum А-122. Рассмотреть методы иммобилизации микробных клеток с помощью адсорбции и способом включения в гель. Определить условия сохранения специфической респираторной активности свободных и иммобилизованных на разных носителях клеток в отношении пара-нитрофенола.

3. Определить респираторную активность свободных и иммобилизованных в гель агар-агара микробных клеток Pseudomonas putida C-ll, 8.

Pseudomonas putida БА-11 и Acinetobacter calcoaceticum A-122 по отношению к метафосу, сумитиону и пара-нитрофенолу.

4. Изучить возможность количественного определения фосфороргани-ческих нитроароматических инсектицидов метафоса, сумитиона и пара-нитрофенола в модельных объектах с помощью респираторной активности микробных клеток Pseudomonas putida C-ll, Pseudomonas putida БА-11 и Acinetobacter calcoaceticum A-122.

5. Провести сравнительное количественное определение содержания метафоса в коммерческом препарате метафоса с помощью данных газожидкостной хроматографии и респираторной активности микробных клеток штаммов Pseudomonas putida C-ll, Pseudomonas putida БА-11 и Acinetobacter calcoaceticum A-122.

Научная новизна работы.

Впервые показана возможность определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона при помощи респираторной активности микробных клеток, обладающих ферментами подготовительного метаболизма пара-нитрофенола и способных утилизировать пара-нитрофенол в качестве единственного источника углерода. Проведен подбор сред культивирования клеток для получения максимально активной биомассы по отношению к пара-нитрофенолу. Оптимизированы условия проведения анализа специфической респираторной активности микробных клеток. Изучены условия сохранения клетками респираторной активности в отношении определяемых соединений. Построены калибровочные кривые для количественного определения метафоса, сумитиона и пара-нитрофенола по изменению специфической респираторной активности клеток в отношении данных субстратов. Показано, что респираторная активность клеток в отношении метафоса и сумитиона значительно выше, по сравнению с активностью клеток в отношении пара-нитрофенола. Проведен сравнительный анализ применяемых методов иммобилизации клеток, в результате которого показано, что включение клеток в гель агар-агара позволяет максимальное время сохранять 9 их специфическую респираторную активность. Изучены условия сохранения респираторной активности свободными и иммобилизованными клетками.

Установлена возможность количественного определения метафоса, су-митиона и пара-нитрофенола в модельных объектах. Проведено количественное определение содержания метафоса в его коммерческом препарате на основе полученных результатов газожидкостной хроматографии и специфической респираторной активности клеток по отношению к чистому препарату метафоса.

Практическая ценность работы.

Разработан способ индикации и количественного определения метафоса и сумитиона в водных растворах с помощью специально подготовленных микробных клеток и кислородного электрода типа Кларка. Разработаны способы иммобилизации микробных клеток, сохраняющих биодеструктивную активность по отношению к данным соединениям. По результатам работы был оформлен патент на изобретение (заявка на получение патента РФ № 2 000 111 945/13 (12 357) положительное решение от 17.05.01 г.), материалы работы используются при проведении практических занятий на кафедре биофизики факультета нелинейных процессов Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского, кафедре экологии Саратовского государственного технического университета, кафедре микробиологии с вирусологией и микробиологией Саратовского государственного медицинского университета, кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы Института ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н. И. Вавилова.

По результатам диссертации были изданы методические рекомендации по определению некоторых фосфорорганических нитроароматических инсектицидов с помощью респираторной активности микробных клеток в водных объектах для студентов старших курсов и аспирантов, специализирующихся в области микробиологии и биохимии, рекомендованы учебно-методической комиссией ветеринарного факультета СГАУ им. Н. И. Вавилова (протокол № 49 от 9 апреля 2001 г.).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Микробные клетки, способные использовать пара-нитрофенол в качестве единственного источника углерода изменяют специфическую респираторную активность (СРА) в присутствии пара-нитрофенола. СРА клеток этих штаммов может быть использована для количественного определения пара-нитрофенола.

2. Микробные клетки штаммов Pseudomonas putida БА-11, Pseudomonas putida C-l 1 и Acinetobacter calcoaceticum А-122, обладающие системой подготовительного метаболизма пара-нитрофенола способны изменять СРА по отношению к нитроароматическим фосфоорганическим инсектицидам мета-фосу и сумитиону. СРА клеток этих штаммов можно использовать для количественного определения метафоса и сумитиона.

3. Иммобилизация клеток штаммов Pseudomonas putida БА-11, Pseudomonas putida C-l 1 и Acinetobacter calcoaceticum А-122, обладающих системой подготовительного метаболизма пара-нитрофенола, позволяет получать микробные биокатализаторы, сохраняющие СРА по отношению к пара-нитрофенолу.

4. Иммобилизация микробных клеток штаммов Pseudomonas putida БА-11, Pseudomonas putida С-11 и Acinetobacter calcoaceticum А-122, обладающих системой подготовительного метаболизма пара-нитрофенола, включением в полисахаридный гель агар-агара, сохраняет респираторную активность клеток в отношении метафоса, сумитиона и пара-нитрофенола. Микробные биокатализаторы на основе включенных в гель агар-агара клеток штаммов Pseudomonas putida БА-11, Pseudomonas putida С-11 и Acinetobacter calcoaceticum А-122, обладающие системой подготовительного метаболизма пара-нитрофенола, сохраняют от 27 до 48 суток СРА по отношению к пара-нитрофенолу в зависимости от используемого штамма и температуры хранения.

5. Биокатализаторы на основе микробных клеток Pseudomonas putida БА-11, Pseudomonas putida C-l 1 и Acinetobacter calcoaceticum А-122 позволяют.

11 количественно определять метафос, сумитион и пара-нитрофенол в модельных образцах.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на Всероссийских и Международных конференциях: Euroconference «Bacterial-Material/Radionuclide Interaction» (Rossendor/Dresden, Germany, December 1998) — Научная конференция профессорско-преподавательского состава и аспирантов СГАУ им. Н. И. Вавилова по итогам научно-исследовательской и учебно-методической iL работы за 1999 год (январь-февраль 1999, Саратов) — 9 European Congress on Biotechnology (July, 1999, Belgium) — Всероссийская заочная конференция «Перспективы развития Волжского региона» (май 2000, Тверь) — International Symposium on Environmental Biotechnology 2000 (Kyoto Japan July 2000) — Ce-минар-презентация инновационных научно-технических проектов биотехно-логии-2000 (сентябрь 2000, Пущино) — Международная научная конференция «Экологические и гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон» (октябрь 2000, Санкт-Петербург) — Научная конференция, посвященная двадцатилетию создания ИБФРМ РАН (ноябрь 2000, Саратов) — Международная научно-практическая конференция «Проблеми I пер-спективи очищения та повторного використання води» (листопад 2000, Харыав) — Научная конференция профессорско-преподавательского состава и аспирантов СГАУ им. Н. И. Вавилова по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2000 год (февраль 2001, Саратов).

Работа была частично поддержана грантами Президента РФ № 01−1 599 421 и CRDF REC-006.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 176 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 186 страницах машинописного текста, включающего 36 рисунков и 7 таблиц.

ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что респираторная активность микробных клеток, обладающих ферментативной системой подготовительного метаболизма пара-нитрофенола может быть использована для количественного определения нитроароматических фосфорорганических инсектицидов метафоса и сумитиона.

2. Оптимальными условиями культивирования микробных клеток Р. рии<�Ла БА-11 и Р. риИс1а С-11 для получения их максимальной респираторной активности по отношению к пара-нитрофенолу является их культивирование на мясо-пептонном агаре с последующим инкубированием в фосфатном буферном растворе с рН 7,45 (Р. риШа С-11) и 8,1 (Р. риМа БА-11) в течение 2 часов. Оптимимзированы условия проведения анализа специфической респираторной активности микробных клеток Р. риШа БА-11 и Р. риН<�Яа С-11 в отношении пара-нитрофенола.

3. Установлено, что клетки штаммов Р. риИс1а БА-11 и Р. риМа С-11 обладают конститутивной ферментативной системой подготовительного метаболизма пара-нитрофенола. Исследована селективность респираторного ответа клеток Р. риИс1а БА-11 и Р. риМа С-11, показано, что штамм Р. риШа БА-11 обладает наиболее высокой селективностью при определении пара-нитрофенола.

4. Изучена возможность иммобилизации микробных клеток Р. риШа С-11, Р. рийс1а БА-11 и А. сакоасейсит А-122. Показано, что метод иммобилизации путем включения клеток в гель агарагара является наиболее предпочтительным. Иммобилизованные микробные клетки длительно (48, 40 и 27 суток для штаммов Р. риШа С -11, Р. риШа БА-11 и А. сакоасеИсит А-122, соотвественно) сохраняют специфическую респираторную активность.

5. Показана возможность количественного определения инсектицидов метафоса и сумитиона, а также пара-нитрофенола с помощью респираторной активности свободных и иммобилизованных в гель агар-агара микробных.

169 клеток Р. риШа С-11, Р. риШа БА-11 и А. сакоасеИсит А-122. Линейный диапазон активности свободных и иммобилизованных в гель агар-агара клеток Р. риШа С-11 и Р. риМа БА-11 находится в диапазоне концентраций пара-нитрофенола — 0,5−2,5 мМметафоса — 0,5−3,0 мМ и сумитиона — 0,5−3,5 мМ для обоих штаммов. Для свободных и иммобилизованных в гель агар-агара клеток штамма, А сакоасеИсит А-122 линейный диапазон активности находится в интервале концентраций пара-нитрофенола 0,5−1,0 мМметафоса — 0,5−2,0 мМ, и сумитиона — 0,5−2,5 мМ.

6. Проведено сравнительное количественное определение содержания основного вещества в коммерческом препарате метафоса с помощью газожидкостной хроматографии и респираторной активности свободных и иммобилизованных в гель агар-агара микробных клеток штаммов Р. риНс1а С-11, Р. риНс1а БА-11 и А. сакоасейсит А-122. Концентрации метафоса, определенные с помощью респираторной активности клеток всех изучаемых штаммов были аналогичны результатам хроматографического анализа.

7. Показана возможность количественного определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона, а также и пара-нитрофенола в модельных водных объектах с помощью респираторной активности свободных и иммобилизованных в гель агар-агара микробных клеток штаммов Р. риШа С-11, Р. риИЛа БА-11 и А. сакоасейсит А-122.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Общепризнанно, что применение химических средств защиты растений позволяет сохранить значительную часть урожая и повысить качество получаемых сельскохозяйственных продуктов [Мельников, 1995]. Интенсивная химизация сельского хозяйства приводит к ежегодному поступлению в биосферу различных химических веществ, в том числе и пестицидов. Органические соединения фосфора являются одной из важнейших групп современных пестицидов [Мельников, 1995], к которым относятся такие инсектициды как метафос и сумитион. В связи с этим существует необходимость контроля этих веществ и продуктов их деградации в объектах окружающей среды. На фоне возрастающего антропогенного загрязнения окружающей среды пестицидами, биологические методы детекции и очистки природных объектов становятся весьма актуальными. Применяемые в настоящее время способы определения микроколичеств пестицидов основаны на различных физико-химических методах: спектрофотометрии, газожидкостной хроматографии, хроматографии в тонком слое и т. д. [Лурье, 1984] не в состоянии решить проблемы быстрой детекции, т.к. все они характеризуются сложностью исполнения, требуют большого количества расходуемых реактивов, дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала.

В последнее время возрастает интерес к биосенсорным аналитическим системам, выгодно отличающимся высокой чувствительностью и специфичностью, относительной дешевизной и простотой, высокой скоростью определения и возможностью осуществления анализа «ш situ». Биосенсоры сочетают в себе биологически чувствительный элемент (клетки, ферменты, ткани, антитела и др.) и физико-химический детектор биологического сигнала (электрохимический, оптический, колориметрический, акустический и др.). Наиболее широко распространены биосенсорные системы с электрохимическими детекторами (амперометрическими и потенциометрическими электродами) на основе ферментов и целых клеток.

Биосенсоры уже используются в медицине, ветеринарии, фармацевтической и биотехнологической промышленности. Активно разрабатываются и внедряются биосенсорные способы экологического контроля: для оценки общей токсичности стоков, качества пищевых продуктов и питьевой воды, определения отдельных токсичных соединений (фенолов, фосфорорганиче-ских соединений, нитратов, цианидов и многих др.). На данный момент существуют сенсорные методы анализа фосфорорганических инсектицидов, основанные на ингибировании ацетилхолинэстеразной активности. В тоже время сведений о работах по созданию микробных сенсорных систем для определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона на основе респираторной активности микробных клеток в литературе отсутствуют.

Известны бактериальные культуры, способные использовать ПНФ в качестве единственного источника углерода и энергии. Такая особенность микроорганизмов обусловлена наличием в клетках ферментов системы подготовительного метаболизма, способствующие утилизации ПНФ путем окислительных реакций. Известно сходство в химической структурной формуле метафоса, сумитиона и ПНФ. С большой вероятностью можно допустить, что в случае сходных по химической структуре субстратов механизм действия оксигеназ будет одним и тем же [Карасевич, 1992]. В связи с этим можно предположить, что пути метаболизма метафоса, сумитиона и ПНФ будут близки. Поэтому проводилось определение фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона с помощью респираторной активности микробных клеток, обладающих ферментами подготовительного метаболизма ПНФ. Путь деградации фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса, паратиона, сумитиона идет с образованием пара-нитрофенола. Описаны два пути биотрансформации пара-нитрофенола в бактериальной клетке. Первый — идет с образованием в качестве промежуточного продукта гидрохинона, в дальнейшем происходит расщепление ароматического кольца гидрохинона с образованием полуальдегида гидроксимуконовой кислоты, а также малеилацетиловой и кетоадипиновой.

157 кислот. Другой путь — трансформация пара-нитрофенола непосредственно в 4-нитропирокатехин, который в дальнейшем подвергается ферментативным превращениям с образованием оксигидрохинона.

С целью разработки микробной биосенсорной системы для определения метафоса, сумитиона и ПНФ в водной среде, нами использовались бактериальные культуры, обладающие ферментами, гидролизующими ПНФ и способные утилизировать последний в качестве единственного источника углерода и энергии: штаммов Pseudomonasputida C-l 1, Pseudomonasputida БА-11 и Acinetobacter calcoaceticum А-122.

Поскольку окислительные реакции у аэробных микроорганизмов проходят с участием молекулярного кислорода, в качестве детектора биологического сигнала нами решено было использовать чувствительный к кислороду электрод Кларка.

С помощью кислородного электрода определялась респираторная активность микробных клеток в буферном растворе и в растворе, содержащем определяемые соединения.

Разность значений респираторной активности клеток в присутствии исследуемого субстрата и без него, приведенная к массе использованных микробных клеток, обозначалась как специфическая респираторная активность (СРА) и выражалась в мкА / мин * мг сухого веса клеток. СРА микробных клеток использовалась нами для определения присутствия и установления концентрации метафоса, сумитиона и ПНФ в водных растворах.

Проводился подбор сред культивирования микробных клеток штаммов Р. putida С-11 и Р. putida БА-11 для получения их максимальной респираторной активности в отношении ПНФ. Было установлено, что клетки штаммов Р. putida С-11 и Р. putida БА-11 сохраняли респираторную активность по отношению к ПНФ при их выращивании на мясо-пептонном агаре без добавления ПНФ. С нашей точки зрения это свидетельствует, что клетки данных штаммов обладают конститутивной ферментативной системой подготовительного метаболизма ПНФ и для них нет необходимости предварительного культивирования на среде, содержащей ПНФ. Для проявления клетками.

158 штаммов P. putida С-И и P. putida БА-11 максимальной CPA в отношении ПНФ, их биомассу, выращенную на полноценной питательной среде (МПА), необходимо проинкубировать в фосфатном буфере с рН 7,45 (P. putida С-11) и 8,1 (P. putida БА-11) без добавления ПНФ в течение 2-х часов. При инкубации клеток в аналогичных условиях с добавлением ПНФ наблюдалось снижение активности, по-видимому, вследствии ингибирующего действия ПНФ на CPA клеток.

На следующем этапе исследований изучалось влияние различных факторов на проведение анализа респираторной активности микробных клеток в отношении ПНФ: концентрации клеток в измерительной ячейке, рН-среды, температуры анализа.

Первоначально для каждой бактериальной культуры была выявлена оптимальная концентрация клеток в ячейке. Она составила для клеток P. putida С-11 — 0,6−1,32 г сухого веса/лдля P. putida БА-11 — 0,4−1,2 г сухого веса/л. Использование большего количества биомассы было лимитировано ограниченным количеством кислорода в ячейке.

Изучение влияния рН на CPA клеток штамма P. putida С-11 показало, что они проявляют высокую активность в отношении ПНФ при рН 7,45 фосфатного буфера. Клетки штамма P. putida БА-11 проявляли максимальную респираторную активность в отношении ПНФ при рН 8,1.

Изучение влияния температуры на CPA клеток микроорганизмов в отношении изучаемого субстрата показало что, оптимальной температурой проведения анализа является 35 °C для обоих штаммов.

Используя оптимальные условия культивирования микробных клеток и условия анализа их респираторной активности, были построены зависимости респираторного ответа клеток от концентрации ПНФ. Зависимости CPA клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 имели линейный характер в диапазоне концентраций ПНФ 0,5−2,5 мМ для обоих штаммов. Минимальная определяемая концентрация ПНФ для штаммов P. putida С-11 и P. putida БА-11 составляет 0,1 мМ.

Далее нами изучалась селективность респираторного ответа микробных клеток. Было показано, что клетки P. putida С-11 обладают CPA в отношении гидрохинона, 2,4-динитрофенола, м-нитрофенола и ПНФ. CPA в отношении фенола, бензоамида и никотинамида клетки практически не обладали, вероятно из-за отсутствия ферментов подготовительного метаболизма данных соединений. Клетки штамма P. putida БА-11 проявляют активность в отношении м-нитрофенола и ПНФ, это свидетельствуют о том, что клетки штамма P. putida БА-11 могут быть использованы для селективного определения ПНФ и, возможно, мета-нитрофенола в смесях ароматических соединений. Тот факт, что клетки штамма P. putida С-11 реагируют на гидрохинон, а клетки штамма P. putida БА-11 такой активности не проявляют, вероятно, связано с тем, что подготовительный путь метаболизма ПНФ в микробных клетках штамма P. putida БА-11 осуществляется через образование 4-нитропирокатехина, а в микробных клетках P. putida С-11 — через образование гидрохинона с последующим разрывом ароматического кольца.

Изучение способов сохранения респираторной активности микробных клеток в отношении ПНФ показало, что оптимальными условиями для сохранения респираторной активности клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 явилось хранение при 4 °C.

Иммобилизация микробных клеток является необходимым этапом для создания биосенсорных систем, она позволяет создать высокую концентрацию клеток, предотвращает их вымывание из биореактора, защищает от высоких концентраций токсичных компонентов сточных вод. Существует значительное количество подходов для иммобилизации клеток, но наиболее часто используется — включение в гель и адсорбция на поверхности носителя. Для имобилизации методом включения клеток в гель использовались несколько традиционных носителей — полиакриламидный гель (ПААГ), крио-полиакриламидный гель (криоПААГ) и природный полисахарид агар-агар. Другие традиционные носители — каппа-каррагенан и альгинат кальция не применялись вследствие низкой механической прочности получаемого геля.

Для иммобилизации путем адсорбции использовался природный коммерческий носитель «лессорб» и хроматографическая бумага.

Ранее предпринимались попытки использовать респираторную активность свободных микроорганизмов штамма Acinetobacter calcoaceticum А-122 для количественного определения ПНФ [Ignatov et al.1999; Хоркина, 1998] и был определен индуцибельный характер синтеза ферментов подготовительного метаболизма ПНФ [Сингирцев, 1996].

Была исследована возможность создания биокатализатора на основе включенных в гель природного полисахарида агар-агар клеток Р. putida С-11, Р. putida БА-11 и А. calcoaceticum А-122. Такой выбор обусловлен отсутствием токсичности агар-агара для иммобилизованных клеток и простотой метода их иммобилизации. Было показано, что оптимальная концентрация клеток в гранулах геля для штамма Р. putida С-11 является 0,38−0,4 г сухого веса клеток/л объема биокатализатора, а для Р. putida БА-11 — 0,26−0,3 г сухого веса клеток/л объема биокатализатора, для клеток А. calcoaceticum А-122 — 0,40,45 г сухого веса клеток/л объема биокатализатора. При увеличении микробной нагрузки клеток в гранулах увеличивалось эндогенное дыхание, а, следовательно, было сложнее регистрировать СРА иммобилизованных клеток по отношению к ПНФ. Концентрационная зависимость СРА иммобилизованных в гель агар-агара клеток в отношении ПНФ сохраняла линейный характер, как и для свободных клеток, в интервале 0,5−2,5 мМ для Р. putida С-11 и Р. putida БА-11 и 0,5−1,0 мМ для А. calcoaceticum А-122. Активность клеток после иммобилизации несколько снижалась по сравнению со свободными, что объясняется, по-видимому, инактивацией части клеток при их иммобилизации, но диапазон линейной зависисимости СРА клеток по отношению к ПНФ соответствовал линейному диапазону свободных клеток.

Одним из широко используемых полимерных носителей является поли-акриламидный гель (ПААГ). Однако, включение клеток в ПААГ может сопровождаться быстрым отмиранием части популяции вследствии высокой токсичности компонентов геля и высокой температурой при полимеризации. При иммобилизации клеток Р. putida С-11, Р. putida БА-11 и А. calcoaceticum.

А-122 в ПААГ CPA по отношению к ПНФ и эндогенная респираторная активность практически отсутствовала. Вариантом ячеистых носителей являются полиакриламидные криогели, образующиеся при замораживании, когда в роли порообразователей выступают кристаллы льда. Включение клеток в криоПА-АГ по сравнению с ПААГ, увеличивает количество жизнеспособных клеток, поэтому было проведено исследование иммобилизации микробных клеток в криоПААГ. Нам удалось оптимизировать микробную нагрузку в гранулах криоПААГ для клеток P. putida БА-11, она составляет 3,7−3,9 г/л, однако, CPA клеток штамма P. putida С-11 и A. calcoaceticum А-122 в случае их иммобилизации в криоПААГ по отношению к ПНФ отсутствовала и оптимизация микробной нагрузки не проводилась. Тем не менее, в связи с тем, что CPA иммобилизованных клеток была низка построение калибровочной кривой не проводилось.

Адсорбционные методы иммобилизации относятся к числу наиболее простых и, как правило, слабо влияют на ферментативную систему клеток. В наших исследованиях проводилась иммобилизация клеток методом адсорбции на таких носителях, как «лессорб» и хроматографическая бумага.

Количество адсорбированных клеток рассчитывалась исходя из их эндогенного дыхания, которое прямо пропорционально количеству клеток, закрепившихся на носителе (т.е. строилась калибровочная кривая зависимости эндогенной респираторной активности клеток от их количества, которая использовалась для оценки количества клеток, адсорбированных на носителе).

Процедура иммобилизации на «лессорбе» состояла в смешивании при подходящих условиях клеток и носителя. Было установлено, что оптимальным временем иммобилизации для клеток всех штаммов является 30 мин. Оптимум рН среды составил 7,45 для клеток P. putida С-11, 8,1 для P. putida БА-11 и 6,8−7,6 для A. calcoaceticum А-122, что совпадает с оптимальными значениями анализа респираторной активности соответствующих величин для свободных клеток исследуемых штаммов. В экспериментах использовались образцы, содержащие 50 мг «лессорба». Оптимальная концентрация.

162 клеток в исходной суспензии составила 2,9−3,4 г/л P. putida С-11, 2,1−2,9 г/л P. putida Б А-11 и 1,1−1,5 г/л A. calcoaceticum А-122.

На следующем этапе наших исследовалась иммобилизация клеток на хроматографической бумаге. Расчет количества адсорбированных клеток с помощью эндогенного дыхания проводился аналогично, как и при иммобилизации клеток на «лессорбе». Оптимальная концентрация клеток была признана для штамма P. putida С-11- 2,7−3,4 г/л, для P. putida БА-11 -2,3−3,3 г/л и для A. calcoaceticum А-122 — 0,6−1,0 г/л.

Для клеток, иммобилизованных на «лессорбе» и хроматографической бумаге были построены калибровочные кривые CPA по отношению к ПНФ. При исследовании CPA иммобилизованных на «лессорбе» и хроматографической бумаге клеток изучаемых штаммов было показано, что линейный диапазон активности клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 сохранялся в пределе 0,5−2,5 мМ, и для клеток A. calcoaceticum А-122 — этот интервал составлял 0,5−1,0 мМ ПНФ, как и для свободных клеток. При иммобилизации клеток A. calcoaceticum А-122 на «лессорбе» диапазон определяемых концентраций ПНФ расширяется по сравнению со свободными клетками и находится в интервале 0,5−1,5 мМ.

Одной из важных задач при исследовании CPA иммобилизованных клеток в отношении исследуемых субстратов является определение условий хранения биокатализаторов. Было установлено, что максимально долго клетки всех штамов сохраняли CPA по отношению к ПНФ при их иммобилизации в гель агар-агара (P. putida С-11, P. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122 — 48, 40 и 27 суток соответственно при оптимальной температуре хранения +4°С). Необходимо отметить, в процессе хранения биокатализаторов линейный диапазон зависимости CPA клеток по отношению к ПНФ при всех использованных способах иммобилизации сохранялся в том же диапазоне, что и для свободных клеток соотвествующих штаммов.

Было показано, что воспроизводимость респираторного ответа клеток изучаемых штаммов по отношению к ПНФ достаточно полно проходила при иммобилизации путем включения в гель и адсорбции на инертных носителях.

Полученные данные показали, что включение клеток в агаровые гели позволяет длительное время сохранять активность по отношению к ПНФ для штамма P. putida С-11, P. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122 по сравнению с другими опробованными носителями. Однако, активность клеток A. calcoaceticum А-122 в отношении ПНФ исчезала быстрее, чем у других описанных штаммов, что, вероятно, связано с индуцибельным характером синтеза ферментов подготовительного метаболизма ПНФ данного штамма. Включение в гелевые носители, в нашем случае агар-агар, имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами иммобилизации, к которым относятся достаточно точный расчет активности клеток в отношении определяемого вещества и сохранение в течение длительного времени клеками своей CPA в отношении субстрата.

Поскольку активный центр фермента часто проявляет достаточно широкую специфичность по отношению к близким по структуре соединениям, мы предположили, что клетки данных штаммов могут быть использованы для определения ряда соединений, в состав которых входит нитроароматиче-ское кольцо [Мельников 1987]. К таким соединениям относятся нитроарома-тические фосфоорганиеские инсектициды, такие как метафос и сумитион. Исследовался респираторный отклик клеток всех штаммов по отношению к чистым препаратам инсектицидов метафоса и сумитиона (производства фирмы «Эколан» г. Москва). Был проведен дополнительный контроль чистоты препарататов метафоса и сумитиона с помощью газо-жидкостной хроматографии.

Построены концентрационные зависимости CPA клеток исследуемых штаммов в отношении метафоса и сумитиона. Из представленных данных показано, что зависимости CPA клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 имели линейный характер в диапазоне концентраций метафоса 0,5−3,0 мМ и сумитиона лежит в интервале 0,5−3,5 мМ для обоих штаммов. Концентрационная зависимость клеток A. calcoaceticum А-122 в отношении инсектицида метафоса имеет линейный характер в интервале 0,5−2,0 мМ, а для сумитиона линейный диапазон концентрациий находится в интервале 0,5−2,5 мМ. Мини.

164 мальная определяемая концентрация сумитиона составляет 0,01 мМ, метафо-са 0,05 мМ для клеток всех изучаемых штаммов. Полученные концентраци-оннае зависимости CPA клеток изучаемых штаммов могут быть использованы в качестве калибровочных кривых для определения изучаемых инсектицидов в водных средах. Сравнивая полученные данные зависимостей CPA клеток P. putida С-11, P. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122 в отношении чистых препаратов метафоса, сумитиона и ПНФ, видно, что линейные диапазоны концентрации зависимости CPA клеток по отношению к инсектицидам и ПНФ совпадали в диапазоне концентраций 0,5−2,5 мМ для клеток клеток Р. putida С-11 и P. putida БА-11 и в интервале 0,5−1,0 мМ для клеток клеток А. calcoaceticum А-122. Таким образом, увеличение диапазона определяемых концентраций метафоса по сравнению с ПНФ происходит приблизительно на 20% для клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 и приблизительно на 25% для A. calcoaceticum А-122- для сумитиона увеличение диапазона определяемых концентраций по сравнению с активностью клеток в отношении ПНФ происходит на приблизительно 40% .для клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 и приблизительно на 30% для A. calcoaceticum А-122. Такое увеличение диапазона определяемых концентраций, вероятно, связано с большим сродством данных субстратов (инсектицидов) к ферментативной системе подготовительного метаболизма ароматических соединений в бактериальной клетке. Из полученных данных можно отметить, что для анализа инсектицидов метафоса и сумитиона наиболее предпочтительными являются клетки штаммов Р. putida С-11 и P. putida БА-11 в связи с тем, что у них диапазон определяемых концентраций и величина респираторного отклика выше, чем у клеток A. calcoaceticum А-122.

В связи с тем, что для создания микробных биокатализаторов наиболее предпочтительным методом иммобилизации микробных клеток признан метод включения клеток в гель природного полисахарида агар-агара исследовался респираторный отклик этих биокатализаторов. Используя оптимальные для каждой бактериальной культуры условия получения биокатализатора с максимальной активностью в отношении ПНФ, проводили определение CPA.

165 иммобилизованных в гель агар-агара клеток при различных концентрациях метафоса и сумитиона. При определении CPA иммобилизованных в гель агар-агара клеток изучаемых штаммов было показано, что линейный диапазон активности клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 в отношении инсектицида метафоса сохранялся в пределе 0,5−3,0 мМ, а для клеток A. calcoaceticum А-122 этот интервал составлял 0,5−2,0 мМ, как и для свободных клеток. Линейный диапазон концентрационной зависимости CPA по отношению к су-митиону иммобилизованных в гель агар-агара клеток P. putida С-11 и Р. putida БА-11 находится в интервале концентраций 0,5−3,5 мМ, а для клеток A. calcoaceticum, А-122 — 0,5−2,5 мМ. Характер зависимости респираторной активности клеток по отношению к сумитиону сохраняется, как и для свободных клеток. Из сравнения зависимостей CPA иммобилизованных в гель агар-агара клеток P. putida С-11, P. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122 по отношению к исследуемым инсектицидам и ПНФ следует, что линейные диапазоны концентрации зависимостей CPA совпадали в том же диапазоне, что и для свободных клеток 0,5−2,5 мМ (P. putida С-11, P. putida БА-11) и 0,5−1,0 мМ (A. calcoaceticum А-122).

Нами был исследован коммерческий препарат инсектицида метафоса (производства Волгоградского химического комбината), в котором с помощью метода газо-жидкостной хроматографии предварительно была определена концентрация метафоса, которая состовляла 14 мМ/л. Одновременно исследовалась респираторная активность клеток P. putida С-11, P. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122 по отношению к данному препарату.

Содержание метафоса в образце рассчитывалась исходя из ранее полученной калибровочной кривой для чистого препарата метафоса и сравнивалась с данными, полученными с помощью газо-жидкостной хроматографии. Сопоставляя результаты активности клеток в отношении исследуемых субстратов, был сделан вывод, что CPA клеток в отношении технического и чистого препаратов метафоса практически совпадают. Затем было исследовано изменение респираторной активности иммобилизованных в гель агар-агара клеток P. putida С-11, P. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122 по отношению.

166 к техническому препарату метафоса. Данные количественного анализа содержания основного вещества в коммерческом препарате метафоса, полученные при помощи газохроматографического анализа и специфической респираторной активности клеток, были практически аналогичны. Результаты анализа с применением иммобилизованных клеток были идентичны свободным клеткам. Таким образом, показана возможность определения активного соединения в технической препарате метафоса с помощью CPA как свободных, так и иммобилизованных клеток P. putida С-11, P. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122. Сравнение определяемых концентраций метафоса в коммерческом препарате с помощью CPA клеток в отношении чистого препарата метафоса и с помощью газо-жидкостной хроматографии показало, что величины определяемых концентраций совпадают, это свидетельствует о точности проведенного нами анализа.

В результате циркуляции пестицидов в окружающей среде они присутствуют в атмосфере, почве, растениях и воде [Шевченко М.А., 1989]. Несмотря на низкую стабильность фосфорорганических пестицидов, время пребывания их в воде может оказаться вполне достаточным для поступления не-разложившихся препаратов в воду В связи с этим, нами определялась во-можность количественного определения инсектицидов метафоса и продуктов их гидролиза в речной воде. Пробы речной воды отбирались из реки Волги в районе Саратова. В предварительных исследованиях было показано, что активность клеток в отношении данной пробы отсутствовала. Нами были смоделированы образцы, содержащие коммерческий метафос, чистый препарат сумитиона и ПНФ и проведен их анализ по респираторной активности клеток. Определенные по изменению респираторной активности микробных клеток концентрации метафоса, сумитиона и ПНФ хорошо коррелировали с истинными значениями концентраций. В результате исследований показана возможность детектировать метафос, сумитион или ПНФ с помощью клеток изучаемых штаммов. То есть, в случае применения клеток штаммов P. putida С-11, P. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122 можно регистрировать токсические соединения, попадающие в окружающую среду при применении фосфо.

167 органических нитроароматических пестицидов и образующиеся при их деградации. Практически, на обрабатываемой территории, применяют, как правило, один вид фосфорорганического нитроароматического инсектицида, поскольку спектры их действия очень близки и поэтому нет необходимости идентификации этих соединения между собой. Селективность респираторного ответа клеток трех штаммов в отношении ряда ароматических соединений изучалась и представлена (Глава 5,6), [Хоркина, 1998], вследствие чего можно сделать вывод, что изучаемые нами клетки бактериальных штаммов Р. ри-ИсЬ С-11, Р. риМа БА-11 и А. сакоасейсит А-122 проявляют достаточно высокую активность только в отношении близких по химической структуре ароматическим соединениям, содержащим в своем составе нитрогруппу, к которым и относятся пара-нитрофенол, мета-нитрофенол, метафос, сумитион. Штамм Р. риИс1а БА-11 обладает наиболее высокой селективностью и может быть использован для количественного определения ПНФ и, возможно, мета-нитрофенола.

Таким образом, впервые была показана возможность определения ме-тафоса и сумитиона с помощью респираторной активности микробных клеток в модельных образцах. Показана возможность определения содержания метафоса в техническом препарате метафоса с помощью респираторной активности микробных клеток. Полученные данные подтверждены результатами газожидкостной хроматографии. Проведен количественный анализ модельных водных образцов, содержащих метафос, сумитион и ПНФ. Полученные нами результаты могут быть положены в основу разработки микробной биосенсорной системы для определения содержания метафоса, сумитиона и ПНФ в водных растворах. Такая биосенсорная система найдет применение в анализе содержания данных ксенобиотиков в водных средах.